本发明涉及酶制品稳定性的检测，具体涉及一种mtgase稳定性的检测方法，属于酶学性质及分离纯化领域。
背景技术：
谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase，简称tgase，ec2.3.2.13)是一种催化酰基转移的转移酶，可催化蛋白质分子内和分子间ε-(γ-glutaminyl)lysine共价键的形成，从而催化蛋白质分子内、分子间发生交联，进而改变蛋白质的性质和功能。谷氨酰胺转氨酶广泛存在于植物、动物和微生物中。而微生物来源的谷氨酰胺转胺酶(microbialtransglutaminase,mtgase)相对于动植物来源的tgase，具有非钙离子依赖性、底物特异性低、成本低等特点，使得mtgase在各个领域得到广泛的应用，如应用于肉制品、水产制品、乳制品、植物蛋白等食品加工方面，主要是改变食品的机械性能、持水性、口感等性能。近年来，mtgase在纺织领域及生物医学领域也有着越来越广泛的应用，如mtgase被大量用于蛋白质或多肽与小分子、聚合物、化学材料、dna及其他蛋白等物质的结合。很多研究者利用mtgase的交联性质，对治疗药物蛋白进行位点特异性修饰等。在纺织工业中，mtgase多用于羊毛织物的处理，还用于牛仔服饰的做旧处理等；羊毛中含有谷氨酰胺和赖氨酸残基，添加tgase可以减少加工过程中的纤维损伤和褪色情况。
mtgase由于其化学本质为蛋白质，其本身在生产、销售和应用过程容易受各种因素影响而使酶活降低，所以在工业上提高mtgase的稳定性是所要解决的重大问题，需要在每个生产环节做到严格的把控。有学者致力于优良菌株的筛选，从而得到产稳定性较好的菌株；有学者则致力于菌株发酵工艺的优化，从而得到稳定的发酵工艺，减小发酵过程中的不稳定因素对mtgase稳定性的影响；有学者致力于发酵后工艺的优化，在发酵后处理中加入不同的稳定剂来保护mtgase，研究表明添加合适糖类、盐离子、氨基酸等物质可以提高mtgase的稳定性，从而减小发酵后处理对mtgase的影响；同时也有学者致力于mtgase长期稳定保存的研究，如降低保存温度，调节液体mtgase产品在合适的ph值，添加保护剂来增加mtgase的稳定性，延长保质期(专利公开号：cn104024406a、cn105462950a、cn1684593)。
尽管很多学者对于mtgase的稳定性做了很多研究，但是在实际的生产和应用中仍然存在很多问题，如：(1)由于发酵工艺的不稳定，造成每批次发酵得到的mtgase稳定性存在一定差异；(2)mtgase本身为蛋白质，即使在发酵后处理、运输过程中严格控制操作环节，其稳定性仍然会受到外界不稳定因素的影响；(3)医药领域对mtgase的纯度、稳定性等方面有着严格的要求，mtgase的精细纯化过程可能会对mtgase的稳定性有影响，需要严格精确的稳定性鉴定方法来对符合要求的mtgase进行筛选；(4)目前mtgase粉末制剂虽然已经实现规模化生产，但生物酶制剂及各工业领域在向液体剂型发展，而液体状态下mtgase的稳定性相对于固体状态更不稳定，使得鉴定液体mtgase的稳定性成为更加关注的问题。
据文献报道，由于蛋白质在折叠组装时的差异，同种蛋白质会存在不同的同分异构体，特别是生物医学领域所用到的抗体，不同的同分异构体抗体蛋白会有明显的性质差异，所以会对蛋白的同分异构体进行分离。通过我们的实验发现，mtgase也存在同分异构体，用阳离子交换层析方法进行ph梯度洗脱可以将mtgase的同分异构体进行分离。经过酶学性质检测发现，mtgasei1和mtgasei2在温度稳定性、ph稳定性、保存稳定性等方面存在显著的差异。
