对番茄灰霉病菌具强致病力的淡紫紫孢菌菌株及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种对番茄灰霉病菌具强致病力的淡紫紫孢菌（purpureocilliumlilacinum）菌株及其应用。

背景技术：

灰霉病是一种世界性的重要病害，它可侵染200多种植物的花、果实及其他绿色组织，导致植物组织腐烂，丧失利用价值。近年来，灰霉病在中国大面积的发生，已严重阻碍了蔬菜产量的提高。其中茄科蔬菜以番茄受害最重，番茄灰霉病的防治已成为保护生产发展的关键性措施，直接决定着番茄的产量和经济效益。灰霉病菌在番茄上主要以菌核在土壤中或以菌丝及分生孢子在病残体上越冬或越夏。该病害为气传病害，主要靠分生孢子随气流、灌溉水和农具等传播，花期是侵染的高峰期。第二年春天条件适宜时，菌核萌发，产生菌丝体和分生孢子梗及分生孢子。分生孢子成熟后脱落，借气流、雨水或露珠及农事操作进行传播。萌发时产出芽管，从寄主伤口或衰老的器官、枯死的组织上侵入，也可由表皮直接侵染引起发病，潮湿时病部产生大量的分生孢子可进行再侵染。低温、高湿是发病的必要条件，尤其高湿是病害发生发展的主导因素，温度在15℃左右，相对湿度在80%是发病的起始条件。

目前，对于番茄灰霉病菌的防治多采用化学防治措施，然而化学农药的频繁使用造成了农药残留、环境污染、生物多样性破坏和番茄灰霉病菌产生抗药性等诸多问题，而生物农药以其高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性和原料易得等特性被人们认为是未来化学农药的理想替代药剂。因此，利用生物农药防治番茄灰霉病菌也逐渐引起人们的重视。番茄灰霉病的生物防治以活体微生物或其代谢产物的研究较多，已有的研究结果表明，许多土壤、叶围、根围及内生微生物甚至包括一些植物病原物对灰霉病菌均有一定程度的抑制作用。当前用于防治灰霉病菌的生防真菌有绿色木霉(trichodermaviride)、哈茨木霉(trichodermaharzianum)、木素木霉(trichodermalignorum)、出芽梗短霉(aureobasidiumpullulans)、浅白隐球酵母(crypto-coccusalbidus)、胶粘红酵母(rhodotorulaglutinis)、球毛壳(chaetomiumglobosum)、粘帚霉(gliocladiumspp.)等，细菌主要有芽孢杆菌属如(bacsllussutizis)、多粘芽孢杆菌(baeilluspolymyxa)、地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)、乳芽孢杆菌(lactobaeillussp)、短体芽孢杆菌(baeslluspumilus)、嗜麦芽黄单孢菌(xanthomonasmaltophilia)、假单孢杆菌(peudomonassp.)、荧光假单孢菌(peudomonasjluoreseens）等。

然而，目前对于番茄灰霉病菌生防菌的研究多处于实验室阶段，尚未在农业生产中对番茄灰霉病菌达到有效防治，亟待进一步分离筛选或诱导驯化出能有效应用的有益菌株，并进行生物潜能的深入研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株对番茄灰霉病菌具有强致病力的淡紫紫孢菌菌株，该菌株作为生物农药，具有良好的市场应用前景。

为解决以上问题，本发明通过以下技术方案实现：

在已分离、筛选所得的原始菌株pl36-1基础上，发明人进一步通过根癌农杆菌介导的t-dna插入遗传转化而获得的突变菌株pt362，并于2016年11月25日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国湖北省武汉市武汉大学，邮编430072），保藏编号为cctccno：m2016682。

本发明还公开了该淡紫紫孢菌菌株pt362在防控番茄灰霉病中的应用，以及在制备用于防治番茄灰霉病菌的生物农药中的应用，菌株的分生孢子悬浮液及代谢产物对番茄灰霉病菌具有强致病力。

与现有技术相比，本发明具有以下积极有益的技术效果：

（1）本发明淡紫紫孢菌菌株pt362是一种线虫病原生防真菌，可制成生防菌制剂用于对番茄灰霉病菌的生物防治，较目前防治番茄灰霉病菌的化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性的特征。

