一种洁丽香菇多糖蛋白复合物及其制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然药物开发领域，涉及一种从洁丽香菇发酵液中提取具有免疫调 节、抗肿瘤复合物的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是当今世界严重威胁人类生命和健康的恶性疾病之一，近年来恶性肿瘤 的发生率呈逐年上升趋势，死亡率居各疾病之首。据世界卫生组织统计，2008年死于肿瘤疾 病的人数达到760万人。目前，死亡率仍不断上升，专家估计到2030年死亡人数可能会达 到1310万人。因此，对恶性肿瘤的防治已成为生命科学领域的重要课题。
[0003] 目前，临床上治疗恶性肿瘤的主要手段是手术切除以及放疗和化疗等方法。然而， 手术无法在根本上杀死肿瘤细胞。放疗和化疗在杀伤患者体内肿瘤细胞的同时也会破坏机 体的正常细胞和组织，具有较大毒副作用。因此，寻找一种治疗效果好，毒副作用少的天然 抗肿瘤药物成为当务之急。食药用菌是一类十分重要的天然药物资源。研宄表明，食药用 菌中含有多糖、蛋白、黄酮等多种活性物质，具有提高机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化等多种药 理学作用。洁丽香葫（Lentinus lepideus (Fr.) Fr.)，另Ij名豹皮香葫，隶属于担子菌门、伞菌 纲、多孔目、多孔科、香菇属是一种重要的食药用菌。研宄表明，洁丽香菇具有抗氧化和免疫 调节活性，然而其抗肿瘤成分及其抗肿瘤作用尚未被发现和报道。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种洁丽香菇多糖蛋白复合物及其制备方法及其应用。
[0005] 本发明采取的技术方案是：
[0006] ( -）发酵：将洁丽香菇菌种接种于种子培养基内，培养条件为：温度24-26?，转 速140-160r/min，培养14~16d，制得一级种子液，将该一级种子液以10-20%接种量接 入发酵培养基中，发酵条件为：温度24-26°C，转速140-160r/min，培养7-8d后，离心，转速 5000r/min-8000r/min，收集上清液获得粗多糖蛋白复合物发酵液；
[0007] (二）提取：将粗多糖蛋白复合物发酵液旋转蒸发浓缩至原体的1/10-1/8,加入 3-5倍体积无水乙醇4°C沉淀12~16h，离心10-20min，转速3000-5000r/min，收集沉淀， 45-50°C干燥，即得。
[0008] 所述的种子培养基组成为：玉米粉7-10%、葡萄糖2-3%、蛋白胨0.2-0. 4%、酵母 浸粉 0· 2-0. 4%、K2PO4O. 15-0. 20%、MgSO4O. 1-0.1 S^JB10.0 1-0. 02%。
[0009] 所述的发酵培养基组成为：玉米粉7-10%、乳糖3-5%、蛋白胨0. 3-0. 5%、酵母浸 粉 0· 3-0. 5%、K2PO4O. 15-0. 20%、MgS040. 075-0. 01-0. 02%。
[0010] 本发明通过苯酚-硫酸法测定其中多糖含量为30% -48%，通过考马斯亮蓝法测 定蛋白含量为7. 14-10%。
[0011] 所述的一种洁丽香菇多糖蛋白复合物在制备免疫调节剂和抗肿瘤药物中的应用。
[0012] 所述的一种洁丽香菇多糖蛋白复合物在制备提高正常小鼠脾淋巴细胞数量、血清 中细胞因子数、免疫抑制小鼠抗体生成细胞数量和血清血溶素含量，且可改善正常小鼠和 免疫抑制小鼠 T淋巴细胞亚群⑶47⑶8+比值的药物中的应用。
[0013] 所述的一种洁丽香菇多糖蛋白复合物在制备有效抑制H22, S180荷瘤小鼠肿瘤生 长的药物中的应用。
[0014] 本发明的积极效果在于：从洁丽香菇发酵液中发现了一种尚未报道过的新的多糖 蛋白复合物，可以提高正常小鼠脾淋巴细胞数量、血清中细胞因子数、免疫抑制小鼠抗体生 成细胞数量和血清血溶素含量，且可改善正常小鼠和免疫抑制小鼠 T淋巴细胞亚群CD4+/ ⑶8+比值。该多糖还可以有效抑制H22，S180荷瘤小鼠肿瘤生长。该洁丽香菇多糖蛋白复 合物对于新的天然无毒副作用的抗肿瘤药物的开发提供了重要研宄基础。
【附图说明】
[0015] 图1是本发明洁丽香菇多糖蛋白复合物对脾淋巴细胞增殖的影响图。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1
[0017] ( -）发酵：将洁丽香菇菌种接种于种子培养基内，培养条件为：温度24°C，转速 140r/min，培养16d，制得一级种子液，将该一级种子液以10 %接种量接入发酵培养基中， 发酵条件为：温度24°C，转速140r/min，培养9d后，离心，转速5000r/min，收集上清液获得 粗多糖蛋白复合物发酵液；
[0018] (二）提取：将粗多糖蛋白复合物发酵液旋转蒸发浓缩至原体的1/10,加入3倍体 积无水乙醇4°C沉淀12h，离心10min,转速3000r/min，收集沉淀，45°C干燥，即得；
[0019] 所述的种子培养基组成为：玉米粉7%、葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、酵母浸粉 0. 2%, K2PO4O. 15%,MgSO4O. ^,VB10.0 1% ；
[0020] 所述的发酵培养基组成为：玉米粉7 %、乳糖3 %、蛋白胨0. 3 %、酵母浸粉0. 3 %、 K2PO4O. 15%、MgSO4O. OTS^JB10.0 1%，其余为水。