目前还没有办法完全避免mtgase稳定性的差异，因此，寻找一种可以快捷、准确、高灵敏度的检测mtgase稳定性的方法至关重要，可以对发酵过程、发酵后处理环节、精细纯化环节生产得到的mtgase进行稳定性检测，一方面是对发酵过程的监控，一方面可以确定出厂的样品稳定性的大小，从而更好的指导客户进行使用。不同领域的客户也可以用该方法检测他们购买得到的mtgase的稳定性的高低，从而选择适合其自身产品的mtgase。在工厂生产mtgase的过程中，对mtgase只是进行简单的功能性检测。现有技术中还没有快捷、准确、灵敏度高的mtgase检测方法，可以测定mtgase的稳定性。
技术实现要素：
本发明的目的在于结合离子交换分离方法，提供一个简单、快捷、灵敏度高的检测mtgase稳定性的方法。从而实时监控检测mtgase稳定性，建立更加严格的mtgase稳定性检测方法。
本发明提出的微生物谷氨酰胺转胺酶mtgase稳定性的检测方法，包括以下步骤：
(1)mtgase溶液的制备
将mtgase溶解在缓冲液中，调节溶液ph为5.0-6.0之间，离心收集，得到mtgase上清液；
本发明中，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液、醋酸盐缓冲液；优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
本发明中，所述缓冲液的浓度为15-50mm；优选地，为15-30mm；进一步优选地，为20mm。
本发明中，所述mtgase的ph为5.0-6.0之间。所述mtgase的ph条件对其稳定性的鉴定起决定作用，要严格控制在所述ph5.0-6.0范围内。
本发明中，所述mtgase终酶活浓度为3.0～30u/ml；优选地，为3.0～10u/ml；进一步优选地，为3.0-5.0u/ml；进一步优选地，3.0u/ml、5.0u/ml。
本发明中，离心的条件可以采用常规的离心条件即可，包括但不限于是8000r/mim离心10～15min；优选地，8000r/mim离心10min。
本发明中，所述离心的温度为4-20℃；优选地，为4℃。
本发明中，所述mtgase可以但不限于是由茂源链霉菌所产的mtgase。
本发明中，mtgase的存在形式可以是未经处理的发酵液，或为商品化的mtgase(如市面上购买的任何茂源链霉菌来源的mtgase，或精细纯化后高纯度的用于医药领域的茂源链霉菌来源的mtgase)。
本发明中，若mtgase的存在形式为未经处理的微生物发酵液时，则可先将发酵液离心，收集上清，然后再溶解在缓冲液中，调节溶液ph为5.0-6.0之间，离心收集上清。或，先用预冷的无水乙醇处理发酵液，静置后，离心收集沉淀，得到mtgase的粗提物(或，再进行冷冻干燥，得到固体制剂的mtgase)，然后再溶解在缓冲液中，调节溶液ph为5.0-6.0之间，离心收集上清。
其中，所述无水乙醇与发酵液的体积比为1:1。
其中，所述静置的时间为0.5-1.5h，优选地为，1h。
其中，各步骤所述离心的条件可以但不限于是8000r/mim离心10～15min；优选地，8000r/mim离心10min。
(2)离子交换层析
将步骤(1)制备得到的mtgase上清液进行离子交换层析。
本发明中，所述离子交换层析为阳离子交换层析；如可以选用的阳离子交换层析纯化柱型号为hitrapspsepharosefastflow(1ml)。
本发明中，所述离子交换层析中采用的平衡缓冲液选自磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液、醋酸盐缓冲液；优选地，所述缓冲液磷酸盐缓冲液。
本发明中，所述离子交换层析中采用的平衡缓冲液的浓度为15-50mm；ph为5.0-6.0。
本发明中，所述离子交换层析中采用的洗脱缓冲液选自磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液、醋酸盐缓冲液；优选地，所述缓冲液磷酸盐缓冲液。
本发明中，所述离子交换层析中采用的洗脱缓冲液的浓度为15-50mm；ph为8.0-9.0。
本发明中，所述平衡缓冲液、样品以及洗脱缓冲液的流速为0.5-2.0ml/min；优选地，为1ml/min。