（2）本发明淡紫紫孢菌菌株pt362繁殖力强，培养速度快，产孢量大，孢子萌发率高，易于制备。

（3）本发明淡紫紫孢菌菌株pt362的孢子悬浮液和代谢产物对番茄灰霉病菌具有很强的致病力。

附图说明

图1淡紫紫孢菌菌株pt362对番茄灰霉病菌的拮抗效果（pda平板）；

图2淡紫紫孢菌菌株pt362代谢产物对番茄灰霉病菌的拮抗效果。

具体实施方式

下面结合实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的生化试剂如无特别说明，均为市售。

实施例1：淡紫紫孢菌菌株pt362的培养、驯化

淡紫紫孢菌原始菌株pl36-1王明祖老师1991年在湖北省从根结线虫体内分离得到（参见1991年发表在《植物病理学报》名为“根结线虫卵寄生真菌的研究初报”的文章），保存于华中农业大学植物病理线虫研究室。pt362是通过根癌农杆菌介导的t-dna插入遗传转化而获得的突变菌株。

转化子遗传稳定性的方法参考曾大兴的方法。大致如下：在不含草丁膦和萎锈灵的pda平板上接种淡紫紫孢菌转化菌株，28℃，恒温黑暗培养3-5天后，接着转移到4℃冰箱，放置2天，再然后28℃，恒温黑暗培养3-5天，用打孔器挑取菌落边缘菌丝接种到新的pda平板上培养，如此连续转接10代，再接种到含4.5mg/ml草丁膦+400μg/ml萎锈灵的pda平板上，28℃，恒温黑暗培养，记录插入突变子菌落生长情况（曾大兴等2005）。试验结果表明，经过转代10次驯化后的插入突变子仍旧可以在含草丁膦和萎锈灵的pda平板上正常生长，说明淡紫紫孢菌的插入突变子在无性繁殖过程中，bar和抗萎锈灵基因并未丢失，具有较高的遗传稳定性。

实施例2：淡紫紫孢菌菌株pt362对番茄灰霉病菌的拮抗效果（pda平板）

淡紫紫孢菌/番茄灰霉病菌制备：用直径0.5cm的打孔器在玻璃培养皿上已生长满菌丝的淡紫紫孢菌/番茄灰霉病菌菌落边缘打孔，用接种针将菌块接入到已冷却的平板中，28℃培养、待用。

pda平板制备：将融好的pda培养基冷却到30℃左右，倒平板。静置1～2h。

接种：用直径0.5cm的打孔器在玻璃培养皿上已生长3d的番茄灰霉病菌菌丝边缘打孔，用接种针将菌块接入到已冷却的平板中(十字交叉法)。淡紫紫孢菌接种于平板中间，25℃培养、观察、统计抑制效果。结果见图1，（a：灰霉菌；b：原始菌株和灰霉菌拮抗效果；c：突变菌株pt362和灰霉菌的拮抗效果。）可以看出淡紫紫孢菌对番茄灰霉病菌有强烈的抑制作用。

实施例3：淡紫紫孢菌菌株pt362代谢产物对灰霉病菌的拮抗效果

淡紫紫孢菌发酵液制备：在装有150mlpdb培养基的250ml三角瓶中接入直径0.5cm的淡紫紫孢菌菌块，28℃，200r/min摇床培养，培养6d。取发酵液，10000r/min离心15min，取上清液用细菌过滤器过滤。所得到的液体即为原液。用无菌水稀释把原液稀释8倍。

接种：用选用叶龄相同、大小一致的健康叶片，用无菌水洗净、备用。将番茄叶片浸泡在上述不同浓度的发酵液里20分钟左右。在叶片中间接种1个直径为0.5cm的灰霉病菌菌块，25℃保湿培养3天。观察发病情况，统计发病率，计算病情指数。

病情指数(%)=[(对照发病面积-处理发病面积)/对照发病面积]×100%

结果见图2，其中左图为空白对照组，中图为原液拮抗组，右图为稀释8倍拮抗组，可以看出淡紫紫孢菌的浓度越高，灰霉病菌生长的菌块越小，受到的拮抗作用越强。