[0021] 实施例2
[0022] (一）发酵：将洁丽香菇菌种接种于种子培养基内，培养条件为：温度25°C，转速 150r/min，培养15d，制得一级种子液，将该一级种子液以15 %接种量接入发酵培养基中， 发酵条件为：温度25°C，转速150r/min，培养9d后，离心，转速6500r/min，收集上清液获得 粗多糖蛋白复合物发酵液；
[0023] (二）提取：将粗多糖蛋白复合物发酵液旋转蒸发浓缩至原体的1/9,加入4倍体 积无水乙醇4°C沉淀14h，离心15min,转速4000r/min，收集沉淀，47. 5°C干燥，即得；
[0024] 所述的种子培养基组成为：玉米粉8. 5%、葡萄糖2. 5%、蛋白胨0. 3%、酵母浸粉 0. 3%, K2PO4O. 18%,MgSO4O. 13%, VB10.0 15% ；
[0025] 所述的发酵培养基组成为：玉米粉8. 5%、乳糖4%、蛋白胨0.4%、酵母浸粉 0· 4%、K2PO4O. 18%、MgSO4O. OSS^JB10.0 15%，其余为水。
[0026] 实施例3
[0027] (一）发酵：将洁丽香菇菌种接种于种子培养基内，培养条件为：温度26°C，转速 160r/min，培养14d，制得一级种子液，将该一级种子液以20 %接种量接入发酵培养基中， 发酵条件为：温度26°C，转速160r/min，培养7d后，离心，转速8000r/min，收集上清液获得 粗多糖蛋白复合物发酵液；
[0028] (二）提取：将粗多糖蛋白复合物发酵液旋转蒸发浓缩至原体的1/8,加入5倍体 积无水乙醇4°C沉淀16h，离心20min,转速5000r/min，收集沉淀，50°C干燥，即得；
[0029] 所述的种子培养基组成为：玉米粉10%、葡萄糖3%、蛋白胨0.4%、酵母浸粉 0. 4%, K2PO4O. 20%,MgSO4O. 15%, VB10.0 2% ；
[0030] 所述的发酵培养基组成为：玉米粉10%、乳糖5%、蛋白胨0.5%、酵母浸粉0.5%、 K2PO4O. 20 %、MgSO40.0 1 %、VB10.0 2 %，其余为水。
[0031] 通过苯酚-硫酸法测定其中多糖含量为30 % -48 %，通过考马斯亮蓝法测定蛋白 含量为7. 14-10%。
[0032] 下边通过具体试验例来进一步说明本发明的效果
[0033] 试验例1
[0034] 小鼠脱颈处死，浸泡于75%乙醇中消毒5min，超净工作台内无菌取出脾脏，剔除 周围的结缔组织和筋膜，将脾放置于盛有预冷RPMI-1640培养液的平皿中，过200目筛网， 用针芯轻轻研磨，加入1ml无血清的RPMI-1640培养液冲洗。吸取冲洗液于灭菌的离心管 中，4°C、3000rpm离心5min。弃去上清液，加入ImL红细胞裂解液，轻轻振荡混匀，使细胞 沉淀悬于裂解液中，4°C、3000rpm离心5min。弃上清，ImL RPMI-1640培养液洗涤一次，用 含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液重悬细胞沉淀，制得单个脾细胞悬液，台盼蓝染色，计 数，调整细胞个数至IX 106个/ml，备用。
[0035] 将脾细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔100 μ 1，各孔分别加入不同浓度洁 丽香葫多糖蛋白复合物（以下简称本发明）溶液（lmg/mL、500ug/mL、100ug/mL、50ug/mL、 10ug/ml、lug/ml) 50ul及Con A溶液（终浓度5 μ g/mL) 50ul，每组浓度设4个复孔，同时设 不含洁丽香菇多糖蛋白复合物溶液的ConA对照孔。37°C、5% C02培养箱中培养48h，结束 培养前4h每孔加入MTT溶液（5mg/mL) 20ul，离心吸弃上清后，每孔加入二甲基亚砜150ul， 振荡混匀，室温放置lOmin，于酶标仪570nm波长处检测OD值。实验结果如图1所示。从图 1中结果可以看出，空白组与Con A对照组相比，差异极显著（p〈0.01)，说明Con A能够有 效刺激脾淋巴细胞分化、增殖。ConA+洁丽香菇多糖蛋白复合物各剂量协同组与ConA对照 组比均能不同程度促进脾淋巴细胞增殖，且随浓度增加，OD值逐渐上升，协同作用增强，说 明存在一定的量效关系。
[0036] 试验例2
[0037] 取昆明小鼠40只，称重后随机分成5组，即正常组、阳性组（I. 5g/kg黄芪多糖口 服液）和洁丽香葫多糖蛋白复合物高（500mg/kg)、中（250mg/kg)、低（125mg/kg)剂量组。 各实验组均灌胃给药，给药体积为0. 2mL/10g，连续灌服30天。末次给药后，小鼠禁食不禁 水12h，称重，眼球取血于离心管中，血样3000rpm离心15min,收集上清，按照ELISA试剂 盒操作步骤，酶标仪检测出各孔的吸光度OD值，绘制线性回归方程，计算出血清中IL-12、 TNF-α。实验结果如表1所示。从实验结果中可以看出，洁丽香菇多糖蛋白复合物可以显 著提高正常小鼠血清中细胞因子含量。
[0038] 表1洁丽香菇多糖蛋白复合物对正常小鼠细胞因子的影响（[土 s, n=8)
[0039]
[0040] 注：与正常对照组相比**ρ〈0· 01，*ρ〈0· 05
[0041] 试验例3
[0042] 取昆明小鼠48只，称重后随机分成6组，即正常组、模型组、阳性组（1.5g/kg黄芪 多糖口服液）和洁丽香葫多糖蛋白复合物高（500mg/kg)