本发明中，所述平衡缓冲液、洗脱缓冲液及酶制品均用滤膜过滤除菌，如采用0.22μm的滤膜过滤除菌。
本发明中，所述分离洗脱方法为，用线性洗脱的方式收集洗脱峰；所述离子交换层析中采用的洗脱缓冲液的体积百分比变化为0-100％；即，所述线性洗脱是指随着时间的推移，洗脱缓冲液的体积百分比匀速地从0％增加到100％。
本发明中，所述洗脱缓冲液的体积为20-70个柱体积。
本发明中，所述ph变化从起始的5.0-6.0增加到8.0-9.0，所述ph条件对其稳定性的鉴定起决定作用，要严格控制在所述ph变化范围内。
本发明中，所述样品上样的总蛋白量为5-20mg，总酶活为100-300u。
(3)mtgasei2/mtgasei1的比值确定
阳离子交换层析过程中，随着洗脱缓冲液的比例不断增加，洗脱得到的酶液ph不断增加，经ph梯度洗脱分离，可以分离得到mtgase的两个同分异构体(mtgasei1和mtgasei2)，分别根据洗脱峰计算峰积分面积，计算两个同分异构体的峰面积比值。
本发明中，所述同分异构体mtgasei1对应的ph范围为5.0-6.5。
本发明中，所述同分异构体mtgasei2对应的ph范围为6.6-8.0。
本发明中，所述根据mtgasei2/mtgasei1的比值判断mtgase的稳定性。mtgasei2/mtgasei1的比值与mtgase的稳定性呈负相关。
例如，若mtgasei2/mtgasei1的值低于1.5，则mtgase在ph为7.0，温度为37℃条件下保存5天时，保存率大于80％；
若mtgasei2/mtgasei1的值高于2.0，则mtgase在ph为7.0温度为37℃条件下保存5天时，保存率小于60％；
若mtgasei2/mtgasei1的值大于等于1.5，小于等于2.0，则mtgase在ph为7.0，温度为37℃条件下保存5天时，保存率大于等于60％，小于等于80％。
在本发明的一个具体实施方式中，所述mtgase稳定性的检测方法具体操作如下：
(1)mtgase溶液的制备
(i)将茂源链霉菌菌株进行发酵，离心收集上清，用磷酸盐缓冲液调节发酵液ph到5.0-6.0范围；或
(ii)将茂源链霉菌菌株进行发酵，离心收集上清，用预冷的无水乙醇1:1处理，静置1h后，8000r/mim离心15min，收集沉淀，得到mtgase的粗提物，用15-50mmph5.0-6.0的磷酸盐缓冲液溶解，8000r/mim离心15min收集上清；或
(iii)市面上所卖的茂源链霉菌来源的mtgase，用15-50mmph5.0-6.0的磷酸盐缓冲液溶解，8000r/mim离心15min收集上清；或
(iv)精细纯化后高纯度的用于医药领域的茂源链霉菌来源的mtgase，用15-50mmph5.0-6.0的磷酸盐缓冲液溶解，8000r/mim离心15min收集上清。
(2)阳离子交换层析
将步骤(1)所得的mtgase上清液在室温下用aktaavant25纯化系统进行阳离子交换层析，选用的纯化柱型号为hitrapspsepharosefastflow(1ml)，平衡缓冲液为20mmph5.5的磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为20mmph9.0的磷酸盐缓冲液，平衡缓冲液、洗脱缓冲液及样品均用0.22μm的滤膜过滤除菌。
分离洗脱方法为线性洗脱，0-100％洗脱缓冲液，洗脱体积为20-70个柱体积，流速为1ml/min。ph变化为从起始的5.5增加到9.0。样品上样的总蛋白量为5-20mg，总酶活为100-300u。
随着洗脱缓冲液的比例不断增加，ph不断增加，根据ph的变化可以分离得到mtgase的两个同分异构体(mtgasei1和mtgasei2)，分别根据洗脱峰计算峰积分面积，计算两个同分异构体的峰面积比值。
(3)mtgasei2/mtgasei1的比值确定
