本发明属于医药产品研究开发技术领域，具体涉及一种豆腐菜挥发油的提取纯化和检测方法及其应用。
背景技术：
豆腐菜(Premna microphylla Turcz)，属于马鞭草科、豆腐柴属植物，别名有臭黄荆、豆腐木、豆腐柴、豆腐叶、观音柴和凉粉柴，根、茎和叶入药，能清热解毒，消肿止血。主治毒蛇咬伤，无名肿毒，创伤出血等。其在我国分布广泛，主要分布于长江流域以南地区包括华东、中南、华南以至四川、贵州等地，适生于海拔1000m以下的山坡、林缘、疏林下、溪沟两侧的灌丛中及道路旁。
在现有研究报道中指出，豆腐菜叶和嫩枝中含有大量的果胶、蛋白质和维生素，而且其总糖和还原糖含量也较高，化学成分研究证明，豆腐菜主要含有黄酮及其苷类，有机酸，三萜类，蛋白质，氨基酸等成分，营养丰富。
挥发油(volatile oils)又称精油(essential oils)，是一类在常温下能挥发的、可随水蒸汽蒸馏的、与水不相混的油状液体的总称。大多数挥发油具有芳香气味。挥发油是一类重要的活性成分，临床上除直接应用主要含挥发油的生药外，还可应用从中精制的挥发油，如桉叶油、薄荷油等。挥发油具有发散解表、芳香开窍、理气止痛、祛风除湿、活血化瘀、祛寒温里、清热解毒、解暑祛秽、杀虫抗菌等作用，如薄荷油用驱风健胃，当归油镇痛，柴胡油退热，土荆芥油驱肠虫等，此外挥发油还广泛应用于香料、食品与化妆品等的生产。
因此为进一步拓展豆腐菜应用领域，有必要对豆腐菜挥发油进行研究。然而现有技术中尚未有关于豆腐菜挥发油的报道。
技术实现要素：
针对上述现有技术，本发明提供一种豆腐菜挥发油的分离提取方法及豆腐菜挥发油的应用，所述提取纯化方法工艺简单，成本低，获得的挥发油含水率低，具有良好的抗氧化、抑菌和抗癌活性。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种豆腐菜挥发油的提取纯化方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜豆腐菜洗净晾干后粉粹至粒径为50-100目，加入蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，得含挥发油水系；
(2)向含挥发油水系中加入有机溶剂进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的有机溶剂中加入脱水干燥剂脱水，过滤回收有机溶剂即得到干燥纯净的挥发油。
进一步的，所述洗净晾干后的豆腐菜与蒸馏水的质量比为1：1～3，进一步优选为1:2；所述豆腐菜粉粹粒径优选为60目；发明人在实验研究中发现，粉粹颗粒较大，会使水蒸汽从原料间隙流出，从而使得提取率降低，且浪费资源；而粉粹粒径过小，则使得水蒸汽无法均匀透过原料，导致蒸汽从冲开的原料中逸出，同样导致提取率不高；
进一步的，所述水蒸汽蒸馏提取时间为5-6h；适宜的提取时间能够保证尽可能由豆腐菜中提取出挥发油组分，同时也避免提取时间过长造成的资源浪费；
进一步的，所述有机溶剂选自乙酸乙酯、丙烯酸乙酯、甲苯、乙醚、氯仿中的一种或几种，优选为乙醚；申请人发现，乙醚对豆腐菜挥发油组分萃取效果最佳，相较于其他的有机溶剂具有更好的提取率；
进一步的，所述脱水干燥剂选自无水硫酸钠或无水硫酸钙，优选为无水硫酸钠；
所述豆腐菜挥发油的提取纯化方法，最优工艺为：
(1)取新鲜豆腐菜洗净晾干后粉粹至粒径为60目，加入蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，蒸馏提取时间为5h，得含挥发油水系；其中，所述洗净晾干后的豆腐菜与蒸馏水的质量比为1：2；
(2)向含挥发油水系中加入乙醚进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的乙醚溶液中加入无水硫酸钠脱水，过滤回收乙醚即得到干燥纯净的挥发油。
本发明还公开了由上述提取纯化方法制备得到的豆腐菜挥发油。
此外，本发明提供一种由上述提取纯化方法制备得到的豆腐菜挥发油的检测方法，所述方法包括采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析检测，检测条件为：HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：氦气；流速：1.2mL/min，溶剂延迟4min；升温程序：初始温度为60℃，保持1min，以15℃/min升温到200℃，保持5min，再以5℃/min升到280℃，保持2min。离子化方式：EI，70eV；离子源温度：250℃；载气：氦气；柱流速：1.2mL/min。
