本发明涉及一种应用于喷雾干燥乳酸菌菌粉制备和真空冷冻干燥法的添加滑菇多糖的乳酸菌保护剂。
背景技术：
乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一类能利用碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌通称。主要包括乳杆菌属、乳球菌属，链球菌属和双歧杆菌属等二十多个属。目前许多研究证实许多乳酸菌在人和动物的胃肠及结肠都是正常宿主菌。其中一些乳酸菌是人体的胃肠道的益生菌，可以产生许多益生功能。益生乳酸菌具有改善胃肠道、缓解乳糖不耐症、改善机体营养状况、调节免疫、提高抗氧化活性、降血压、降低胆固醇和亚硝酸盐以及抑制病原菌对宿主的定植等许多功能。乳酸菌作为重要的益生菌(Probiotic)已广泛地用于食品、生物医药，农业和饲料等行业中。
真空冷冻干燥技术和喷雾干燥技术常常用于益生乳酸菌的产品生产。在此过程中乳酸菌经历的低温、高温和干燥的压力会引起细胞损伤。为了减少真空冷冻干燥和喷雾干燥对乳酸菌的损伤，需在冻干前添加一定的保护剂，以提高细胞存活率，并且可以改善乳酸菌的贮藏稳定性。加工过程中的温度对微生物存活影响最大，特别是高温。高温能破坏乳酸菌维系生命活动的酶系，使其活性降低或者丧失。蛋白质、核酸与酶系统等重要生物高分子的也会氢键受到破坏，导致菌体蛋白质凝固变性，核酸发生降解变性失活，从而破坏细胞的组成；高温还会导致细胞膜上类脂质成分形成极小的孔，使细胞内容物泄漏，还对细胞膜、细胞壁、细胞质和核酸造成损害，从而导致死亡。低温也会产生冰晶对细胞造成损害，其损伤主要来自于细胞膜脂肪酸物理性状的改变和相关蛋白质结构的改变。真空冷冻干燥操作和喷雾干燥操作都伴随着乳酸菌的干燥，干燥也会对乳酸菌造成损伤，会引起乳酸菌膜的融合与脂质的相转变。保护这些基本的功能和结构对于细胞存活和保持功能性至关重要。乳酸菌保护剂是提高乳酸菌活性最重要的一种措施，通过研究合适的保护剂配方，可以大大提高乳酸菌在喷雾干燥过程和真空冷冻干燥过程时乳酸菌的成活率。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，克服上述现有技术中存在的不足，提供一种添加滑菇多糖的乳酸菌保护剂。
本发明一种添加滑菇多糖的乳酸菌保护剂，它包括以下步骤：
1.滑菇多糖的制备
(1)滑菇的挑选
选取新鲜滑菇，表面没有腐烂、形状完整、无明显组织伤痕；菇柄粗短、菇盖圆且光滑、直径在3cm左右、盖面、边缘肉厚，没有发酸发臭味道；大小均一且干净的优良滑菇备用；
(2)滑菇的称重
用电子天平称取1000g新鲜滑菇供使用；
(3)滑菇的破碎打浆
在称取好滑菇中加蒸馏水，滑菇与水的质量比例为2:3；滑菇与水一同倒入高速组织捣碎机中，对滑菇进行间歇破碎打浆，30秒高速打浆10000转/分，停止2分钟，共4次；得滑菇组织浆液；
(4)酶解
上述滑菇组织浆液，然后加入纤维素酶10U/mg，添加量为浆液质量的0.08％；在55℃下保温3小时；
(5)水浴浸提
将上一步所得滑菇组织浆液置水浴锅加热，再将盛有滑菇组织浆液的烧杯置于恒温水浴锅中，85℃下水浴加热4h；
(6)过滤
用100目不锈钢过滤筛对水浴过后的滑菇组织浆液进行过滤，滤液混合留存；
(7)洗渣
上一步所得滤渣加1倍水于85℃下水浴浸提1h,用100目不锈钢过滤筛过滤，保留滤液，并与上一步滤液混合；
(8)醇析
所得混合滤液按1:2比例加无水乙醇醇析，4℃静置24h；然后在4000rpm离心20min后除去液体，获得滑菇多糖的固体；
(9)干燥
上述醇析后的滑菇多糖固体经80℃抽真空干燥，获得滑菇多糖在以下步骤中供用作保护剂；
2.包含滑菇多糖的保护剂配方的组成
向乳酸菌离心后的菌体沉淀物添加滑菇多糖、硼酸钠、谷氨酸钠、谷胱甘肽、维生素C，其添加比例分别为乳酸菌离心后的菌体沉淀物重量的0.001－0.04％、0.01－0.03％、0.01－0.03％、0.02－0.08％和0.01－1.0％(w/w)。
本发明具有如下有益效果：
本发明的乳酸菌包括干酪乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和双歧杆菌。本发明的乳酸菌保护剂含有滑菇多糖或者其混合物，可以用于喷雾干燥乳酸菌菌粉制备和真空冷冻干燥法乳酸菌菌粉制备，该方法能生产活菌数高的发酵剂，操作简单、成本低，能规模化生产。