根据mtgasei2/mtgasei1的比例判断mtgase的稳定性，mtgasei2/mtgasei1的值与mtgase的稳定性呈负相关，可根据实际需要，根据mtgasei2/mtgasei1的值确定所需特定稳定性的mtgase。mtgasei1的温度稳定性和ph稳定性都比mtgasei2高，如图7和图8所示。因此，mtgase中mtgasei2含量越高，mtgase稳定性越低。
本发明还提出了一种mtgase同分异构体的分离方法，所述方法包括：
(1)mtgase溶液的制备
将mtgase溶解在缓冲液中，调节溶液ph为5.0-6.0之间，离心收集，得到mtgase上清液。
本发明中，所述离子交换层析中采用的平衡缓冲液选自磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液、醋酸盐缓冲液；所述缓冲液的浓度为15-50mm，优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
本发明中，所述mtgaseph为5.0-6.0。
本发明中，优选地，所述mtgase终酶活浓度为3.0-10u；优选地，为约3.0-5.0u/ml。
本发明中，离心的条件可以但不限于是8000r/mim离心10～15min；优选地，8000r/mim离心10min。
本发明中，所述离心的温度为4-20℃；优选地，为4℃。
本发明中，所述mtgase为由茂源链霉菌所产的mtgase。
本发明中，若mtgase的存在形式可以是未经处理的发酵液，或为商品化的mtgase(如市面上购买的任何茂源链霉菌来源的mtgase，或精细纯化后高纯度的用于医药领域的茂源链霉菌来源的mtgase)。
本发明中，若mtgase的存在形式为未经处理的微生物发酵液时，则可先将发酵液离心，收集上清，然后再溶解在缓冲液中，调节溶液ph为5.0-6.0之间，离心收集上清。或，先用预冷的无水乙醇处理发酵液，静置后，离心收集沉淀，得到mtgase的粗提物(或，再进行冷冻干燥，得到固体制剂的mtgase)，然后再溶解在缓冲液中，调节溶液ph为5.0-6.0之间，离心收集上清。mtgase最终的ph直接影响到其同分异构体的分离，因此，mtgase的ph不能高于6.0，并且出于对mtgase的保护，ph不能低于5，因为mtgase的ph稳定范围在5.0-9.0之间。
其中，所述无水乙醇与发酵液的体积比为1:1。
其中，所述静置的时间为0.5-1.5h，优选地为，1h。
其中，各步骤所述离心的条件可以但不限于是8000r/mim离心10～15min；优选地，8000r/mim离心10min。
(2)离子交换层析
将步骤(1)制备得到的mtgase上清液进行离子交换层析。
本发明中，所述离子交换层析为阳离子交换层析，可以选用的阳离子交换层析纯化柱型号为hitrapspsepharosefastflow的(1ml)。
本发明中，所述离子交换层析中采用的平衡缓冲液选自磷酸盐、tris-hcl缓冲液、醋酸盐缓冲液；所述缓冲液的浓度为15-50mm；优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，ph为5.0-6.0。
本发明中，所述离子交换层析中采用的洗脱缓冲液选自磷酸盐、tris-hcl缓冲液、醋酸盐缓冲液；所述缓冲液的浓度为15-50mm，ph为8.0-9.0。所述洗脱缓冲液的体积百分比变化为0-100％。
本发明中，所述平衡缓冲液、样品以及洗脱缓冲液的流速为0.5-2.0ml/min；优选地，为1ml/min。
本发明中，所述平衡缓冲液、洗脱缓冲液及酶制品均用滤膜过滤除菌，如采用0.22μm的滤膜过滤除菌。
本发明中，所述分离洗脱方法为，用线性洗脱的方式收集洗脱峰；所述线性洗脱是指随着时间的推移，洗脱缓冲液的体积百分比匀速的从0％增加到100％。
本发明中，所述洗脱缓冲液的体积为20-70个柱体积。
本发明中，所述ph变化从起始的5.0-6.0增加到8.0-9.0，所述ph条件对其稳定性的鉴定起决定作用，要严格控制在所述ph变化范围内。
