本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种用于快速繁殖过表达vegf的血管内皮祖细胞的组合物。
背景技术：
由于创伤、感染、肿瘤等原因造成的各种类型骨缺损是临床上遇到的常见问题。近年来，骨组织工程技术的逐渐兴起为骨缺损的修复提供了有效的解决策略，早期研究证明，用组织工程骨修复小段骨缺损时，其早期成骨及后期骨愈合效果明显。但在应用大块组织工程骨修复大段骨缺损时，其核心部位往往发生缺血坏死，导致修复失败，其主要原因就在于未能很好的解决组织工程骨的血管化问题，血管化问题现已成为制约组织工程骨应用于临床的瓶颈。对各种促血管生长因子的研究是目前组织工程骨血管化研究的热点之一。
“血管发生”是新生血管形成的主要机制之一，其主要发生于胚胎期，通过内皮前体细胞分化成内皮细胞，在中胚层，内皮细胞分化、增殖、迁移、连接并形成原始毛细血管丛，此过程受血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)控制。vegf是强有力的血管直接诱导因子，是一类具有肝素结合性的二聚糖蛋白，具有诱导血管内皮细胞增殖、促进血管生成、增加毛细血管渗透性等作用，使血管内成分渗漏，为血管内皮细胞迁移及血管形成提供基质，同时抑制血管内皮细胞凋亡，诱导血管平滑肌细胞迁移，促进血管平滑肌细胞合成和分泌基质金属蛋白酶，并加速基质降解及炎症趋化等，最终促使新生毛细血管形成。vegf家族包括vegfa、b、c、d和胎盘形成因子，其中vegfa是研究较集中的因子，具有四种异构体，分别由121、165、189、206个氨基酸组成，其中vegf-165活性最强，分布范围广，是体内发挥作用的主要形式。然而重组vegf-165蛋白价格昂贵，在体内会很快被血液、组织液稀释，半衰期短，很难在局部达到持续的有效作用浓度，而且局部大量应用副作用严重，易导致局部血管瘤。
血管内皮祖细胞(endothelialprogenitorcell，epc)最早由asahara等于1997年报道，它是一群具有游走特性，尚未表达成熟血管内皮细胞表型，能分化为血管内皮细胞直接参与血管形成。它在骨髓、脐带血及外周血中均存在,并能在出生后的血管新生过程中有很强的促血管生成作用，并以血管发生方式形成新生血管。多数学者认为，cd34、cd133、flk-1三种细胞表面分子同时阳性的细胞才是epc，它能靶向于缺血或血栓部位，促进并参与新生血管的形成，在血管疾病、生物工程材料等诸多领域有广泛的研究应用前景。这一发现，更新了传统意义上的出生后血管生成、血管损伤修复的理论，也为解决组织工程骨血管化问题提供了新的思路。然而由于epc的细胞数量有限，获取困难，体外培养时需要扩增，培养周期长，且需要经fn介导贴壁生长才有利于其存活，这些不足限制了其在动物实验及临床研究中的应用。
近年来，随着基因工程技术的发展，基因治疗已成为广大学者研究的热点，转基因的组织工程技术为血管化提供了新的思路和方法。vegf基因修饰epc可弥补其数量不足的缺点，vegf基因转染可明显增强epc的新生血管特性，能大大优化epc的促血管新生效果。she等报道应用vegf-165基因转染的epc能明显促进缺血心肌中血管新生，从而明显改善大鼠急性心肌梗死后的心功能。易成刚等用人脐血中epc，利用vegf-165基因体外转染后移植于裸鼠随意皮瓣，可促进缺血皮瓣的血管新生，提高皮瓣的存活率，而转染vegf-165基因的epc具有更强大的促血管新生的作用。
在epc的培养过程中，培养基的选择十分重要，中国专利申请cn106754650a公开了目前的培养基主要有以下几种：
m199+10％fbs+vegf+bfgf+csf；
dmem+20％fbs+bfgf；