其中，所述豆腐菜挥发油化学成分包括布卢姆醇C、柏木烯、蒈烯、α-愈创烯、隐品酮和异长叶醇。
本发明还公开了上述豆腐菜挥发油的应用，所述豆腐菜挥发油作为抗氧化剂应用于食品、药品、化妆品或保健品；
本发明还公开了上述豆腐菜挥发油的应用，所述豆腐菜挥发油作为抑菌剂应用于食品、药品、化妆品或保健品；进一步的，所述豆腐菜挥发油作为金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的抑菌剂。
最后，本发明公开了上述豆腐菜挥发油的应用，所述豆腐菜挥发油作为抗癌细胞剂应用于食品、药品或保健品；进一步的，所述豆腐菜挥发油作为HepG2(人肝癌细胞)和MCF-7(人乳腺癌细胞)的抗癌细胞剂。
本发明的有益效果：本发明首次采用水蒸气蒸馏和有机萃取技术提取纯化得到豆腐菜挥发油，提取纯化方法工艺简单，成本低，制备工艺中的蒸馏水和有机溶剂能够重复利用，经本发明制备工艺获得的挥发油含水率低，同时经试验验证具有良好的抗氧化、抑菌和抗癌活性，对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌均有良好的抑菌作用，对HepG2(人肝癌细胞)和MCF-7(人乳腺癌细胞)具有良好的抗癌抑癌效果，适合工业化生产应用。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中豆腐菜营养丰富，因此为进一步拓展豆腐菜应用领域，有必要对豆腐菜挥发油进行研究，然而现有技术中尚未有关于豆腐菜挥发油的报道。
本申请的一种典型的实施方式中，提供一种豆腐菜挥发油的提取纯化方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜豆腐菜洗净晾干后粉粹至粒径为50-100目，加入蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，得含挥发油水系；
(2)向含挥发油水系中加入有机溶剂进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的有机溶剂中加入脱水干燥剂脱水，过滤回收有机溶剂即得到干燥纯净的挥发油。
其中，所述洗净晾干后的豆腐菜与蒸馏水的质量比为1：1～3，进一步优选为1:2；所述豆腐菜粉粹粒径优选为60目；发明人在实验研究中发现，粉粹颗粒较大，会使水蒸汽从原料间隙流出，从而使得提取率降低，且浪费资源；而粉粹粒径过小，则使得水蒸汽无法均匀透过原料，导致蒸汽从冲开的原料中逸出，同样导致提取率不高；
所述水蒸汽蒸馏提取时间为5-6h；适宜的提取时间能够保证尽可能由豆腐菜中提取出挥发油组分，同时也避免提取时间过长造成的资源浪费；
所述有机溶剂选自乙酸乙酯、丙烯酸乙酯、甲苯、乙醚、氯仿中的一种或几种，优选为乙醚；申请人发现，乙醚对豆腐菜挥发油组分萃取效果最佳，相较于其他的有机溶剂具有更好的提取率；
所述脱水干燥剂选自无水硫酸钠或无水硫酸钙，优选为无水硫酸钠；
本发明的另一典型实施方式中，提供一种豆腐菜挥发油的提取纯化方法，包括：
(1)取新鲜豆腐菜洗净晾干后粉粹至粒径为60目，加入蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，蒸馏提取时间为5h，得含挥发油水系；其中，所述洗净晾干后的豆腐菜与蒸馏水的质量比为1：2；
(2)向含挥发油水系中加入乙醚进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的乙醚溶液中加入无水硫酸钠脱水，过滤回收乙醚即得到干燥纯净的挥发油。
本发明的又一典型实施方式中，提供一种由上述提取纯化方法制备得到的豆腐菜挥发油的检测方法，所述方法包括采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析检测，检测条件为：HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：氦气；流速：1.2mL/min，溶剂延迟4min；升温程序：初始温度为60℃，保持1min，以15℃/min升温到200℃，保持5min，再以5℃/min升到280℃，保持2min。离子化方式：EI，70eV；离子源温度：250℃；载气：氦气；柱流速：1.2mL/min。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
