一种从妇女尿液中提取多种尿蛋白的方法与流程

本发明属于医药领域，具体涉及一种从妇女尿液中提取多种尿蛋白的方法。

背景技术：

促卵泡激素(Follicle-stimulating hormone，FSH，亦称为卵泡刺激素)是一种由脑垂体合成并分泌的激素，属于糖基化蛋白质激素，因最早发现其对女性卵泡成熟的刺激作用而得名。后来的研究表明，促卵泡激素在男女两性体内都是很重要的激素之一，调控着发育、生长、青春期性成熟、以及生殖相关的一系列生理过程。促卵泡激素和黄体化激素在生殖相关的生理过程中协同发挥着至关重要的作用。

黄体生成素又称促黄体素(Luteotropic hormone，LH)，垂体前叶嗜碱性细胞所分泌的激素，为糖蛋白，分子量约30000，由a和b两个亚基肽链以共价键结合而成。在有促卵泡激素存在下，与其协同作用，刺激卵巢雌激素分泌，使卵泡成熟与排卵，使破裂卵泡形成黄体并分泌雌激素和孕激素，刺激睾丸间质细胞发育并促进其分泌睾酮，故又称间质细胞促进素。

尿激酶(Urokinase，UK)为从健康人尿中分离的，或从人肾组织培养中获得的一种酶蛋白，由分子量分别为33000(LMW-tcu-PA)和54000(HMW-tcu-PA)两部分组成。尿激酶直接作用于内源性纤维蛋白溶解系统，能催化裂解纤溶酶原成纤溶酶，后者不仅能降解纤维蛋白凝块，亦能降解血循环中的纤维蛋白原、凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷ等，从而发挥溶栓作用。尿激酶对新形成的血栓起效快、效果好；还能提高血管ADP酶活性，抑制ADP诱导的血小板聚集，预防血栓形成。尿激酶在静脉滴注后，患者体内纤溶酶活性明显提高；停药几小时后，纤溶酶活性恢复原水平。

妇女尿液尤其是绝经妇女尿液中含有较高含量尿蛋白，如促卵泡激素，黄体生成素以及尿激酶等。传统的提取生产工艺中，只从绝经妇女尿液中提取促卵泡激素或/和黄体生成素粗品，再经深加工制成尿促性素或尿促卵泡素等原料药用于治疗不孕不育症，如CN 102464713A、CN 1262278A、CN 1415628A等中公开的方法。然而上述方法中其中大量的尿激酶等其他蛋白质均作为杂质而存在于废尿液中，既浪费了经济效益又污染环境。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种从妇女尿液尤其是绝经妇女尿液中提取多种尿蛋白的方法。本发明的提取方法可以同时从妇女尿液中提取尿激酶，促卵泡激素和黄体生成素等尿蛋白，实现了经济效益和环境保护的双重目的。

为达上述目的，本发明采用如下技术手段：

一种从妇女尿液中提取多种尿蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)将尿液浓缩后调节pH至10-11，例如为10.2、10.5、10.8等；该步骤中浓缩是为了除去尿液中的无机盐和大部分水；且由于尿激酶等蛋白质属于碱性蛋白，其等电点大约在10-11之间，因此会从溶液中沉淀出来，而酸性的促卵泡激素和黄体生成素均存在于溶液中；可见该pH范围可以更好地使尿激酶等属于碱性的蛋白质完全分离出来；

(2)向步骤(1)所得溶液中加入硅藻土后过滤，所得硅藻土滤渣经处理得到较高纯度的尿激酶粗品；所得硅藻土滤渣中含有大量尿激酶粗品，加入硅藻土则有利于将尿激酶过滤出来；

(3)将步骤(2)过滤后的滤液调节pH至5-6，例如为5.3、5.6、5.9等，然后将促卵泡激素和黄体生成素等酸性蛋白进行沉淀，加入硅藻土处理后得到促卵泡激素和黄体生成素粗品。该步骤中的pH范围可以更好地使促卵泡激素和黄体生成素完全分离出来。

本发明的方法利用蛋白质等电点不同将妇女尿液中不同蛋白质进行分离，首先将尿液过滤、浓缩，然后调节pH至强碱性使碱性蛋白质如尿激酶等沉淀，过滤；然后调节pH至酸性使卵泡刺激素和黄体生成素等蛋白沉淀，得到尿激酶和卵泡刺激素和黄体生成素等粗品，且均满足粗品质量标准。如果步骤(1)、(3)中的pH调节值不在本发明的范围内，则尿激酶与其他杂蛋白无法分开，无法完成本发明的工艺。

