辣椒和番茄细菌性疮痂病菌MLST分子分型方法与流程

本发明涉及植物病原菌分子分型技术，具体涉及用多位点序列分型(mlst)技术对辣椒和番茄细菌性疮痂病菌（bacterialspotcausedbyxanthomonads）进行分型的方法。

背景技术：

辣椒和番茄疮痂病是普遍发生在茄科植物上的一种细菌性病害，该病菌主要危害辣椒和番茄的叶片、茎蔓、果实，尤以叶片上发生普遍。叶片发病初期形成水渍状、黄绿色的小斑点，扩大后变成圆形或不规则形、暗褐色、边缘隆起而中央凹陷的病斑，粗糙呈疮痂状。严重时叶片发黄、干枯、破裂，早期脱落。茎部和果梗发病，初期形成水渍状斑点，逐渐发展成褐色短条斑。病斑木栓化隆起，纵裂呈溃疡状疮痂斑。果实发病，形成圆形或长圆形的黑色疮痂斑。该病害如果防治不及时，不仅大幅降低辣椒和番茄的产量，而且还严重影响辣椒和番茄的果实品质，造成重大经济损失。

目前该病菌已在美国、巴西、澳大利亚、南非、南斯拉夫、墨西哥、哥斯达黎加、阿根廷等全球60多个国家和地区发生，是世界性病害之一。在我国新疆、甘肃、内蒙古、黑龙江、北京、山西等十几个地区也有发生，已引起人们广泛的关注。早在20世纪60年代，dye等（1964）就已经发现辣椒和番茄细菌性疮痂病病原菌存在相当丰富的遗传多样性。2004年jones等将该病菌分成4个种：x.euvesicatoria、x.vesicatoria、x.perforans、x.gardneri。

多位点序列分型(mlst)技术是直接利用5~10个看家基因的核苷酸序列片段之间的碱基差异进行分子分型的方法。看家基因是有保守代谢功能的基因，进化相对缓慢，通过序列中碱基的变化可反映菌株之间的遗传关系和进化关系。在mlst结果分析中，每个单一的核苷酸差异即可视为一个新的等位基因(allele)，把每个来自于同一看家基因的不同等位基因用阿拉伯数字编号，由此使得每个菌株中看家基因的等位基因都有相应的编号，最终可得到该菌株的由一串数字组成的等位基因号码，即该菌株的序列型(sequencetype,st)。将不同菌株的序列型结果采用eburst程序进行分析，则占核心或中心地位的st表示是普遍的，而分支st则是由该核心st衍生出的亲缘sts，这些亲缘sts在遗传学上称为同源复合体(clonalcomplexes,cc)。通过mlst分型不仅可以判断菌株之间的亲缘关系，而且还可以推断它们是否有共同祖先，因此mlst技术被广泛地用于细菌病原菌的分类中。此外，多位点序列分型技术也可用于病原菌株遗传多样性和分子进化研究，构建系统发育树。由于该方法分辨率高，并克服了其他方法存在的不同实验室或实验室内部的结果可比性及重复性较差的缺陷，所以相关数据结果可通过网络实现数据共享和对比。目前，辣椒和番茄细菌性疮痂病菌的多位点序列分型方面的研究还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是建立辣椒和番茄细菌性疮痂病菌的多位点序列分型技术体系，用于辣椒和番茄细菌性疮痂病菌分类鉴定和遗传多样性研究，所要解决的关键问题是该方法所使用的看家基因筛选确定、引物的设计、pcr反应体系和条件的确定。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种辣椒和番茄细菌性疮痂病菌分子分型方法，该方法筛选7个看家基因，并设计引物，采用优化的pcr反应体系和条件进行扩增，用dnaman软件对测序结果进行多序列比对与分析，获得各个菌株序列型(st)，在线采用eburstv3程序进行序列型分析，可将4种病原菌有效区分。

用本发明中筛选的7个看家基因glna、trpb、aroe、glta、petc、adk、leua及设计的7对看家基因的扩增引物，用优化的pcr体系和条件进行扩增，产物采用浓度为1.5%的琼脂糖凝胶进行检测；将扩增产物进行纯化和测序，采用dnaman软件对病原菌株的7个看家基因碱基序列进行序列比对与分析，根据每个看家基因中碱基的差异，将每个看家基因不同的等位基因赋予数字代码，使每个菌株获得了一个由7个看家基因的等位基因号码组成的数字组合的序列型(st)；登陆http://eburst.mlst.net/网站，采用eburstv3程序在线分析，以共享4/7基因标准将4种辣椒和番茄细菌性疮痂病原菌进行有效区分，说明本发明中采用的看家基因、扩增引物、pcr参数均可对辣椒和番茄细菌性疮痂病菌进行mlst分子分型。

本发明所述辣椒和番茄细菌性疮痂病菌分子分型方法，具体步骤如下：

1、细菌基因组dna的提取

按照dna提取试剂盒(离心柱型)说明书步骤，提取细菌基因组dna；

2、看家基因确定

经过预备试验，筛选出细菌7个看家基因glna、trpb、aroe、glta、petc、adk、leua进行本发明试验；

3、看家基因扩增、检测与测序

从ncbi网站上下载辣椒细菌性疮痂病菌菌株xcv85-10的全基因组序列，从中找出上述7个看家基因序列，再用primer5.0软件设计引物(见表1)，用优化的pcr反应体系和条件进行扩增。

表17个看家基因的名称、功能和引物序列

7个看家基因pcr扩增的50μl反应体系如下：

ddh2o36μl

10×pcrbuffer(mg²⁺)5μl

dntps(2.5mm)4μl

primer(＋)(10μm)1μl

primer(－)(10μm)1μl

taqdna聚合酶(5u/μl)1μl

dna模板(10~50ng/μl)2μl

pcr反应条件为：预变性温度95℃，5min；变性温度95℃，30s；退火温度60℃，30s；延伸温度72℃，30s；一共32个循环，最后延伸的温度是72℃，5min；