dmem-hg+10％fbs+vegf+bfgf；
dmem+csf+fgf+10％fbs；
1640培养基+bfgf+vegf+10％fbs；
egm2+5％fbs+hydrocortisone+ascorbicacid+egf+vegf+igf+fgf；
发明人在研究过程中发现，用上述培养基在一定程度上可以培养出满意浓度和数量的epc，但这种epc分泌的vegf浓度极低，在离开生长因子(vegf、bfgf等)环境后，内皮细胞特性很难保持；而当用vegf基因感染epc后，因epc可以分泌较高浓度的有功能的vegf蛋白，有助于保持epc细胞离开生长因子环境后的内皮细胞特性。
因此，上述培养基适合用来培养epc，但如果将它们直接用于培养过表达vegf的epc，这些培养基分别有各自的缺陷，例如基础培养基选择不合理、血清比例不合适、刺激因子的选择及加入的比例不恰当，这些缺陷导致细胞在被培养时状态差，获得细胞量少，传代次数低，复苏后细胞活率低等特定。因此，在科学研究及临床应用中，急需一种高效稳定的培养基来提高过表达vegf的epc的培养效率。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种用于快速繁殖过表达vegf的血管内皮祖细胞的组合物。应用该组合物可以稳定高效地扩增过表达vegf的血管内皮祖细胞，使细胞快速增殖，高表达vegf，且有助于保持血管内皮祖细胞的内皮细胞的特性。
本发明涉及一种用于快速繁殖过表达vegf的血管内皮祖细胞的组合物，所述组合物包括：内皮细胞基础培养基和添加成分。
优选地，所述的内皮细胞基础培养基为egm-2培养基、m199和dmem中的一种。
优选地，所述的添加成分包括：胎牛血清、成纤维生长因子、维生素c、表皮细胞生长因子、l-谷氨酰胺、全反式视黄酸和倍他米松。
进一步地，所述的添加成分包括：15％-25％胎牛血清、10-20ng/ml成纤维生长因子、1.5-4μg/ml维生素c、5-15ng/ml表皮细胞生长因子、1-5mml-谷氨酰胺、1-5μm全反式视黄酸和80-100ng/ml倍他米松。
在一些优选的实施方案中，所述的添加成分包括：20％胎牛血清、10ng/ml成纤维生长因子、2μg/ml维生素c、10ng/ml表皮细胞生长因子、5mml-谷氨酰胺、3μm全反式视黄酸和100ng/ml倍他米松。
在另一些优选的实施方案中，所述的添加成分还包括钼盐。
进一步地，所述的钼盐为四水合钼酸铵。
在一个优选的具体实施方案中，所述的四水合钼酸铵在培养基中的浓度为8μg/ml。
在另一个优选的具体实施方案中，所述的添加成分包括：20％胎牛血清、10ng/ml成纤维生长因子、2μg/ml维生素c、10ng/ml表皮细胞生长因子、5mml-谷氨酰胺、3μm全反式视黄酸、100ng/ml倍他米松和8μg/ml四水合钼酸铵。
本发明针对过表达vegf的血管内皮祖细胞的特性，研制出了适合该细胞快速繁殖的培养基组合物。该组合物成分清楚明确，配制简单，效果显著。
组合物中的全反式视黄酸对动物大脑和细胞的增殖分化有显著作用，被认为是一种营养素；倍他米松是一种糖皮质激素。经研究发现，针对过表达vegf的血管内皮祖细胞的特性，在培养基中同时使用全反式视黄酸和倍他米松可对该细胞的增殖有显著促进作用。另外，通过向培养基中加入微量元素钼，意料不到地可以进一步提高过表达vegf的血管内皮祖细胞的增殖速度和vegf的表达量。
综上所述，本发明具有如下优点。
(1)通过使用本发明的组合物培养过表达vegf的血管内皮祖细胞，可很好地保持被培养细胞的内皮细胞的特性；
(2)通过使用本发明的组合物培养过表达vegf的血管内皮祖细胞，细胞生长速度更快；
(3)通过使用本发明的组合物培养过表达vegf的血管内皮祖细胞，细胞可大量表达vegf。
