改良黄瓜叶围微生态防治霜霉病的肠杆菌3bh19及其应用的制作方法

本发明属于植物保护领域，涉及针对改良黄瓜叶围微生态防治霜霉病的肠杆菌3bh19及其应用。

背景技术：

黄瓜(Cucums sativus L.)在植物分类学上属于葫芦科(Cucurbitaceae)、黄瓜属(Cucums),是全球十大蔬菜栽培作物之一，在我国“菜篮子”工程中占有重要地位。据联合国粮食与农业组织统计，从2000年到2004年,我国黄瓜栽培面积从116 549公顷(hm²)增加到1 502 900公顷(hm²)，产量从19 869 181百万吨(Mt)增加到25 558 000百万吨(Mt)。随着田间设施大棚的盛行，黄瓜栽培方式发生巨大改变。据不完全统计，目前我国黄瓜大部分采用在田间设施大棚种植，给菜农带来巨大经济收益的同时，对植保专家也提出针对病害防治的高要求。随着我国经济作物和保护地蔬菜面积迅速扩展，其中尤其是黄瓜这种以蔬菜兼水果著称的大宗蔬菜。田间设施大棚黄瓜种植中，常发生的病害有黄瓜灰霉病、黄瓜花叶病毒病、黄瓜白粉病、黄瓜细菌性角斑病、黄瓜霜霉病和黄瓜根结线虫、黄瓜枯萎病等，其中尤以黄瓜霜霉病流行快，发病重，防治难度大。其叶部病害因其条件适宜和蔬菜连作而日趋严重，其中霜霉病寄主转移，在大田中平均发病率为10-30％；设施大棚平均发病率50％，重者绝收。

黄瓜霜霉病是由古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis)引起的，是全世界范围内黄瓜产区最主要叶部病害之一，全世界大约有70多个国家先后发生这种病害，对黄瓜生产威胁极大。对北京周边、山东、河北等地进行病害调研的过程中，也发现该病为害严重，在发病严重的大棚中，病叶率达85％以上，果实发育迟缓，产量降低，给农民造成了很大的经济损失。仅河北青县春大棚调查，黄瓜霜霉病发生面积超过1330hm2，损失超过2000万元(李宝聚，2008)；据江苏通州市农业站在金沙镇光华村蔬菜基地调查，2个黄瓜大棚的黄瓜霜霉病棚发病率为33.33％，病叶率平均5％，3月22日在新三园村调查10个黄瓜大棚，棚发病率50％，病叶率平均10.98％，均为发病初期(江苏通州市，2009)；在江苏淮安，黄瓜霉霜病是日光温室设施大棚中发生最普通、持续时间长、危害最严重的病害,也是目前黄瓜用药量最大的病害，常年造成减产可达20％-40％，甚至绝收(刘峰，2011)。

利用环境有益微生物来控制病害的发生以及诱导提高作物抗逆能力是近些年来研究的热点，尤其这些微生物对环境无污染，引起了科学家们利用生物防治手段控制病害、以及应对不良环境的兴趣。肠杆菌(Enterobacter sp.)，在其自身的生长过程中可以产生一系列的代谢产物，这些代谢产物使得肠杆菌能够具有广泛地抑制真菌和细菌的活性，或者诱导植物抗性。它可以不同方式或途径影响植物的许多代谢过程，增加植物根长，改变植物根系形态建成，促进根系对水份和营养元素的吸收，肠杆菌可以提高植物的抗病能力，抵抗病原菌的侵染。

肠杆菌在自然界中分布十分广阔，同时能够对多种真菌与细菌产生抑制作用。因此，在生物防治方面具有广阔的应用前景，可以适当的代替传统的化学农药。同时，随着分子研究技术的提高，肠杆菌的基因功能更多地被了解，增加可应用的可行性。以及发酵条件的优化使得肠杆菌的大规模应用也具备了客观条件。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有防治防治黄瓜霜霉病的不足，提供一种绿色环保的能提高广谱植物防病、促生、微生态改良的肠杆菌3bh19。

