本发明涉及病原微生物检测
技术领域：
：，具体说是涉及一种快速检测产肠毒素大肠杆菌st-ii毒素的lamp检测试剂盒。
背景技术：
：：大肠杆菌为肠道中最常见的一类细菌。依据它的致病性大致可分为：肠致病性大肠杆菌（enteropathogenice.coli，epec），侵袭性大肠杆菌（enteroinvasivee.coli，eiec）、产毒素性大肠杆菌（enterotoxigenice.coli，etec）、肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagice.coli，ehec/stec）及粘附性大肠埃希菌（enteroaggregativee.coli，eaec）。其中etec可产生不耐热性肠毒素（heatlabileenterotoxin，lt）和耐热性肠素（heatstableenterotoxin，st），从而导致人或是牲畜出现严重的腹泻。目前对产肠毒素大肠杆菌的检测方法有传统的检测方法和基因检测方法。传统的检测方法主要依赖于生理生化鉴定和毒素试验，生理生化试验参照gb4789.3进行，毒素试验是判断大肠杆菌致病性的重要指标。在检测毒素时，常用的方法是家兔结扎回肠试验、乳鼠灌胃试验和双向琼脂扩散试验，然而这些传统的检测方法费时费力，操作复杂，已不能满足基层和临床中及时、灵敏、快速的检测要求，不利于疾病的预防。基因检测技术主要是聚合酶链式反应（pcr），pcr技术是一种利用dna聚合酶在体外大量扩增靶序列的技术，该技术是病原检测最常规的方法之一，广泛应用于病原鉴定，变异检测等分子生物学研究。pcr检测技术灵敏度高、特异性强，已成为病原检测的重要技术之一，主要包括常规pcr、巢式pcr、和实时荧光定量pcr等，但该技术需要依靠昂贵的pcr仪器设备，不利于基层生产上推广应用。环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification,lamp）技术是由日本科学家开发的一种新颖的简便、快速、高效及廉价的核酸体外扩增技术。该技术针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在等温条件下，通过bstdna聚合酶的链置换作用，短时间内便使得产物得到大量扩增，扩增产物加入荧光染料sybrgreeni后，阳性结果变为绿色，阴性无变化，可通过肉眼直接观察。与常规pcr相比，该技术不需要模板的热变性，温度循环、电泳及紫外观察等过程，反应速度更快。因其具有特异性强、灵敏度高、设备简单、扩增效率高以及产物检测简便等特点，尤为适合基层和现场病原检测工作的需求。近年来，关于lamp技术的研究已经取得了较大的进展，已经在细菌检测、病毒检测、寄生虫检测、真菌和支原体检测、动物胚胎性别鉴定、转基因食品检测以及肿瘤基因检测中广泛应用。本发明采用环介导等温扩增技术，建立了快速检测st-ii型产肠毒素大肠杆菌的方法，提高了检测效率以及灵敏性，为基层准确检测产肠毒素大肠杆菌提供了可能。技术实现要素：本发明提供了一种st-ii型产肠毒素大肠杆菌的lamp检测试剂盒，目的是实现对产肠毒素大肠杆菌进行特异、快速、简便的现场检测，改善原有检测技术繁琐、费时的弊端。本发明所采用的技术方案是：1.lamp引物的设计从genbank检索获得产肠毒素大肠杆菌耐热肠毒素st-ii基因序列，通过megalign软件进行同源性对比分析，获得一段st-ii毒素基因的保守序列seqno.1，采用primerexplorerv4软件设计了4条特异性lamp检测引物，包括正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物fip和反向内引物bip，引物序列分别为：正向外引物f3：5’-gcaataaggttgaggtgatt-3’；反向外引物b3：5’-gcaaccattatttgggcg-3’；正向内引物fip：5’-tgattgtgtagatgcataggcattatttcttcttgcatctatgttcg-3；反向内内引物bip：5’-tagacaaatagccaaggaaagttgttgctccagcagtaccatc-3；2.根据所得lamp引物配制lamp反应液，构成检测体系，进而组装成一种用于检测产肠毒素大肠杆菌肠毒素st-ii的lamp试剂盒。