实施例1 豆腐菜挥发油的提取纯化方法
(1)取500g新鲜豆腐菜洗净晾干后粉粹至粒径为60目，加入1000g蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，蒸馏提取时间为5h，得含挥发油水系；
(2)向含挥发油水系中加入乙醚进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的乙醚溶液中加入无水硫酸钠脱水，过滤回收乙醚即得到干燥纯净的挥发油。
实施例2 豆腐菜挥发油的检测方法
采用GC-MS对实施例1得到的豆腐菜挥发油进行检测，具体检测条件如下：HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：氦气；流速：1.2mL/min，溶剂延迟4min；升温程序：初始温度为60℃，保持1min，以15℃/min升温到200℃，保持5min，再以5℃/min升到280℃，保持2min。离子化方式：EI，70eV；离子源温度：250℃；载气：氦气；柱流速：1.2mL/min。共检测出豆腐菜挥发油中化学成分49种，具体化学成分及相对含量见表1。
表1 豆腐菜挥发油化学成分
实施例3 豆腐菜挥发油的抗氧化作用试验
1 DPPH测试液的配制0.08mmol/L DPPH溶液的配制：精密称取DPPH8.0mg，用无水乙醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.004％的DPPH溶液，避光保存，备用。
2实验步骤：分别取不同浓度的各样品溶液(0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml)1.0ml，放入10ml离心管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。按下列公式计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率(％)＝A0-(As-Ac)/A0×100％公式中，A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值As—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值Ac—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值将实验重复三次，求得清除率的平均值。
用DPPH基础方案确定精油的抗氧化活性。通过分光光度计在517nm测量精油的自由基清除活性。在测定之前立即制备DPPH的甲醇溶液。将各种浓度的各2mL样品(0.100,0.150,0.200,0.250,0.300,0.350,0.400,0.450,0.500mg/mL)加入到2mL DPPH溶液中。将反应混合物振摇，并在阴凉处静置30分钟。通过分光光度计在517nm测量样品的吸光度。在该测定中，丁基化羟基甲苯(BHT)用作标准抗氧化剂以验证测定。实验重复三次。
实验结果以DPPH自由基清除率表示，见表2。
表2 豆腐菜挥发油的抗氧化作用
由表2可以看出，豆腐菜挥发油对自由基有良好的清除作用。
通过具体实施实例说明豆腐菜挥发油可作为天然抗氧化剂用于食品、药品保健品或化妆品行业，代替有毒副作用的合成抗氧化剂。
实施例4 豆腐菜挥发油的抑菌作用
1试验菌种和培养基
试验菌种：选择四种细菌菌株用于抑菌试验，包括革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(ATCC6538)，枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)和革兰氏阴性菌：大肠杆菌(ATCC 25922)，绿脓杆菌(ATCC 27853)。
试验用培养基：细菌MHB(Mueller Hinton Broth)培养基。
2试验方法
(1)灭菌：