本发明通过技术革新，在传统的从尿液中提取促卵泡激素和黄体生成素的同时，通过超滤浓缩，pH调节等技术手段，从尿中提取尿激酶，既实现了废尿的回收利用，又提高了经济效益。

作为优选，步骤(1)中所述尿液为绝经妇女尿液。

优选地，将尿液浓缩之前除去尿液中不溶性物质和可见杂质。

优选地，将尿液经密闭过滤机预过滤除去其中不溶性物质和可见杂质。

优选地，所述浓缩为浓缩至原体积的1/50-1/200，例如为1/60、1/66、1/75、1/90、1/110、1/130、1/150、1/175、1/185、1/196等，优选为1/100。

优选地，所述浓缩为超滤浓缩，优选在超滤浓缩罐中进行。

优选地，调节pH通过加入氢氧化钠溶液进行。

优选地，所述氢氧化钠溶液的质量浓度为10-40％，例如为13％、16％、19％、23％、27％、33％、38％等，优选为20％。

作为优选，步骤(2)中加入硅藻土后搅拌，优选搅拌10分钟以上，例如为13分钟、19分钟、25分钟、33分钟、40分钟、50分钟等，进一步优选搅拌30分钟。

优选地，所述处理为将硅藻土滤渣溶解，经乙醇沉淀，脱水，干燥。

作为优选，步骤(3)中所述调节通过加入冰醋酸进行。

优选地，将促卵泡激素和黄体生成素进行沉淀通过加入有机溶剂进行。

优选地，所述有机溶剂为乙醇或/和丙酮。

优选地，加入硅藻土后搅拌、抽滤，再经脱水、干燥等工艺得到促卵泡激素和黄体生成素粗品。

优选地，所述搅拌的时间为10分钟以上，优选为30分钟。

作为优选，本发明所述的方法包括以下步骤：

(1)将收集的新鲜尿液经密闭过滤机预过滤除去其中不溶性物质和可见杂质，打入超滤浓缩罐；

(2)将尿液进行超滤浓缩，以除去尿液中的无机盐和大部分水，浓缩至原体积的1/100；

(3)将超滤浓缩后的浓缩尿打入反应罐，用20％氢氧化钠溶液调节溶液pH为10-11，由于尿激酶等蛋白质属于碱性蛋白，其等电点在10-11之间，因此会从溶液中沉淀出来，而酸性的促卵泡激素和黄体生成素均存在于溶液中；

(4)向溶液中加入硅藻土，搅拌30分钟后进行过滤，滤液打入另一反应罐，硅藻土滤渣中含有大量尿激酶粗品，再经溶解，乙醇沉淀，脱水，干燥等工艺步骤得到较高纯度的尿激酶粗品；

(5)向过滤后的滤液中加入冰醋酸调节pH为5-6，再加入乙醇或丙酮将促卵泡激素和黄体生成素等酸性蛋白进行沉淀，加入硅藻土搅拌30分钟后进行抽滤，再经脱水、干燥等工艺步骤得到促卵泡激素和黄体生成素粗品。所得产品均可以很好地满足粗产品质量标准。

本发明提供的从妇女尿液中提取多种尿蛋白的方法，通过超滤，pH调节等工艺步骤，从妇女尿液尤其是绝经妇女尿液中提取了尿激酶，促卵泡激素和黄体生成素等尿蛋白，且均满足粗品质量标准，实现了经济效益和环境保护的双重目的。

具体实施方式

为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

一种从妇女尿液中提取多种尿蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)将收集的新鲜绝经妇女尿液约20000L经密闭过滤机预过滤除去其中不溶性物质和可见杂质，打入超滤浓缩罐；

(2)超滤浓缩至约200L；

(3)将超滤浓缩后的浓缩尿打入反应罐，用20％氢氧化钠溶液调节溶液pH为10-11，向溶液中加入硅藻土，搅拌30分钟后过滤，滤液打入另一反应罐，回收硅藻土滤渣。经乙醇脱水，干燥得尿激酶粗品120g；

(4)向过滤后的滤液中加入冰醋酸调节pH为5-6，再加入乙醇或丙酮将促卵泡激素和黄体生成素等酸性蛋白进行沉淀，加入硅藻土搅拌30分钟后进行抽滤，再经脱水、干燥得粗品3450g。