本发明的另一目的是提供该肠杆菌的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

生防菌3bh19为肠杆菌(Enterobacter sp.)。针对多种黄瓜防病、促生、抗逆、微生态改良的生防菌3bh19，该菌株分类命名为肠杆菌(Enterobacter sp.)，于2016年06月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.12608。

所述的肠杆菌3bh19优选在防治黄瓜霜霉病,促进黄瓜地上部或地下部生长并提高品质、提高其抗逆性、微生态改良中的应用；所述的抗逆性选自抗旱、抗寒、耐热、耐涝中的一种或多种。

本发明所述的肠杆菌3bh19制备的菌剂。

本发明所述的菌剂，优选通过以下方法制备得到：将权利要求1所述肠杆菌3bh19在LB培养液中28℃180rpm振荡培养12-16h，然后6000rpm离心10min得到菌体，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL。

所述的菌剂通过灌根或者叶围喷施处理。

有益效果

本发明利用对环境无毒害的微生物菌剂防治黄瓜霜霉病，提供了一种绿色环保的肠杆菌菌剂，促进黄瓜植株的生长并提高品质和提高其抗逆性(包括抗旱、抗寒、耐热、耐涝等，抵抗倒春寒等不良气候)。解决了化学药剂等其它方法效果不佳或者有残留等问题，保护环境，促进农业可持续发展。

该肠杆菌3bh19制剂灌根处理后对黄瓜的株高以及根长有明显地提高，对植株具有一定的促生作用，经3bh19处理的黄瓜与对照组相比，处理后第30天生物量和对照相比增加超过32％。肠杆菌菌剂，可室温保存6个月-1年。肠杆菌3bh19菌剂处理的植物温室防病促生试验结果表明，对病害防效高达62.32％以上，肠杆菌3bh19菌剂处理的植物田间防病促生试验结果表明，对病害防效高达53.55％以上，并且可以提高黄瓜的品质，提高叶围微生物的多样性。

附图说明

图1、肠杆菌3bh19菌剂处理对黄瓜霜霉病的生防效果

图2、肠杆菌3bh19菌剂处理对黄瓜生物量的影响

图3、肠杆菌3bh19菌剂处理对黄瓜抗逆性的影响

图4、肠杆菌3bh19菌剂处理对黄瓜叶围样品DGGE分析

1-3泳道：3bh19菌株0d黄瓜叶围细菌样品(3重复)；4-6泳道：3bh19菌株30d黄瓜叶围细菌样品(3重复)；7-9泳道：Control 0d黄瓜叶围细菌样品(3重复)；10-12泳道：Control 30d黄瓜叶围细菌样品(3重复)；箭头为新条带。

生物材料保藏信息

肠杆菌3bh19，为肠杆菌(Enterobacter sp.)。于2016年06月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.12608,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。

具体实施方式

实施例1肠杆菌3bh19的分子学鉴定

细菌基因组试剂盒(赛百盛公司)提取细菌基因DNA后，用gyrB通用引物gyrB1(5'–GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3')；gyrB2R(5'–AGCAGGATACGGATGTGCGAGC CRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3')从基因组DNA中扩增出gyrB基因片段。具体扩增体系及程序(25ul)如下：引物1、2(10μM)各1μl；Mix:12.5μl；Taq:0.5μl。ddH₂O:10μl；模板:1μl。94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火2min，72℃延伸2m in，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，90V，30min；EB染色30min，检测扩增产物。扩增产物纯化后连接到pMD19-T载体，转化于Escherichia coli DH5α，提取阳性克隆质粒，委托TaKaRa公司测序，提交NCBI(Natio nal Center for Biotechnology Information)进行比对。根据比对结果将其鉴定为肠杆菌(E nterobacter sp.)。

实施例2

一种提高黄瓜霜霉病生物防治效果以及促生、抗逆、微生态改良的肠杆菌3bh19,含微生物成分：肠杆菌3bh19(保藏号为CGMCC NO.12608)。由淮安黄瓜根围土壤中分离得到。

肠杆菌3bh19菌剂的制备方法如下：

肠杆菌3bh19在LB培养液中28℃180rpm振荡培养12-16h，然后6000rpm离心10min得到菌体，用灭菌水将菌体进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL。