将实验所需要的培养基、试管、枪头、蒸馏水等在121℃湿热灭菌20min，灭完菌将其放置超净工作台紫外灭菌30min。
(2)菌悬液的配制：
从经过活化的菌体斜面上挑取一环菌体接种于相应的MHB培养基中，放入恒温摇床中37℃条件下隔夜培养。分别吸取以上培养好的处于对数生长期的供试菌液0.5mL，用MH肉汤稀释成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。再用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后，得到1-2×106CFU/ml备用。
(3)MIC的测定：
吸取稀释好的菌液加于96孔细胞培养板中，每孔100μL，并加入已配置好的不同浓度的药物100μL。倒数第二孔不加药物(仅加培养基和细菌)加入稀释菌液100μL，为细菌生长对照孔。最后一列为阳性对照氯霉素。置于振荡器上振荡1min，使孔内溶液充分混匀后，将96孔板振荡摇匀后置于37℃恒温培养箱中培养16-18小时后，向每孔中加入用无菌水配置的1％TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)溶液20μL，振荡摇匀于37℃恒温培养箱中培养30到60分钟，观察每孔颜色变化。取未呈现颜色变化的最后一孔所含挥发油浓度为其最低抑菌浓度MIC。
重复所有MIC值的测量一式三份。
3实验结果
抑菌效果用最小抑菌浓度MIC表示，测量结果见表3。
表3 豆腐菜挥发油抑菌活性
由表3可以看出，豆腐菜挥发油对4种供试菌都有一定的抑制作用，其对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.270mg/mL，对枯草杆菌的最低抑菌浓度为0.270mg/mL，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.150mg/mL，对绿脓杆菌的最低抑菌浓度为0.370mg/mL。
通过具体实施实例说明豆腐菜挥发油可作为天然抗菌剂用于食品、药品保健品或化妆品行业，代替有毒副作用的合成抗菌剂。
实施例5 豆腐菜挥发油的细胞毒性
1细胞培养
HepG2(人肝癌细胞)和MCF-7(人乳腺癌细胞)细胞株用含10％新生牛血清以及青霉素、链霉素各100U/mL的RPMI1640培养基置于37℃、饱和湿度、5％CO2的培养箱中培养。
2 MTT法检测细胞活力
取对数生长期的肿瘤细胞悬浮于含10％胎牛血清以及2mM谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中，用玻璃吸管轻轻吹打成单细胞悬液，用TC10自动细胞计数仪计数。将细胞接种于96孔培养板，细胞密度为5×103个/mL，每孔200μL。在37℃、5％CO2的培养箱预培养24h使细胞粘附后，加入预先配制的浓度分别为0.016、0.031、0.063、0.125、0.250、0.500、1和2mg/mL的挥发油溶液对肿瘤细胞进行处理。并设阴性对照及空白对照。再分别连续培养24h、48h、72h，然后用MTT法测定。每孔加入10μL 5mg/mL的MTT溶液，继续培养2h后，吸去上清液。每孔加入100μL DMSO，置微量振荡器振荡10min使结晶完全溶解，于Multiskan Ascent酶标仪在波长570nm下测定吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率，该测定一式三份。细胞增殖抑制率如下计算。
细胞增殖抑制率/％＝[1-OD处理组/OD对照]×100％
3实验结果
细胞毒性以抑制50％细胞生长时所需样品浓度即(IC50值)表示，测量结果见表4、表5。
表4 豆腐菜挥发油对HepG2细胞毒活性
表5 豆腐菜挥发油对MCF-7细胞毒活性
由表4-5可以看出，豆腐菜挥发油对HepG2、MCF-7两种细胞都有一定的抑制作用，其对HepG2 48小时IC50为0.315mg/mL，48小时IC50为0.072mg/mL；对MCF-7 48小时IC50为0.751mg/mL，48小时IC50为0.188mg/mL。
通过具体实施实例说明豆腐菜挥发油可作为天然抗癌细胞剂用于食品、药品或保健品行业。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。