本发明中，所述样品上样的总蛋白量为5-20mg，总酶活为100-300u。
(3)分离mtgase的同分异构体mtgasei1、mtgasei2
随着洗脱缓冲液的比例不断增加，洗脱得到的酶液ph不断增加，当ph范围为5.0-6.5时，收集得到mtgase的同分异构体mtgasei1；当ph范围为6.6-8.0时，收集得到mtgase的同分异构体mtgasei2。
本发明还提出了一种由上述mtgase同分异构体的分离方法分离得到的mtgase的同分异构体mtgasei1和/或mtgasei2，即mtgaseisomer1和/或mtgaseisomer2，分子量均为37.816kda，均与mtgase的分子量相同，n末端四个序列均为asp-ser-asp-glu。其中，所述mtgasei1在相同条件下的热稳定性和ph稳定性均显著高于mtgasei2。
本发明还提出了一种如上所述的mtgase的同分异构体mtgasei1或mtgasei2在催化酰基转移中的应用。
本发明中得到的mtgase稳定性鉴定方法快捷、准确、灵敏度高。便于mtgase的快速筛选，为食品、医药、纺织等领域的mtgase提供了更规范的技术保障。
本发明的有益效果在于：(1)用离子交换层析的方法，根据ph梯度洗脱的方法首次发现并提出mtgase同分异构体，填补了mtgase研究领域理论上的空白，对于了解mtgase的性质至关重要；(2)将mtgasei1与mtgasei2的比例与mtgase的稳定性相结合，得到mtgasei1与mtgasei2的比例与mtgase的稳定性高低的关系，提出了mtgase的稳定性鉴定的新思路，填补了mtgase的稳定性鉴定技术上的空白；(3)本发明方法简单方便、灵敏度高，可以更好的指导实际生产和应用；(4)mtgase近年来广泛应用于医药领域，医药领域对于mtgase的品质有着极其严格的要求，而本发明方法准确性高，灵敏度高，可以对用于医药领域的mtgase进行严格的筛选和控制。
附图说明
图1mtgase离子交换层析色谱图。
图2mtgase离子交换层析结果电泳图。
图3两个不同批次酶粉37℃液体保存酶活保存率。
图4十个不同批次酶粉37℃液体保存酶活保存率。
图5不同起始ph条件下，mtgase同分异构体分离结果。
图6不同缓冲液条件下，mtgase同分异构体分离结果。
图7mtgasei1与mtgasei2热稳定性结果。
图8mtgasei1与mtgasei2ph稳定性结果。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1mtgase同分异构体的分离
(1)将mtgase酶粉溶解于20mmph5.5的磷酸缓冲液中，单位酶活约为3.0u/ml，电导为2.0ms/cm。
(2)室温下，将步骤(1)所得的mtgase用aktaavant25纯化系统进行阳离子交换层析，选用的纯化柱型号为hitrapspsepharosefastflow(1ml)，平衡缓冲液为20mmph5.5的磷酸缓冲液，洗脱缓冲液为20mmph9.0的磷酸盐缓冲液，平衡缓冲液、洗脱缓冲液及样品均用0.22μm的滤膜过滤除菌。
(3)分离洗脱方法为线性洗脱，0-100％洗脱缓冲液，洗脱体积为30个柱体积，流速为1ml/min；洗脱得到的酶液ph从起始的5.5增加到9.0；样品上样总酶活约为150u。
随着洗脱缓冲液的比例不断增加，洗脱得到的酶液ph不断增加，根据ph的变化可以分离得到mtgase的两个同分异构体：mtgasei1和mtgasei2。如图1所示，随着ph的增加，挂柱的蛋白被洗脱缓冲液洗脱下来，在ph5.5-6.5之间出现mtgi1色谱吸收峰，在ph6.6-8.0之间出现mtgi2色谱吸收峰。两个同分异构体的电泳结果如图2所示，可以发现，mtgi1和mtgi2在约38kda处均有mtgase目的条带。可以说明相同条件下，mtgi1和mtgi2所带电荷不同，因此，随着ph的增加可以将mtgase中的两个同分异构体分离开。