本发明的一种st-ii型产肠毒素大肠杆菌的lamp检测试剂盒，其包含如下组分：（1）反应液i（23μl）：10×thermopolbuffer2.5μl；2.5mmdntpmix1～6μl；25mmmgcl20～3μl；8μl/ulbstdna酶0.2～1.2μl；10μm正向外引物f30.2～0.7μl；10μm反向外引物b30.2～0.7μl；10μm正向内引物fip2～5μl；10μm反向内引物bip2～5μl、其余为灭菌超纯水；（2）阳性dna（2μl）：待测样品dna；（3）显色液（1μl）：sybrgreeni。本发明中，10×thermopolbuffer含有200mmph值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐（tris-hcl）、100mm氯化钾（kcl）、100mm硫酸铵（（nh4）2so4）、20mm硫酸镁（mgso4）及1％曲拉通x-100（triton-100）。本发明中，显色液sybrgreeni为1000×sybrgreeni。进一步优选的，所述lamp反应液i（23μl）组成为：10×thermopolbuffer2.5μl；10mm的dntps4μl；25mm的mgcl21μl；8μl/μl的bstdna酶0.6μl；10μm的正向外引物f30.5μl；10μm的反向外引物b30.5μl；10μm的正向内引物fip2μl；10μm的反向内引物bip2μl，灭菌超纯水9.9μl。此外，本发明还公开了采用上述试剂盒的使用方法，该方法包括如下步骤：包括如下步骤：（a）dna的提取：采用煮沸法提取dna，取1ml细菌培养物，12000r/min离心5min；加入100μl超纯水，混匀，100℃煮沸，迅速转移至-20℃冷冻5min，然后4℃12000r/min离心5min，取上清，即为待测样品中的dna；（b）lamp扩增：配置23μl反应液，取2μl待测样品dna与反应液混匀，组成25μl反应体系；取1μlsybrgreen滴加在反应管盖内侧，小心操作以免染料掉入反应体系内；将反应管置于60℃～63℃恒温水浴45min进行lamp扩增，85℃加热5min灭活酶的活性；（c）取出反应管进行结果判断：倒置反应管，混匀显色液和反应液，若颜色为绿色，则样品中含有st-ii型产肠毒素大肠杆菌，若颜色为橘黄色，则样品中不含有st-ii型产肠毒素大肠杆菌。与现有的技术相比，本发明具有如下的优点及效果：1．特异性强：所检测的阴性对照细菌均无阳性结果出现，与pcr结果相一致。2．灵敏度高：普通pcr检测最低限度为500pg/μl，而采用本发明检测方法，检测限最低可达到500fg/μl，是普通pcr的1000倍。3．时效性强：普通pcr检测整个过程在2～4小时左右才能得出结果，而采用本发明检测方法，只需1小时左右即可做出判断结果。4．环保无污染：普通pcr结束后还要进行琼脂糖凝胶电泳，使用eb染料等对人和环境会造成损害，而采用本发明检测方法，无需昂贵的pcr仪，只需能够控温的普通水浴锅即可，反应结束后可直接通过肉眼观察反应液颜色变化而直接判定。同时有效地避免了因为开盖造成的气溶胶污染，确保了每次实验结果的准确性，能较好的满足对st-ii型产肠毒素大肠杆菌现场检测的需要。附图说明图1为本发明实施例3中st-ii型产肠毒素大肠杆菌的lamp检测试剂盒的可视化检测图；其中：1是待测样品为st-ii型产肠毒素性大肠杆菌；2待测样品为超纯水；图2为本发明实施例3中st-ii型产肠毒素大肠杆菌的lamp检测试剂盒的电泳图；其中：m.dnamarkerdl2000，1是待测样品为st-ii型产肠毒素性大肠杆菌；2是待测样品为超纯水；图3为本发明实施例4中st-ii型产肠毒素大肠杆菌lamp检测试剂盒特异性试验结果；其中：1-10分别为空白对照，产肠毒素性大肠杆菌，沙门菌，葡萄球菌，鸭疫里默氏杆菌，巴氏杆菌，变形杆菌，猪丹毒杆菌，产气荚膜梭菌，链球菌；图4为本发明实施例5中st-ii型产肠毒素大肠杆菌lamp检测试剂盒灵敏性电泳结果；其中：m、dl2000dnamarker；1-9分别为：空白对照和500ng/μl，50ng/μl，5ng/μl，500pg/μl，50pg/μl，5pg/μl，500fg/μl，50fg/μl浓度的待测样品。图5为本发明实施例5中st-ii型产肠毒素大肠杆菌lamp检测试剂盒灵敏性灵敏性可视化结果；其中：n为阴性对照；1-8分别为500ng/μl、50ng/μl、5ng/μl、500pg/μl、50pg/μl、5pg/μl、500fg/μl、50fg/μl浓度的待测样品。