本发明涉及分子生物学
技术领域：
，更具体地，涉及用于DNA
技术领域：
，特别是指一种快速检测外周血游离核酸完整度的试剂、试剂盒与其应用。
背景技术：
：随着精准医学概念的提出，精准医学已经逐渐被人群接受，肿瘤便是精准医学首要解决任务之一。说起肿瘤、癌症，虽然已经不再像多年前一样让人谈癌色变，但仍旧为人们所恐惧。成功治疗肿瘤还是以早发现早治疗为主，那么尽早检测和发现肿瘤便是首当其冲的核心。液体活检(Liquidbiopsy)的检测方法，可以捕获到进入血液的其它细胞的DNA，从而替代了疾病的诊断，例如肿瘤。cfDNA是指外周血中游离的DNA片段，已有研究证实，肿瘤患者外周血中的cfDNA总量，要高于健康人。通过这一点，虽然不能武断的说cfDNA能成为肿瘤标志物，但是cfDNA的含量增多，能起到一个较好的提示作用，作为一个初筛的手段。基于cfDNA的液态活检中，尽管ctDNA在肿瘤诊疗中的应用是当下cfDNA最广泛，研究最深入的分支。但是，cfDNA作为液态活检，不只是局限于肿瘤学。例如，有研究报道对于接受器官移植手术的病人，可以通过监测术后外周血中具有捐献者基因特征，片段化的cfDNA含量变化，来评估移植器官的排斥情况。在无创产前基因检测中，采集孕妇外周血(5ml)，提取游离DNA，采用新一代高通量测序技术，结合生物信息分析，得出胎儿是否存在基因异常情况，如患染色体非整倍体(21-三体又称唐氏综合征，18-三体，13-三体)的风险。由于cfDNA在外周血中含量低，而且在cfDNA提取过程中又极有可能损失部分核酸片段，因此更加会导致在下游的检测结果不准确。但是科研人员往往只能通过分析下游测序得到的序列，才能检测cfDNA的完整度，这极大影响了医疗诊断的时效性，也极大增高了成本。因而，如何能在进行高通量测序前检测cfDNA的完整度，成为目前业界研究人员需要尽快解决的问题。技术实现要素：本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种快速检测外周血游离核酸完整度的试剂、试剂盒与其应用，以克服现有技术中的不足。为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：本发明实施例提供了一种快速检测外周血游离核酸完整度的试剂，其包含第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂中的至少一者；所述第一试剂包括具有SEQIDNO：1所示序列的第一引物和具有SEQIDNO：2所示序列的第二引物；所述第二试剂包括具有SEQIDNO：3所示序列的第三引物和具有SEQIDNO：4所示序列的第四引物；所述第三试剂包括具有SEQIDNO：5所示序列的第五引物和具有SEQIDNO：6所示序列的第六引物；所述第四试剂包括具有SEQIDNO：7所示序列的第七引物和具有SEQIDNO：8所示序列的第八引物。在一些较为具体的实施方案中，所述快速检测外周血游离核酸完整度的试剂包括第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂。在一些较为具体的实施方案中，所述第一试剂包括浓度为2uM～20uM的第一引物、浓度为2uM～20uM的第二引物，其余部分包含超纯水。优选的，所述第二试剂包括浓度为2uM～20uM的第三引物、浓度为2uM～20uM的第四引物，其余部分包含超纯水。优选的，所述第三试剂包括浓度为2uM～20uM的第五引物、浓度为2uM～20uM的第六引物，其余部分包含超纯水。优选的，所述第四试剂包括浓度为2uM～20uM的第七引物、浓度为2uM～20uM的第八引物，其余部分包含超纯水。本发明实施例还提供了一种快速检测外周血游离核酸完整度的试剂盒，其包括前述快速检测外周血游离核酸完整度的试剂。在一些较为具体的实施方案中，所述试剂盒还包括PCR扩增检测的常规组件，所述PCR扩增检测的常规组件包括TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合物和超纯水。本发明实施例还提供了一种外周血游离核酸完整度的快速检测方法，其包括：提供前述快速检测外周血游离核酸完整度的试剂或试剂盒；将待检测的外周血游离核酸样品，第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂中的至少一者以及PCR扩增检测的常规组件混合均匀，之后进行PCR扩增。在一些较为具体的实施方案中，所述PCR扩增的条件包括：预扩增，包括：在90℃～100℃温度条件下反应1min～5min，优选的，在95℃温度条件下反应3min；PCR循环，包括：首先进行30～60个循环，每个循环包括：依次在90℃～100℃下保温10s～50s，55℃～72℃下保温10s～50s，65℃～85℃下保温10s～50s；其后，依次在90℃～100℃下保温10s～50s，55℃～72℃下保温10s～50s，90℃～100℃下保温10s～50s，4℃保存。