实施例2两个不同生产批次mtgase保存稳定性
(1)选取2个不同生产批次的mtgase固体制剂产品，标号分别为20131025批次和20140717批次，其mtgase均来源于茂源链霉菌菌株。
(2)将2个批次mtgase固体制剂分别溶于20mmph7.0的磷酸盐缓冲液中，终酶活浓度约10u/ml，充分搅拌均匀后8000r/min4℃离心10min，收集上清。
(3)用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，保存在无菌的冻存管中，放置在37℃的培养箱中保存。
(4)分别在保存当天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天同一时间点检测mtgase的酶活，计算两个批次mtgase的酶活保存率。
(5)结果如图3所示，可以看到，相同菌株发酵得到的不同批次的mtgase在ph7.037℃条件下保存的结果有很大差异。20131025批次明显比20140717批次稳定性高；在ph7.0条件下，20131025批次的mtgase保存6天时酶活保存率约为94％，而20140717批次的mtgase保存6天时酶活保存率仅为18％；且20131025批号的mtgase保存6天内酶活保存率基本保持稳定，在90％以上，而20140717批次的mtgase的酶活保存率随着时间的增加在逐渐降低。
实施例3两个不同生产批次mtgase酶粉mtgasei2/mtgasei1比值的确定
(1)将20131025批次和20140717批次mtgase酶粉溶解于30mmph5.5的磷酸盐缓冲液中，单位酶活约为5.0u/ml，电导为2.7ms/cm。
(2)室温下，将步骤(1)所得的mtgase用aktaavant25纯化系统进行阳离子交换层析，选用的纯化柱型号为hitrapspsepharosefastflow(1ml)，平衡缓冲液为30mmph5.5的磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为30mmph8.5的磷酸盐缓冲液，平衡缓冲液、洗脱缓冲液及样品均用0.22μm的滤膜过滤除菌。
(3)分离洗脱方法为线性洗脱，0-100％洗脱缓冲液，洗脱体积为30个柱体积，流速为1ml/min；洗脱得到的酶液ph从起始的5.5增加到8.5；样品上样总酶活约为250u。
(4)随着洗脱缓冲液的比例不断增加，洗脱得到的酶液ph不断增加，根据ph的变化可以分离得到mtgase的两个同分异构体(mtgasei1和mtgasei2)，分别根据洗脱峰计算峰积分面积，两个同分异构体的比值结果如下表1。
表1两个不同生产批次mtgase酶粉mtgasei2/mtgasei1的比值
实施例4十个不同生产批次mtgase保存稳定性的研究
(1)选取10个不同生产批次的mtgase固体制剂产品，标号分别为140733、140735、140736、140737、140739、140803、140804、140807、140834，其mtgase均来源于茂源链霉菌菌株。
(2)将10个批次mtgase固体制剂分别溶于20mmph7.0的磷酸盐缓冲液中，终酶活浓度约10u/ml，充分搅拌均匀后8000r/min4℃离心10min，收集上清。
(3)用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，保存在无菌的冻存管中，放置在37℃的培养箱中保存。
(4)分别在保存当天、第5天、第30天同一时间点检测mtgase的酶活，计算两个批次mtgase的酶活保存率。