检测与测序：pcr扩增后的产物采用浓度为1.5%的琼脂糖凝胶进行检测，缓冲液为1×taebuffer、电压为90v的条件下电泳30min，染色30min，拍照，对扩增产物进行纯化和测序；

4、数据分析

采用dnaman软件对病原菌株的7个看家基因扩增产物碱基序列进行序列比对与分析，每个基因位点上的特定序列定义为一个等位基因，不同等位基因之间可能有一个或多个碱基差异；根据每个看家基因中碱基的差异，将每个看家基因不同的等位基因赋予数字代码，这样每个菌株在这个看家基因位点上就获得了相应的等位基因号，这样每个菌株都获得了一个由7个看家基因的等位基因号码组成的数字组合，即菌株的序列型(st)。登陆http://eburst.mlst.net/网站，采用eburstv3程序在线分析，将所有菌株的st形成的数字矩阵提交网络，以共享4/7或5/7基因标准进行分析，分别可以获得包含全部菌株的种群遗传关系图谱。

本发明所述辣椒和番茄细菌性疮痂病菌分子分型方法，在共享4/7基因标准时所有菌株被分为4个亚群，依据标准菌株所在亚群分析可知，group1属于xanthomonaseuvesicatoria，标准菌株为icmp98；group2组属于x.perforans，标准菌株为icmp16690，group3组属于x.vesicatoria，标准菌株为icmp63；group4组属于x.gardneri，标准菌株为icmp16689，该分群结果把4种辣椒和番茄细菌性疮痂病菌有效地区分开。

本发明具有以下有益效果：

本发明经过反复试验，筛选确定了7个看家基因组合，设计引物进行pcr扩增，用dnaman软件对测序结果进行多序列比对与分析，获得菌株序列型(st)，在线采用eburstv3程序进行序列型分析，有效地将4种病原菌区分开来，并确定了病原菌的核心型st，即祖先型菌株。本发明方法可用于辣椒和番茄细菌性疮痂病菌分类鉴定和遗传多样性研究，目的是解决该病菌因分类和变异情况较复杂给实际工作中带来一些问题，研究探讨辣椒和番茄细菌性疮痂病菌群体遗传结构及亲缘关系，为从遗传进化的角度去认识辣椒和番茄细菌性疮痂病菌，从分子水平对它们进行分类与鉴定，进一步开展该病菌致病力分析与致病机理研究，发展分子检测技术、改进育种策略等提供科学依据。

附图说明

图1是用本发明确定的看家基因之一glna的引物进行pcr扩增结果。图中：从左至右的电泳带依次为：1-marker、2-24为病原菌。

图2为基于4/7基因标准的eburstv3程序分析病原菌种群遗传结构及关系图(每个圆点代表一个st，图中心处的圆点为祖先型st)

具体实施方式：

实施例1

1、细菌基因组dna的提取

按照dna提取试剂盒(离心柱型)说明书步骤，提取细菌基因组dna。

2、看家基因确定

经过预备试验，筛选出细菌7个看家基因glna、trpb、aroe、glta、petc、adk、leua进行本发明试验。

3、看家基因扩增、检测与测序

从ncbi网站上下载辣椒细菌性疮痂病菌菌株xcv85-10的全基因组序列，从中找出上述7个看家基因序列，再用primer5.0软件设计引物(见下表)，用优化的pcr反应体系和条件进行扩增。

7个看家基因的名称、功能和引物序列

7个看家基因pcr扩增的50μl反应体系如下：

ddh2o36μl

10×pcrbuffer(mg²⁺)5μl

dntps(2.5mm)4μl

primer(＋)(10μm)1μl

primer(－)(10μm)1μl

taqdna聚合酶(5u/μl)1μl

dna模板(10~50ng/μl)2μl

pcr反应条件为：预变性温度95℃，5min；变性温度95℃，30s；退火温度60℃，30s；延伸温度72℃，30s；一共32个循环，最后延伸的温度是72℃，5min。

检测与测序：pcr扩增后的产物采用浓度为1.5%的琼脂糖凝胶进行检测(见图1)，缓冲液为1×taebuffer、电压为90v的条件下电泳30min，染色30min，拍照，扩增产物送至华大基因北京公司进行纯化和测序。

4、数据分析

采用dnaman软件对病原菌株的7个看家基因扩增产物碱基序列进行序列比对与分析，每个基因位点上的特定序列定义为一个等位基因，不同等位基因之间可能有一个或多个碱基差异。根据每个看家基因中碱基的差异，将每个看家基因不同的等位基因赋予数字代码，这样每个菌株在这个看家基因位点上就获得了相应的等位基因号，这样每个菌株都获得了一个由7个看家基因的等位基因号码组成的数字组合，即菌株的序列型(st)。登陆http://eburst.mlst.net/网站，采用eburstv3程序在线分析，将所有菌株的st形成的数字矩阵提交网络，以共享4/7或5/7基因标准进行分析，分别可以获得包含全部菌株的种群遗传关系图谱。

在共享4/7基因标准时所有菌株被分为4个亚群，依据标准菌株所在亚群分析可知，group1属于xanthomonaseuvesicatoria，标准菌株为icmp98；group2组属于x.perforans，标准菌株为icmp16690，group3组属于x.vesicatoria，标准菌株为icmp63；group4组属于x.gardneri，标准菌株为icmp16689，该分群结果把4种辣椒和番茄细菌性疮痂病菌有效地区分开。