本发明保护剂可以用于喷雾干燥和真空冷冻干燥生产乳酸菌菌粉。配方中主要含有保护乳酸菌的滑菇多糖。其中乳酸菌包括干酪乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和双歧杆菌。采用该保护剂制得的乳酸菌菌粉的存活率都在60％以上，活菌数都在1010以上。
具体实施方式
本发明一种添加滑菇多糖的乳酸菌保护剂的制备方法，它包括以下步骤：
1.滑菇多糖的制备
(1)滑菇的挑选
选取新鲜滑菇，表面没有腐烂、形状完整、无明显组织伤痕；菇柄粗短、菇盖圆且光滑、直径在3cm左右、盖面、边缘肉厚，没有发酸发臭味道；大小均一且干净的优良滑菇备用；
(2)滑菇的称重
用电子天平称取1000g新鲜滑菇供使用；
(3)滑菇的破碎打浆
在称取好滑菇中加蒸馏水，滑菇与水的质量比例为2:3；滑菇与水一同倒入高速组织捣碎机中，对滑菇进行间歇破碎打浆，30秒高速打浆10000转/分，停止2分钟，共4次；得滑菇组织浆液；
(5)酶解
上述滑菇组织浆液，然后加入纤维素酶10U/mg，添加量为浆液质量的0.08％；在55℃下保温3小时；
(6)水浴浸提
将上一步所得滑菇组织浆液置水浴锅加热，再将盛有滑菇组织浆液的烧杯置于恒温水浴锅中，85℃下水浴加热4h；
(7)过滤
用100目不锈钢过滤筛对水浴过后的滑菇组织浆液进行过滤，滤液混合留存；
(8)洗渣
上一步所得滤渣加1倍水于85℃下水浴浸提1h,用100目不锈钢过滤筛过滤，保留滤液，并与上一步滤液混合；
(9)醇析
所得混合滤液按1:2比例加无水乙醇醇析，4℃静置24h；然后在4000rpm离心20min后除去液体，获得滑菇多糖的固体；
(10)干燥
上述醇析后的滑菇多糖固体经80℃抽真空干燥，获得滑菇多糖在以下步骤中供用作保护剂；
2.包含滑菇多糖的保护剂配方的组成
向乳酸菌离心后的菌体沉淀物添加滑菇多糖、硼酸钠、谷氨酸钠、谷胱甘肽、维生素C，其添加比例分别为乳酸菌离心后的菌体沉淀物重量的0.001－0.04％、0.01－0.03％、0.01－0.03％、0.02－0.08％和0.01－1.0％(w/w)。
本发明的乳酸菌保护剂含有滑菇多糖或者其混合物，可以用于喷雾干燥乳酸菌菌粉制备和真空冷冻干燥法乳酸菌菌粉制备，具体实施例如下：
实施例1：喷雾干燥法生产干酪乳杆菌菌粉
①高密度培养
将活化后的干酪乳杆乳酸菌菌体培养物以体积分数为1％接种量接至MRS培养24小时，该MRS是经实验优化后培养干酪乳杆菌的MRS培养基，能使最大培养活菌数达1012。
②保护剂配方及添加方法
含滑菇多糖的一种保护剂配方，添加比例分别是收集的菌体离心沉淀物重量的百分比：滑菇多糖0.01％、硼酸钠0.02％、谷胱甘肽0.08％和维生素C 0.02％(w/w)。保护剂制备及添加方法：干酪乳杆菌离心后的菌体沉淀添加配制好的保护剂。
收集干酪乳杆菌的乳酸菌菌体离心沉淀物。保护剂按上述配方称量后，加入其重量5倍的水溶解，8000r/min均质5分钟，121℃灭菌15分钟，冷却到40℃。加入0.1％Tween 80后二次均质，均质条件5000r/min，10分钟，将菌体沉淀物和保护剂混合后，轻轻搅拌均匀，然后进行下一步喷雾干燥。
③喷雾干燥的工艺参数：①进料流量15ml/min(采用10L的小型喷雾干燥机)；进料浓度30％；②进料温度为28℃；③进风温度130℃；④雾化器压力150kPa。
采用该方法制得的干酪乳杆菌菌粉的存活率都在60％以上，活菌数都在1010以上。
实施例2：真空冷冻干燥法生产嗜酸乳杆菌菌粉
①高密度培养
将活化后的干酪乳杆乳酸菌菌体培养物以体积分数为1％接种量接至MRS培养24小时，该MRS是经实验优化后培养干酪乳杆菌的MRS培养基，能使最大培养活菌数达1012。
②保护剂配方及添加方法
含滑菇多糖的一种保护剂配方，添加比例分别是收集的菌体离心沉淀物重量的百分比：滑菇多糖0.008％、硼酸钠0.01％、谷氨酸钠0.02％和维生素C 0.04％(w/w)。保护剂制备及添加方法：干酪乳杆菌离心后的菌体沉淀物添加配制好的保护剂。
收集干酪乳杆菌的乳酸菌菌体离心沉淀物。保护剂按上述配方称量后，加入其重量5倍的水溶解，8000r/min均质5分钟，121℃灭菌15分钟，冷却到40℃。加入0.1％Tween 80后二次均质，均质条件5000r/min，10分钟，将菌体沉淀物和保护剂混合后，轻轻搅拌均匀，然后进行下一步真空冷冻干燥。
③真空冷冻干燥的工艺参数：①预冷温度-30℃；②预冻速率0.6℃/min；③干燥室压力62Pa；④加热板温度40℃；⑤含水量在5％以下。
采用该方法制得的干酪乳杆菌菌粉的存活率都在65％以上，活菌数都在1010以上。贮存半年后的存活率都在50％以上。