(5)结果如图4所示，可以看到，相同菌株发酵得到的不同批次的mtgase在37℃条件下保存的结果有很大差异。具体结果酶活结果如表2所示，140733、140803、140804、140833、140834批次mtgase的稳定性明显高于140735、140736、140737、140739、140807批次酶粉(p＜0.05)。保存5天时，前五个批次酶粉酶活保存率在80％以上，而后五个批次酶粉酶活保存率则均低于60％；保存30天时，140733、140803、140804、140833、140834批次酶粉除140804批次外，酶活保存率均在25％以上，而140735、140736、140737、140739、140807批次酶粉酶活保存率几乎为0。
表2十个不同生产批次mtgase酶粉37℃保存结果
实施例5十个不同生产批次mtgase酶粉mtgasei2/mtgasei1比值的确定
(1)将140733、140803、140804、140833、140834、140735、140736、140737、140739、140807十个不同批次mtgase酶粉溶解于20mmph5.3的磷酸盐缓冲液中，单位酶活约为3.0u/ml，电导为2.0ms/cm。
(2)室温下，将步骤(1)所得的mtgase用aktaavant25纯化系统进行阳离子交换层析，选用的纯化柱型号为hitrapspsepharosefastflow(1ml)，平衡缓冲液为20mmph5.3的磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为20mmph9.0的磷酸盐缓冲液，平衡缓冲液、洗脱缓冲液及样品均用0.22μm的滤膜过滤除菌。
(3)分离洗脱方法为线性洗脱，0-100％洗脱缓冲液，洗脱体积为30个柱体积，流速为1ml/min；洗脱得到的酶液ph从起始的5.3增加到9.0；样品上样总酶活约为150u。
(4)随着洗脱缓冲液的比例不断增加，洗脱得到的酶液ph不断增加，根据ph的变化可以分离得到mtgase的两个同分异构体(mtgasei1和mtgasei2)，分别根据洗脱峰计算峰积分面积，两个同分异构体的比例结果如下表3；前五个批次酶粉的mtgasei2/mtgasei1比值在0.9-1.5之间，而后五个批次酶粉的mtgasei2/mtgasei1比值则在2.1-3.1之间，均大于2.0。
结合实施例2、3、4、5发现在ph7.037℃条件下5天时保存率大于80％时，mtgasei2/mtgasei1的值低于1.5，在ph7.037℃条件下5天时保存率小于60％时，mtgasei2/mtgasei1的值高于2.0。
表3十个不同生产批次mtgase酶粉mtgasei2/mtgasei1的比值
实施例6不同起始ph条件下分离mtgase同分异构体
(1)将20140717批次mtgase酶粉溶解于20mmph5.0、ph6.0、ph6.5的磷酸盐缓冲液中，单位酶活约为5.0u/ml，电导为2ms/cm。
(2)室温下，将步骤(1)所得的mtgase用aktaavant25纯化系统进行阳离子交换层析，选用的纯化柱型号为hitrapspsepharosefastflow(1ml)，平衡缓冲液为20mmph5.0、ph6.0、ph6.5的磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为20mmph9.0的磷酸盐缓冲液，平衡缓冲液、洗脱缓冲液及样品均用0.22μm的滤膜过滤除菌。
(3)分离洗脱方法为线性洗脱，0-100％洗脱缓冲液，洗脱体积为30个柱体积，流速为1ml/min；洗脱得到的酶液ph分别从起始的5.0、6.0、6.5增加到9.0；样品上样总酶活为250u。