经检测，尿激酶粗品比活为65000IU/mg蛋白质，促卵泡激素免疫效价为0.56IU/mg，均满足粗品质量标准。

实施例2

一种从妇女尿液中提取多种尿蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)将收集的新鲜绝经妇女尿液约20000L经密闭过滤机预过滤除去其中不溶性物质和可见杂质，打入超滤浓缩罐；

(2)超滤浓缩至约400L；

(3)将超滤浓缩后的浓缩尿打入反应罐，用40％氢氧化钠溶液调节溶液pH为10.0，向溶液中加入硅藻土，搅拌10分钟后过滤，滤液打入另一反应罐，回收硅藻土滤渣，经乙醇脱水，干燥得尿激酶粗品119g；

(4)向过滤后的滤液中加入冰醋酸调节pH为5.0，再加入乙醇或丙酮将促卵泡激素和黄体生成素等酸性蛋白进行沉淀，加入硅藻土搅拌20分钟后进行抽滤，再经脱水、干燥得粗品3445g。

经检测，尿激酶粗品比活为68000IU/mg蛋白质，促卵泡激素免疫效价为0.57IU/mg，均满足粗品质量标准。

实施例3

一种从妇女尿液中提取多种尿蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)将收集的新鲜绝经妇女尿液约20000L经密闭过滤机预过滤除去其中不溶性物质和可见杂质，打入超滤浓缩罐；

(2)超滤浓缩至约100L；

(3)将超滤浓缩后的浓缩尿打入反应罐，用10％氢氧化钠溶液调节溶液pH为11.0，向溶液中加入硅藻土，搅拌20分钟后过滤，滤液打入另一反应罐，回收硅藻土滤渣，经乙醇脱水，干燥得尿激酶粗品121g；

(4)向过滤后的滤液中加入冰醋酸调节pH为6.0，再加入乙醇或丙酮将促卵泡激素和黄体生成素等酸性蛋白进行沉淀，加入硅藻土搅拌40分钟后进行抽滤，再经脱水、干燥得粗品3452g。

经检测，尿激酶粗品比活为67000IU/mg蛋白质，促卵泡激素免疫效价为0.58IU/mg，均满足粗品质量标准。

实施例4

一种从妇女尿液中提取多种尿蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)将收集的新鲜绝经妇女尿液约20000L经密闭过滤机预过滤除去其中不溶性物质和可见杂质，打入超滤浓缩罐；

(2)超滤浓缩至约300L；

(3)将超滤浓缩后的浓缩尿打入反应罐，用30％氢氧化钠溶液调节溶液pH为10.5，向溶液中加入硅藻土，搅拌40分钟后过滤，滤液打入另一反应罐，回收硅藻土滤渣，经乙醇脱水，干燥得尿激酶粗品122g；

(4)向过滤后的滤液中加入冰醋酸调节pH为5.5，再加入乙醇或丙酮将促卵泡激素和黄体生成素等酸性蛋白进行沉淀，加入硅藻土搅拌10分钟后进行抽滤，再经脱水、干燥得粗品3455g。

经检测，尿激酶粗品比活为63000IU/mg蛋白质，促卵泡激素免疫效价为0.55IU/mg，均满足粗品质量标准。

对比例1

操作条件同实施例2中的，除了步骤(3)中的pH调节为9.5，步骤(4)中的pH调节为4.5。

经检测，尿激酶粗品比活为12100IU/mg蛋白质，促卵泡激素免疫效价为0.08IU/mg，均无法满足粗品质量标准。

对比例2

操作条件同实施例3中的，除了步骤(3)中的pH调节为11.5，步骤(4)中的pH调节为6.5。

经检测，尿激酶粗品比活为9800IU/mg蛋白质，促卵泡激素免疫效价为0.06IU/mg，均无法满足粗品质量标准。

对比例3

操作条件同实施例4中的，除了步骤(3)中的pH调节为11.5。

经检测，尿激酶粗品比活为14000IU/mg蛋白质，促卵泡激素免疫效价为0.09IU/mg，均无法满足粗品质量标准。

对比例4

操作条件同实施例4中的，除了步骤(4)中的pH调节为4。

经检测，尿激酶粗品比活为63500IU/mg蛋白质，促卵泡激素免疫效价为0.05IU/mg，促卵泡激素免疫效价无法满足粗品质量标准。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。