进一步的，所述PCR循环包括：首先进行40个循环，每个循环包括：依次在95℃下保温30s，60℃下保温30s，72℃下保温10s；其后，依次在95℃下保温15s，65℃下保温15s，95℃下保温15s，4℃保存。优选的，在所述PCR循环中，于60℃下保温30s步骤和65℃下保温15s步骤中分别设置荧光数据采集。与现有技术相比，本发明的优点包括：(1)本发明提供的快速检测外周血游离核酸完整度的试剂及试剂盒，能够有效的检测外周血游离核酸完整度，大大减少因外周血游离核酸完整度不够而导致的下游检测结果无效的风险，为外周血游离核酸的下游分子生物学分析打下坚实基础；且该试剂的稳定性高，所用原料简单易得，价格低廉，制备简单，难度低，无需专门技术培训及特殊仪器设备，有利于推广应用；在应用于DNA完整度检测时，操作方便，检测度较高。(3)本发明提供的外周血游离核酸完整度的快速检测方法，通过设计4对特异性引物序列对外周血游离核酸中的特定区域进行定量分析，再通过统计学计算对外周血游离核酸完整度进行检测评估，可有效的检测外周血游离核酸完整度。附图说明图1是本发明实施例1-4中不同平台下对3份样本进行外周血游离核酸完整度检测的结果对比示意图。具体实施方式下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。在对实例描述前，有必要提供一些备注说明：采用不同厂家、不同批次的试剂会造成实验结果的差异，属于正常现象。在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议配置试剂后，充分混匀并分装，以保证每次实验试剂的均一性。本发明实施例提供了一种快速检测外周血游离核酸完整度的试剂，其包含第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂中的至少一者。其中，所述第一试剂包括具有SEQIDNO：1所示序列的第一引物(oligo1)和具有SEQIDNO：2所示序列的第二引物(oligo2)；所述第二试剂包括具有SEQIDNO：3所示序列的第三引物(oligo3)和具有SEQIDNO：4所示序列的第四引物(oligo4)；所述第三试剂包括具有SEQIDNO：5所示序列的第五引物(oligo5)和具有SEQIDNO：6所示序列的第六引物(oligo6)；所述第四试剂包括具有SEQIDNO：7所示序列的第七引物(oligo7)和具有SEQIDNO：8所示序列的第八引物(oligo8)。在一些较为具体的实施方案中，所述快速检测外周血游离核酸完整度的试剂包括第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂。在一些较为具体的实施方案中，所述第一试剂的溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo12uM～20uM，Oligo22uM～20uM。更优选的，所述第一试剂的溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo110uM，Oligo210uM。在一些实施方案之中，所述第二试剂的溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo32uM～20uM，Oligo42uM～20uM。更优选的，所述第二试剂的溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo310uM，Oligo410uM。在一些实施方案之中，所述第三试剂的溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo52uM～20uM，Oligo62uM～20uM。更优选的，所述第三试剂的溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo510uM，Oligo610uM。在一些实施方案之中，所述第四试剂的溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo72uM～20uM，Oligo82uM～20uM。更优选的，所述第四试剂的溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo710uM，Oligo810uM。本发明实施例还提供了一种快速检测外周血游离核酸完整度的试剂盒，其包括前述快速检测外周血游离核酸完整度的试剂。在一些较为具体的实施方案中，所述试剂盒还包括PCR扩增检测的常规组件，所述PCR扩增检测的常规组件包括TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合物和超纯水。其中具体的，所述第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂的用量为0.2uL～2uL，PCR扩增检测的常规组件的用量为5uL～10uL，超纯水为0.2uL～5uL。其中更为具体的，所述第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂的用量为0.9uL，PCR扩增检测的常规组件的用量为7.5uL，超纯水为1.6uL。