图6为本发明实施例6中st-ii型产肠毒素性大肠杆菌常规pcr方法灵敏性检测结果；其中m.dnamarkerdl2000；1-9分别为阴性对照和500ng/μl、50ng/μl、5ng/μl、500pg/μl、50pg/μl、5pg/μl、500fg/μl、50fg/μl浓度的待测样品具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：下面实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径获得。实施例1lamp引物的设计从genbank检索获得产肠毒素大肠杆菌耐热肠毒素st-ii基因序列，通过megalign软件进行同源性对比分析，获得一段st-ii毒素基因的保守序列seqno.1，采用primerexplorerv4软件设计了4条特异性lamp检测引物，包括正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物fip和反向内引物bip，引物序列分别为：正向外引物f3：5’-gcaataaggttgaggtgatt-3’；反向外引物b3：5’-gcaaccattatttgggcg-3’；正向内引物fip：5’-tgattgtgtagatgcataggcattatttcttcttgcatctatgttcg-3；反向内内引物bip：5’-tagacaaatagccaaggaaagttgttgctccagcagtaccatc-3；实施例2lamp检测试剂盒的配置（1）反应液i（23μl）：10×thermopolbuffer2.5μl；10mm的dntps4μl；25mm的mgcl21μl；8u/ul的bstdna酶0.6μl；10μm的正向外引物f30.5μl；10μm的反向外引物b30.5μl；10μm的正向内引物fip2μl；10μm的反向内引物bip2μl，灭菌超纯水9.9μl。；（2）阳性dna（2μl）：待测样品dna；（3）显色液（1μl）：sybrgreeni。实施例3st-ii型产肠毒素大肠杆菌的lamp检测试剂盒使用方法（a）dna的提取：采用煮沸法提取dna，取1ml细菌培养物，12000r/min离心5min；加入100μl超纯水，混匀，100℃煮沸，迅速转移至-20℃冷冻5min，然后4℃12000r/min离心5min。取上清，即为待测样品中的dna；（b）lamp扩增：配置23μl反应液，取2μl待测样品dna与反应液混匀，组成25μl反应体系；取1μlsybrgreen滴加在反应管盖内侧，小心操作以免染料掉入反应体系内；将反应管置于60℃～63℃的恒温水浴45min进行lamp扩增，85℃加热5min灭活酶的活性；（c）取出反应管进行结果判断：倒置反应管，混匀显色液和反应液，若颜色为绿色，则样品中含有st-ii型产肠毒素大肠杆菌，若颜色为橘黄色，则样品中不含有st-ii型产肠毒素大肠杆菌。试验分为两组，实验组中待测样品的dna为st-ii型产肠毒素性大肠杆菌的dna；对照组中待测样品为超纯水，结果如图1，同时采用琼脂糖凝胶电泳法进行观察如图2（采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，若有梯形条带产生则为样品中含有产肠毒素大肠杆菌，无梯形条带则样品中无产肠毒素性大肠杆菌）。实施例4st-ii型产肠毒素性大肠杆菌的lamp检测试剂盒特异性检测（1）按照上述煮沸法分别提取st-ii型产肠毒素大肠杆菌、沙门菌、葡萄球菌、鸭疫里默氏杆菌、巴氏杆菌、变形杆菌、猪丹毒杆菌、产气荚膜梭菌、链球菌的dna，同时以超纯水做为阴性对照；（2）配置23μl反应液，取2μl待测样品dna与反应液混匀，组成25μl反应体系；取1μlsybrgreen滴加在反应管盖内侧，小心操作以免染料掉入反应体系内；将反应管置于60℃～63℃恒温水浴45min进行lamp扩增，85℃加热5min灭活酶的活性；（3）取出反应管进行结果判断：倒置反应管，混匀显色液和反应液，若颜色为绿色，则样品中含有st-ii型产肠毒素大肠杆菌，若颜色为橘黄色，则样品中不含有st-ii型产肠毒素大肠杆菌。