一种硫酸酯化梭柄松苞菇多糖的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多糖的制备技术领域，具体为一种硫酸酯化梭柄松苞菇多糖（sCVPs) 的制备方法。
【背景技术】
[0002] 随着仔猪个体的增长，以及母体自身的消耗，使得在哺乳的中后期中仔猪从母乳 所获得的营养物质不能完全满足其生长发育的需求，导致仔猪生长缓慢，同时也不利于母 猪身体机能的恢复。因此在现代的养猪业中，随着养殖规模的不断扩大，人们普遍意识到仔 猪的适时断奶成为养猪生产中的一个重要环节。而且仔猪的肠道发育不够健全，早期断奶 极易导致肠道氧化应激损伤继而引发消化功能紊乱及腹泻，从而严重威胁到仔猪的健康及 生命安全。我国每年因仔猪肠道健康问题造成的经济损失达300亿元，断奶应激一直是困 扰养猪业的一个"瓶颈"，也是动物生理营养学界亟待解决的关键命题之一。
[0003] 在生产实践中，人们常常在断奶仔猪日粮中添加抗生素来预防仔猪疾病和促进其 健康生长，但是在抗生素的使用过程中出现的负面效应对畜产品的安全生产产生了严重的 威胁。因此找寻到安全高效的抗氧化剂，并有针对性地对断奶仔猪肠道氧化损伤进行干预， 是现阶段养猪业突破"瓶颈"的解决方案。
[0004] 梭柄松荀燕（Catathelasmaventricosum)是我国传统的名贵中药材，《本草纲目》 和《滇南本草》都对其有相关记载，并被收录于《中华人民共和国药典》。近期有研究报道显 示，梭柄松苞菇的水提物和醇提物在体外实验中，均表现出显著的抗氧化和降血糖活性，其 中水提物的活性表现的最为突出，并验证了多糖是水提物中主要的活性物质。同时有研究 证明，STZ-诱导的糖尿病小鼠在服用了梭柄松苞菇多糖后，抗氧化酶、血糖、血脂、胰岛素等 生理指标均得到了明显改善，并认为糖尿病小鼠症状的改善，主要是由于梭柄松苞菇多糖 的强抗氧化活性对小鼠的组织和器官的保护，而免受氧化损伤，最终使得这些组织和器官 保持其生理功能。
[0005] 尽管梭柄松苞菇多糖具有非常突出的抗氧化等生物活性，具有进一步开发应用的 潜质，但要实现其作为产品进入市场尚有距离。利用理化方法，对多糖进行基团修饰，是提 升多糖生物活性的有效方式之一。近年来在许多研究中，硫酸酯化多糖展现出抗氧化、抗病 毒、抗凝血、抗肿瘤以及增加机体免疫等独特的生物活性，因此，硫酸酯化被越来越广泛地 用于多糖分子结构的修饰。经过许多科研人员长期探索与改良，多糖硫酸酯化的方法有氯 磺酸-吡啶法、三氧化硫-吡啶法、浓硫酸法、Nagasawa法、氨基磺酸法等，其中氯磺酸-P比 啶法因其操作简单，产率较高，而被广泛采用。但现阶段多糖硫酸酯化的方法普遍存在：硫 酸酯化多糖活性较低，硫酸酯化多糖取代度较低，并且在增加试剂浓度和反应时间时，又会 严重影响硫酸酯化多糖的得率。目前并没有利用梭柄松苞菇多糖进行硫酸酯化的研究，值 得注意的是梭柄松苞菇多糖的分子量较其他菌类多糖而言较小，而分子量的大小往往与取 代度和生物活性成反比，因此用硫酸酯化的梭柄松苞菇多糖应用于抗糖尿病的研究必将会 为多糖的化学修饰和多糖的生物活性提供新思路和参考。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种以梭柄松苞菇为代表的高效的食用菌多糖硫酸酯化 的方法，，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种硫酸酯化梭柄松苞菇多糖的制 备方法，其特征在于：（1)取新鲜梭柄松苞菇进行预处理；（2)梭柄松苞菇多糖的制备，具 体为：水提取：先用乙醇进行洗涤，然后离心处理，将离心管的沉淀样品干燥，并按料液比 1 : 20与蒸馏水混合，然后进行超声波处理，超声波作用功率为150W，每工作15min，暂停 5min，提取温度80°C，提取时间2. 