本发明实施例还提供了一种外周血游离核酸完整度的快速检测方法，其包括：提供前述快速检测外周血游离核酸完整度的试剂或试剂盒；将待检测的外周血游离核酸样品，第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂中的至少一者以及PCR扩增检测的常规组件混合均匀，之后进行PCR扩增。其中，所述待检测的外周血游离核酸样品的用量优选为0.2ng～5ng，更优选为0.5ng。在进行检测之前，先将待检测的外周血游离核酸样品取出融化，融化温度优选为0℃～8℃，更优选为4℃。在一些实施方案之中，本发明的完整度检测实验反应需设置NTC样本，优选的，所述NTC样本为超纯水。在一些较为具体的实施方案中，所述PCR扩增的条件包括：预扩增，包括：在90℃～100℃温度条件下反应1min～5min，优选的，在95℃温度条件下反应3min；PCR循环，包括：首先进行30～60个循环，每个循环包括：依次在90℃～100℃下保温10s～50s，55℃～72℃下保温10s～50s，65℃～85℃下保温10s～50s；其后，溶解曲线为：依次在90℃～100℃下保温10s～50s，55℃～72℃下保温10s～50s，90℃～100℃下保温10s～50s，4℃保存。进一步的，所述PCR循环包括：首先进行40个循环，每个循环包括：依次在95℃下保温30s，60℃下保温30s，72℃下保温10s；其后，溶解曲线为：依次在95℃下保温15s，65℃下保温15s，95℃下保温15s，4℃保存。优选的，在所述PCR循环中，于循环体系中60℃下保温30s步骤和溶解曲线中65℃下保温15s步骤中分别设置荧光数据采集。所述外周血游离核酸完整度的快速检测方法还包括对最后得到的结果数据进行分析。其中，结果数据分析使用以下算法：分别记录第一试剂，第二试剂，第三试剂，第四试剂体系中仪器上所读取的Cq值(有些机器命名为Ct值)，取该数值0.2～5为底数的指数幂，判断指数幂的正确范围，并评判基因检出率，最后通过基因检出率判断完整度。具体的，所述结果数据分析使用以下算法：分别记录待测样本使用第一试剂，第二试剂，第三试剂，第四试剂体系中仪器上所读取的Cq值(有些机器命名为Ct值)和NTC样本使用第一试剂，第二试剂，第三试剂，第四试剂体系中仪器上所读取的Cq值(有些机器命名为Ct值)，使用NTC样本的Cq值减去待测样本的Cq值，取该差值2为底数的指数幂，第一，第二，第三，第四分别对应4个基因，判断指数幂大于20视为该基因检出，将基因检出的个数除以4计算基因检出率，基因检出率大于50％，视为完整度合格。以下结合附图和若干实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明。实施例11.试剂准备：KAPASYBRFASTqPCRMasterMix(2×)；试剂A：溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo110uM，Oligo210uM；试剂B：溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo310uM，Oligo410uM；试剂C：溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo510uM，Oligo610uM；试剂D：溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo710uM，Oligo810uM。2.检测用仪器：EcoqPCR仪(Illumina)。3.实验操作过程：(1)将3个待测样本分别取0.5ng，每个待测样本做3个重复，N＝待测样本数×3；(2)取4个1.5mlEP管，每个EP管上分别对应下表中的试剂A/试剂B/试剂C/试剂D；(3)混合液准备：(4)反应体系：(5)向48孔板中每孔加入15μlQPCR反应液；超纯水为NTC样本；(6)加完试剂后使用密封薄膜对板进行正确密封，使用密封膜刮板将膜牢牢地压在板表面；(7)将样本板放入板式离心机，1000×g，离心5min；(8)离心完成后将48孔板放进Eco系统中，盖上仪器盖子，设置反应条件如下：设置完成后，点击startrun开始按钮，并保存实验文件qPCR，并根据记录试剂A，试剂B，试剂C，试剂D体系中仪器上所读取的Cq值(3个重复取平均)，将NTC样本的Cq值减去待测样本的Cq值，取该差值2为底数的指数幂，A、B、C、D分别对应4个基因，判断指数幂大于20视为该基因检出，将基因检出的个数除以4计算基因检出率，基因检出率大于50％，视为完整度合格。4.实验结果见下表：样本CqACqBCqCCqD2△CqA2△CqB2△CqC2△CqD检出128.2326.5526.7830.1039.67128.8945.2517.3975％230.1131.2225.7832.3310.785.0690.513.7125％325.6826.8923.8828.81232.32101.83337.7942.5275％NTC33.5433.5632.2834.221.001.001.001.005.