实施例3肠杆菌3bh19对黄瓜的温室促生试验

方法：将参试黄瓜种子用10％H₂O₂表面消毒10min，无菌水洗净后晾干备用。每个营养钵播种10粒种子。正常浇水管理4周后，将长势一致的苗移栽至330ml塑料杯中，移栽时将悬浮好的肠杆菌3bh19菌剂以1.0×10⁷CFU/mL的浓度灌根施用于作物根部，每株30mL量。然后置于温室中培养，28℃，70％相对湿度。以清水处理作为对照，每组处理48株苗，随机放置，共重复三次。30d后测定黄瓜植株株高、茎粗、鲜重、干重等生物量。

表1肠杆菌3bh19对黄瓜生物量的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

由上表可见，该制剂对肠杆菌3bh19灌根处理后对黄瓜的株高以及根长有明显地提高，对植株具有一定的促生作用，经3bh19处理的黄瓜与对照组相比，处理后第30天生物量和对照相比增加超过32％。

实施例4肠杆菌3bh19对黄瓜的黄瓜霜霉病温室防病试验

将参试黄瓜种子用10％H₂O₂表面消毒10min，无菌水洗净后晾干备用。每个营养钵播种10粒种子。正常浇水管理4周后，将长势一致的苗移栽至330ml塑料杯中，待其长出10片真叶进行喷雾处理。每处理设4个重复，每个重复48棵苗。处理组每株苗喷施30ml悬浮好的1.0×10⁷CFU/mL浓度的肠杆菌3bh19水溶液，对照组用等量灭菌水以相同方法喷雾；以上各个处理组喷雾时均加入终浓度为0.01％的表面活性剂Tween-20。喷施5d以喷雾处理的方式接种浓度为10⁵个孢子囊/ml的黄瓜霜霉病病原菌。接种病原菌15d后调查病害严重度并计算生防效果。病害调查方法：0级：无病症；1级：接种点有轻微病斑,其直径小于0.5cm；3级：病斑直径0.5-1.3cm；5级：接种点黄化面积占子叶面积1/2以下，坏死面积占1/3以下；7级：坏死斑面积占叶面积1/3-2/3；9级：坏死斑面积占叶面积2/3以上或全株枯死。

病情指数(％)＝[∑(病级数×该病级植株数)/(最高病级×总植株数)]×100；

生防效果(％)＝[(对照病害严重度-处理组病害严重度)/对照病害严重度]×100

表9肠杆菌3bh19对黄瓜植株的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

试验结果显示，肠杆菌3bh19能够显著降低温室黄瓜霜霉病的病害严重度，对病害防效高达62.32％，并且能够显著提高产量以及品质。

实施例5肠杆菌3bh19菌剂处理的防治果黄瓜霜霉病及提高果实产量试验

将参试黄瓜种子用10％H₂O₂表面消毒10min，无菌水洗净后晾干备用。

将催芽后的黄瓜种子播种于装有无菌土壤中盆砵中，每盆一粒，播种前保持土壤较为干燥。待番茄长到2叶期时，移栽到田间，每组处理48株苗，随机放置，将悬浮好的肠杆菌3bh19生防菌剂以1.0×10⁷CFU/mL的浓度喷施用于作物叶部，30d后统计黄瓜促生、防病及病害防治结果。病害调查方法：0级：无病症；1级：接种点有轻微病斑,其直径小于0.5cm；3级：病斑直径0.5-1.3cm；5级：接种点黄化面积占子叶面积1/2以下，坏死面积占1/3以下；7级：坏死斑面积占叶面积1/3-2/3；9级：坏死斑面积占叶面积2/3以上或全株枯死。