附图说明
图1转染vegf后血管内皮祖细胞的细胞表面分子阳性率；
图2过表达vegf的血管内皮祖细胞增殖功能检测；
现结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1构建过表达vegf的血管内皮祖细胞
实验方法：
1)血管内皮祖细胞的分离、培养及鉴定：3-4周龄vistar大鼠，脱颈处死，酒精浸泡消毒，取长骨，剪开，冲洗骨髓，将细胞悬液加入大鼠淋巴细胞分离液表面，离心，取两层液体之间云雾状细胞，洗涤，加入egm-2mv培养液，co2细胞培养箱培养。取0，4，7，10天的贴壁细胞，进行标记cd34，flk-1，cd133，vwf的免疫组化检测，第14天的细胞进行投射电镜检查可见特异性的w-p小体。
2)pcdna3.0-hvegf165真核表达载体的构建：根据genebank的vegf165序列合成vegf165的cdna并在其5’端引入kpn-1酶切位点，在其3’端引入ecorv酶切位点(金斯瑞生物科技公司合成)，对pcdna3.0质粒和合成的vegf165片段进行kpn-1和ecorv双酶切，t4连接酶连接。将连接产物转化到dh-5α感受态细胞，氨苄青霉素平板筛选，挑单克隆进行酶切验证和测序，得到正确的pcdna3.0-hvegf165质粒克隆。
3)pcdna3.0-hvegf165转染血管内皮祖细胞：细胞生长到第十天消化细胞连接，5％fcs的ebm-2培养基配成1×105/ml细胞悬液按1ml/孔接种于已预铺盖玻片的24孔板。培养过夜细胞生长融合到50％-70％，按照脂质体lipofectamine的操作说明书，将脂质体2μl和pcdna3.0-hvegf165质粒2μl转染血管内皮祖细胞。
实施例2-4和对比例1-3
血管内皮祖细胞转染vegf165后，对于得到的过表达vegf的血管内皮祖细胞，实施例2-3和对比例1-3分别使用不同的培养基进行培养。培养基成分如下表所示，其中括号内的浓度表示该添加成分在培养基中的终浓度。
实施例5转染vegf后血管内皮祖细胞的flk-1和vwf的表达检测
转染后，使用24孔板和配套细胞爬片培养细胞，分别使用实施例2-4和对比例1-3的培养基培养细胞，取转染后1天、4天和7天的细胞爬片，pbs冲洗，丙酮固定后免疫细胞化学法检测flk-1和vwf的表达。检测结果见图1。
由图1可知，无论培养基中是否添加了vegf这一生长因子，过表达vegf的血管内皮祖细胞均能在一定程度上保持内皮细胞的特性；其中，使用实施例2-4的培养基，过表达vegf的血管内皮祖细胞的flk-1和vwf的表达量更高，说明使用实施例2-4的培养基更利于转染vegf的血管内皮祖细胞保持内皮细胞的特性。
实施例6过表达vegf的血管内皮祖细胞增殖功能检测
血管内皮祖细胞转染vegf165后，分别使用实施例2-4和对比例1-3的培养液扩增至p5/p6代细胞后，将过表达vegf的血管内皮祖细胞按1.0×104/孔的密度接种于标准24孔培养皿内，分别使用接种前所用的培养液进行培养。接种后1-8天每天取3孔细胞消化，进行细胞计数，进行血管内皮祖细胞增殖功能鉴定，步骤如下：
1)在无菌操作下吸尽孔内培养基，加入1mlpbs静置3min×2次(液体与皿底充分接触)；
2)弃pbs液后加入胰酶0.2ml摇匀；
3)镜下见细胞变圆、悬浮在液体中时可冲洗、吹打(将贴壁细胞冲至液体中)；
4)在光学显微镜下细胞计数，计数统计结果见图2。
由图2结果可知，与使用对比例1-3的培养基相比，通过使用实施例2-4的培养基，过表达vegf的血管内皮祖细胞生长速度更快，其中实施例4的培养基效果最佳。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。