实验结论：样本1完整度合格，样本2完整度不合格，样本3完整度合格。实施例21.试剂准备：KAPASYBRFASTqPCRMasterMix(2×)；试剂A：溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo110uM，Oligo210uM；试剂B：溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo310uM，Oligo410uM；试剂C：溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo510uM，Oligo610uM；试剂D：溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo710uM，Oligo810uM。2.检测用仪器：StepOnePlus(ABI)。3.实验操作过程：(1)将3个待测样本分别取0.5ng，每个待测样本做3个重复，N＝待测样本数×3；(2)取4个1.5mlEP管，每个EP管上分别对应下表中的试剂A/试剂B/试剂C/试剂D；(3)混合液准备：(4)反应体系：(5)向96孔板中每孔加入15μlQPCR反应液；超纯水为NTC样本；(6)加完试剂后使用密封薄膜对板进行正确密封，使用密封膜刮板将膜牢牢地压在板表面；(7)将样本板放入板式离心机，1000×g，离心5min；(8)离心完成后将96孔板放进StepOnePlus中，盖上仪器盖子，设置反应条件如下：设置完成后，点击startrun开始按钮，并保存实验文件qPCR，并根据记录试剂A，试剂B，试剂C，试剂D体系中仪器上所读取的Cq值(3个重复取平均)，将NTC样本的Cq值减去待测样本的Cq值，取该差值2为底数的指数幂，A、B、C、D分别对应4个基因，判断指数幂大于20视为该基因检出，将基因检出的个数除以4计算基因检出率，基因检出率大于50％，视为完整度合格。4.实验结果见下表：样本CqACqBCqCCqD2△CqA2△CqB2△CqC2△CqD检出128.9026.8627.4630.6433.46103.8128.3411.9475％230.5531.6326.1332.3310.623.8270.823.7025％325.7427.5624.6029.45298.8864.15204.7227.2275％NTC33.9634.0633.1334.421.001.001.001.005.实验结论：样本1完整度合格，样本2完整度不合格，样本3完整度合格。实施例31.试剂准备：KAPASYBRFASTqPCRMasterMix(2×)；试剂A：溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo110uM，Oligo210uM；试剂B：溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo310uM，Oligo410uM；试剂C：溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo510uM，Oligo610uM；试剂D：溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo710uM，Oligo810uM。2.检测用仪器：ABI7500(ABI)。3.实验操作过程：(1)将3个待测样本分别取0.5ng，每个待测样本做3个重复，N＝待测样本数×3；(2)取4个1.5mlEP管，每个EP管上分别对应下表中的试剂A/试剂B/试剂C/试剂D；(3)混合液准备：(4)反应体系：(5)向96孔板中每孔加入15μlQPCR反应液；超纯水为NTC样本；(6)加完试剂后使用密封薄膜对板进行正确密封，使用密封膜刮板将膜牢牢地压在板表面；(7)将样本板放入板式离心机，1000×g，离心5min；(8)离心完成后将96孔板放进ABI7500中，盖上仪器盖子，设置反应条件如下：设置完成后，点击startrun开始按钮，并保存实验文件qPCR，并根据记录试剂A，试剂B，试剂C，试剂D体系中仪器上所读取的Cq值(3个重复取平均)，将NTC样本的Cq值减去待测样本的Cq值，取该差值2为底数的指数幂，A、B、C、D分别对应4个基因，判断指数幂大于20视为该基因检出，将基因检出的个数除以4计算基因检出率，基因检出率大于50％，视为完整度合格。4.实验结果见下表：样本CqACqBCqCCqD2△CqA2△CqB2△CqC2△CqD检出130.0327.3727.9231.6436.3372.8620.525.9775％231.1132.1627.1533.5117.132.6535.011.6325％327.4027.7025.3730.43224.8958.11120.1813.7975％NTC35.2134.5633.6335.351.001.001.001.005.