(4)随着洗脱缓冲液的比例不断增加，洗脱得到的酶液ph不断增加，根据ph的变化可以分离得到mtgase的两个同分异构体(mtgasei1和mtgasei2)，分别根据洗脱峰计算峰积分面积，两个同分异构体的比例结果如下表4、图5所示。从表4、图5可以发现，在起始ph为6.5时无法分离得到mtgase的同分异构体，因为，一方面mtgase在ph6.5条件下mtgasei1基本不与阳离子交换柱结合，另一方面少量mtgasei1在ph6.5条件下即使与柱子结合，由于起始ph条件较高，无法在与ph5.0-6.0相同的洗脱条件下将mtgasei1和mtgasei2分离开来，两峰重叠，只出现一个吸收峰。结果显示，ph5.0-6.0起始条件下，mtgasei2/mtgasei1的比值变化在2.1-2.2之间，实施例3中，ph5.5时，20140717批次酶粉mtgasei2/mtgasei1比值为2.1，均大于等于2.0，与实施例5的结论一致，因此，ph5.0-6.0不影响稳定性的判断结果。
表4不同起始ph条件下mtgase中mtgasei2/mtgasei1的比值
实施例7不同洗脱体积分离mtgase同分异构体
(1)将20140717批次mtgase酶粉溶解于20mmph5.2的磷酸盐缓冲液中，单位酶活约为5.0u/ml，电导为2ms/cm。
(2)室温下，将步骤(1)所得的mtgase用aktaavant25纯化系统进行阳离子交换层析，选用的纯化柱型号为hitrapspsepharosefastflow(1ml)，平衡缓冲液为20mmph5.2的磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为20mmph8.0的磷酸盐缓冲液，平衡缓冲液、洗脱缓冲液及样品均用0.22μm的滤膜过滤除菌。
(3)分离洗脱方法为线性洗脱，0-100％洗脱缓冲液，洗脱体积分别为20、30、50、70个柱体积，流速为1ml/min；洗脱得到的酶液ph从起始的5.2增加到8.0；样品上样总酶活为250u。
(4)随着洗脱缓冲液的比例不断增加，ph不断增加，根据ph的变化可以分离得到mtgase的两个同分异构体(mtgasei1和mtgasei2)，分别根据洗脱峰计算峰积分面积，两个同分异构体的比例结果如下表5。结果显示，20-70cv的洗脱体积条件下，mtgasei2/mtgasei1的比值变化在2.1-2.3之间，实施例3中，ph5.5时，20140717批次酶粉mtgasei2/mtgasei1比值为2.1，均大于等于2.0，与实施例5的结论一致，因此，洗脱体积在20-70cv不影响稳定性的判断结果。
表5不同洗脱体积条件下mtgase中mtgasei2/mtgasei1的比值
实施例8不同缓冲液分离mtgase同分异构体
(1)将20131025批次mtgase酶粉分别溶解于50mmph5.7的磷酸盐、tris-hcl、醋酸缓冲液中，单位酶活约为5.0u/ml。
(2)室温下，将步骤(1)所得的mtgase用aktaavant25纯化系统进行阳离子交换层析，选用的纯化柱型号为hitrapspsepharosefastflow(1ml)，平衡缓冲液分别为20mmph5.7的磷酸盐、tris-hcl、醋酸缓缓冲液，洗脱缓冲液分别为20mmph8.5的磷酸盐、tris-hcl、醋酸缓缓冲液，平衡缓冲液、洗脱缓冲液及样品均用0.22μm的滤膜过滤除菌。
(3)分离洗脱方法为线性洗脱，0-100％洗脱缓冲液，洗脱体积分别为30个柱体积，流速为1ml/min；洗脱得到的酶液ph从起始的5.7增加到8.5；样品上样总酶活为250u。
(4)随着洗脱缓冲液的比例不断增加，ph不断增加，根据ph的变化可以分离得到mtgase的两个同分异构体(mtgasei1和mtgasei2)，如图6所示，分别根据洗脱峰计算峰积分面积，两个同分异构体的比例结果如下表6。结果显示，不同缓冲液条件下，mtgasei2/mtgasei1的比值变化在1.1-1.3之间，实施例3中，ph5.5时，20131025批次酶粉mtgasei2/mtgasei1比值为0.9，均小于等于1.5，与实施例5的结论一致，因此，不同缓冲液不影响稳定性的判断结果。
表6不同缓冲液条件下mtgase中mtgasei2/mtgasei1的比值
本发明的保护内容不局限于以上实施例，在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。