5h，上述水提取步骤重复提取三次，合并提取液即为梭柄 松苞菇多糖提取液；乙醇沉淀：将梭柄松苞菇多糖提取液用旋转蒸发仪浓缩，加入5倍体积 的95 %乙醇溶液，搅拌0. 5h后，置于4°C冰箱12h，再离心处理，然后弃上清液，收集沉淀，冻 干待用；去除蛋白质：按固液比1 : 10加入蒸馏水溶解梭柄松苞菇多糖，然后加入1/4倍体 积的氯仿-正丁醇，充分振荡30min后，再离心处理，获得三层液体，吸取最下层多糖溶液， 重复该去除蛋白质步骤5次；去除小分子物质：将去除蛋白质的多糖提物，流水透析过夜， 透析袋的截留分子量为3000,以去除小分子杂质；再用旋转蒸发仪将该多糖提取液浓缩， 与4倍体积的95%乙醇溶液混合，搅拌0. 5h后，置于4°C冰箱12h，再离心处理，离心机转 速5000rpm，时间5min，弃上清液，沉淀即为梭柄松苞菇多糖，冷冻干燥备用；（3)硫酸酯化 梭柄松苞菇多糖的制备，具体为：量取70ml二甲基亚砜于干燥附有冷凝装置的250ml三颈 烧瓶中，边磁力搅拌边缓慢加入分子量范围为1. 〇X104-3.OX104Da的lg梭柄松苞菇多糖 样品，防止样品凝结成块，搅拌过程持续lh，加完后盖上瓶塞；再将2. 5g三氧化硫-吡啶粉 末加入，水浴加热至85°C，冷凝管回流，反应3h;反应结束后，将烧瓶放入冷水浴中冷却至 室温，之后反应液用10%NaOH中和，加入4倍体积无水乙醇沉淀，静置过夜，离心收集沉淀 物，将沉淀溶于水中透析，透析液冷冻干燥即得到硫酸酯化梭柄松苞菇多糖。
[0008] 进一步的，新鲜梭柄松苞菇的预处理步骤具体为，
[0009] 清洁：用塑料刮片将新鲜梭柄松苞菇表面的泥渍去除，不可用水清洗，不然表面的 多糖会损失；
[0010] 切块：将清洁后的新鲜梭柄松苞菇切块，每一个切块大小适中且均匀；
[0011] 冷冻干燥：将梭柄松荀燕块放入冷冻干燥机，获得含水量低于5%的样品。
[0012] 进一步的，乙醇沉淀步骤和去除蛋白质步骤中的离心处理的离心机转速5000rpm， 时间5min。
[0013]与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1)本专利选用的原料（梭柄松苞菇）在 四川、云南和贵州等地广泛种植，采集方便，价格低廉，并且CVPs已经被证明具有较为突出 的抗糖尿病活性，因此具备进一步被开发利用的潜质；（2)本专利建立了一种高效的sCVPs 的制备方法，其中首次评价了多糖分子量范围对多糖硫酸酯化的影响，最终所得sCVPs的 得率和取代度分别达到了 68. 75 %和1. 49,并且整个制备过程的反应条件温和，成本低廉， 操作简单易于工业推广；（3)动物实验证明，对CVPs进行硫酸酯化修饰后，sCVPs的生物活 性得到显著提高，每天仅需摄入基础日粮0. 01%。质量的sCVPs，即能显著提高其对断奶仔 猪肠道氧化应激的缓解作用。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明中硫酸酯化梭柄松苞菇多糖红外光谱图；
【具体实施方式】
[0015] 下面将结合本发明实施例中的附图1，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0016] 请参阅图1，本发明提供一种硫酸酯化梭柄松苞菇多糖的制备方法，其特征在于： (1)取新鲜梭柄松苞菇进行预处理；清洁：用塑料刮片将新鲜梭柄松苞菇表面的泥渍去除， 不可用水清洗，不然表面的多糖会损失；切块：将清洁后的新鲜梭柄松苞菇切块，每一个切 块大小适中且均匀；冷冻干燥：将梭柄松苞菇块放入冷冻干燥机，获得含水量低于5%的样 品。（2)梭柄松苞菇多糖的制备，具体为：水提取：先用乙醇进行洗涤，然后离心处理，将离 心管的沉淀样品干燥，并按料液比1 : 20与蒸馏水混合，然后进行超声波处理，超声波作 用功率为150W，每工作15min，暂停5min，提取温度80°C，提取时间2. 5h，上述水提取步骤 重复提取三次，合并提取液即为梭柄松苞菇多糖提取液