实验结论：样本1完整度合格，样本2完整度不合格，样本3完整度合格。实施例41.试剂准备：KAPASYBRFASTqPCRMasterMix(2×)；试剂A：溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo110uM，Oligo210uM；试剂B：溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo310uM，Oligo410uM；试剂C：溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo510uM，Oligo610uM；试剂D：溶剂为超纯水，溶质为以下终浓度物质：Oligo710uM，Oligo810uM。2.检测用仪器：LightCycler480(Roche)。3.实验操作过程：(1)将3个待测样本分别取0.5ng，每个待测样本做3个重复，N＝待测样本数×3；(2)取4个1.5mlEP管，每个EP管上分别对应下表中的试剂A/试剂B/试剂C/试剂D；(3)混合液准备：(4)反应体系：(5)向96孔板中每孔加入15μlQPCR反应液；超纯水为NTC样本；(6)加完试剂后使用密封薄膜对板进行正确密封，使用密封膜刮板将膜牢牢地压在板表面；(7)将样本板放入板式离心机，1000×g，离心5min；(8)离心完成后将96孔板放进LightCycler480中，盖上仪器盖子，设置反应条件如下：设置完成后，点击startrun开始按钮，并保存实验文件qPCR，并根据记录试剂A，试剂B，试剂C，试剂D体系中仪器上所读取的Cq值(3个重复取平均)，将NTC样本的Cq值减去待测样本的Cq值，取该差值2为底数的指数幂，A、B、C、D分别对应4个基因，判断指数幂大于20视为该基因检出，将基因检出的个数除以4计算基因检出率，基因检出率大于50％，视为完整度合格。4.实验结果见下表：样本CqACqBCqCCqD2△CqA2△CqB2△CqC2△CqD检出126.9825.3025.8028.8416.06305.6789.2241.5975％228.5929.9024.6131.265.2312.67203.397.8025％324.0125.4922.5127.94125.41269.00873.9177.49100％NTC30.9831.1530.0031.791.001.001.001.005.实验结论：样本1完整度合格，样本2完整度不合格，样本3完整度合格。图1是实施例1-4中不同平台下对3份样本进行外周血游离核酸完整度检测的结果对比示意图。从以上实施例1-4和图1可以明显看到，4个实施例分别在4种不同的荧光定量PCR仪上使用该方法对同3份样本进行了完整度检测，得到的结果高度一致。因此，本发明的一种快速检测外周血游离核酸完整度的试剂可以有效检测外周血游离核酸的完整度，不受检测平台的限制，同时该试剂配制来源简单，操作简便，无需特殊人员培训，成本低廉。通过该试剂可有效的检测外周血游离核酸的完整度，大大减少因外周血游离核酸完整度不够而导致的下游检测结果无效的风险，为外周血游离核酸的下游分子生物学分析打下坚实基础。应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。序列表<110>苏州贝斯派生物科技有限公司<120>快速检测外周血游离核酸完整度的试剂、试剂盒与其应用<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1CGCATTCCTCATCCCAGTATG21<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2AAAGGACTTGGTGCAGAGTTCAG23<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>3CCCACCGCCTTCGACAT17<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4CCTGCTTACTGTGGGCTCTTG21<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>5CTCGCTTAACCAGACTCATCTACTGT26<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>6ACTTGGCTCAGCTGTATGAAGGT23<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>7AGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTC24<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>8ATGTCTCGATCCCACTTAACTATCTT26当前第1页1 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