病情指数(％)＝[∑(病级数×该病级植株数)/(最高病级×总植株数)]×100；

生防效果(％)＝[(对照病害严重度-处理组病害严重度)/对照病害严重度]×100

试验结果显示，肠杆菌3bh19能够显著降黄瓜霜霉病的病害严重度，其平均防效达59.96％；并且能够显著提高产量以及品质。

表9肠杆菌3bh19对黄瓜植株的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

表10 3bh19对黄瓜品质的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

实施例6肠杆菌3bh19菌剂处理的诱导抗逆性试验

方法：将参试黄瓜种子用10％H₂O₂表面消毒10min，无菌水洗净后晾干备用。

将催芽后的黄瓜种子播种于装有无菌土壤中盆砵中，每盆一粒，播种前保持土壤较为干燥。待黄瓜长到6叶期时，将悬浮好的肠杆菌3bh19生防菌剂以1.0×10⁷CFU/mL的浓度灌根施用于作物根部，随后置于温室中培养，1个月后进行断水干旱，干旱胁迫持续15d，干旱胁迫后正常浇水，观察黄瓜幼苗的恢复生长情况。每组处理48株苗，随机放置，共重复3次。在温室中按照完全随机区组设计摆放。

浇水进行恢复生长1d后，肠杆菌3bh19处理组植株恢复正常生长，而而对照组植株全部死亡。

表11肠杆菌3bh19对植物耐旱性的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

实施例7肠杆菌3bh19菌剂处理的微生态改良试验

方法：将参试黄瓜种子用10％H₂O₂表面消毒10min，无菌水洗净后晾干备用。

将催芽后的黄瓜种子播种于装有无菌土壤中盆砵中，每盆一粒，播种前保持土壤较为干燥。待番茄长到2叶期时，移栽到田间，每组处理48株苗，随机放置，共重复3次。待30d(10叶)后，将悬浮好的肠杆菌3bh19生防菌剂以1.0×10⁷CFU/mL的浓度喷施用于作物叶部，30d后叶片取样(提前做好标记，以防新长出的叶子影响)，用灭菌剪刀剪取喷施生防菌的叶子。取回的叶片样品各称10g，无菌条件下转入100ml洗脱液(0.1mol/L磷酸钾缓冲液，PH7.0)，15℃200r/min震荡30min，超声波清洗仪中超声处理5min。收集洗脱液，4℃10000r/m in离心20min，收集沉淀，用作微生物DNA提取。采用改进的化学裂解法直接提取植物叶际基因组DNA，方法如下：取0.2g上述收集的植物叶际细菌菌体悬浮于800μL裂解液中，加入5μL20mg/ml的蛋白酶K，37℃温浴30min；再加入20％的SDS溶液使其终浓度为2％，混匀，60℃温浴1h，温浴期间取出震荡4-5次；加入等体积的氯仿，混匀，1000r/min离心8min；上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，常温下静置过夜，12000r/min离心20min；弃上清，干燥后重悬于30μL TE缓冲液中。细菌采用16SrDNA序列V3区段特异性PCR引物F338-GC和R518进行扩增：F338-GC:5-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCA CGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′,R518:5′-GCGTGTGTACAAGACCC-3′。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。PCR产物长约230bp。PCR反应程序为:94℃,7min；94℃,30s；55℃,30s；72℃,30s,35个循环；72℃,7min；4℃保存。PCR反应体系为:50μl体系,Buffer5μl；DNA模板1μl；Mg²⁺4μl；dNTP 4μl；引物各0.8μl；TaqDNA聚合酶0.8μl；去离子水33.6μl。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。PCR产物长约260bp。PCR反应程序为:94℃,5min；94℃,30s；56℃,30s；72℃,90s,35个循环；72℃,10min；4℃保存。PCR产物进行的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析，DGGE是在DCode突变检测系统(Dcode Universal Mutation Detection System)(B io-Rad)中完成。用25μL的PCR浓缩产物进行DGGE，采用变性梯度为30％～60％的8％的丙烯酰胺凝胶(化学变性剂为100％尿素7mol L-1和40％(v/v)的去离子甲酰胺)在1×TAE电泳缓冲液中,130V电压，60℃下电泳7h。电泳后用银染色10～15min，然后用Al phimager系统拍照。对DGGE图谱进行分析处理分析，利用Quantity One分析软件(Bio-Rad)确定样品电泳条带的多少和条带亮度的峰值，得到DGGE图谱的聚类图，确定黄瓜不同生育期根围微生态的变化。

结果(图4)显示：肠杆菌3bh19能够显著提高黄瓜叶围微生物的多样性。