结果如图3，st-ii型产肠毒素大肠杆菌反应管呈绿色，为阳性结果；而沙门菌、葡萄球菌、鸭疫里默氏杆菌、巴氏杆菌、变形杆菌、猪丹毒杆菌、产气荚膜梭菌、链球菌以及超纯水为阴性对照反应管均呈现橘黄色，为阴性。实施例5st-ii型产肠毒素性大肠杆菌的lamp检测试剂盒灵敏度检测将提取的st-ii型产肠毒素大肠杆菌dna按10倍倍比稀释至500ng/μl、50ng/μl、5ng/μl、500pg/μl、50pg/μl、5pg/μl、500fg/μl、50fg/μl8个稀释度；分别取2μl各稀释度的st-ii型产肠毒素大肠杆菌dna，按照上述实施例3的使用方法进行反应并观察结果；同时采用琼脂糖凝胶电泳法进行观察，结果如图4和图5，st-ii型产肠毒素性大肠杆菌的lamp检测试剂灵敏度检测限为500fg/μl。实施例6st-ii型产肠毒素性大肠杆菌常规pcr方法灵敏性检测st-ii型产肠毒素大肠杆菌pcr反应组分如下：2×estaqmastermix12.5μl；10μmst-ii-forwardprimer：5’-atgtaaatacctacaacgggtgat-3’1μl；10μmst-ii-reverseprimer：5’-tatttgggcgccaaagcatgctcc-3’1μl；不同浓度st-ii型产肠毒素性大肠杆菌dna模板（500ng/μl、50ng/μl、5ng/μl、500pg/μl、50pg/μl、5pg/μl、500fg/μl、50fg/μl）2μl，超纯水8.5μl；pcr反应条件：94℃预变性2min，然后进入94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s的循环，共进行30个循环，最后再经72℃延伸10分钟。采用琼脂糖凝胶电泳法进行观察，结果如图6st-ii型产肠毒素性大肠杆菌常规pcr方法的检测限为500pg/μl，本发明的lamp检测法比常规pcr检测法灵敏度高1000倍，完全可以替代常规pcr检测方法。实施例7st-ii型产肠毒素性大肠杆菌的lamp检测试剂盒临床检测利用本发明的st-ii型产肠毒素性大肠杆菌的lamp检测试剂盒对扬州大学兽医微生物实验室分离保存的96株大肠杆菌进行检测。结果显示，96株大肠杆菌中有10株为st-ii型产肠毒素性大肠杆菌，同时利用常规pcr方法对96株大肠杆菌进行检测，结果发现，常规pcr检测结果与本发明检测试剂盒检出阳性率一致，符合率达到100%。序列表<110>江苏农牧科技职业学院<120>一种st-ii型产肠毒素性大肠杆菌的lamp检测试剂盒及方法<160>7<170>primerexplorerv4<210>1<211>300<212>dna<213>st-ii基因的特异性保守靶序列<400>tcgtcacatttttttgacttgactcatataaaagcccactggtataagttttattgcttatagcaataaggttgaggtgattttatgaaaaagaatatcgcatttcttcttgcatctatgttcgttttttctattgctacaaatgcctatgcatctacacaatcaaataaaaaagatctgtgtgaacattatagacaaatagccaaggaaagttgtaaaaaaggttttttaggggttagagatggtactgctggagcatgctttggcgcccaaataatggttgcagcaaaaggatgctaa<210>2<211>20<212>dna<213>正向外引物f3<400>gcaataaggttgaggtgatt<210>3<211>18<212>dna<213>反向外引物b3<400>gcaaccattatttgggcg<210>4<211>47<212>dna<213>正向内引物fip<400>tgattgtgtagatgcataggcattatttcttcttgcatctatgttcg<210>5<211>43<212>dna<213>反向内引物bip<400>tagacaaatagccaaggaaagttgttgctccagcagtaccatc<210>6<211>24<212>dna<213>forwardprimer<400>atgtaaatacctacaacgggtgat<210>7<211>24<212>dna<213>reverseprimer<400>tatttgggcgccaaagcatgctcc当前第1页12当前第1页12