家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体及其制备方法与流程

本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体及其制备方法。

背景技术：

近年来，随着生物信息学的发展，不同物种基因组测序的完成和大量转录组数据的积累，越来越多新的基因被鉴定出来，基因和蛋白表达水平的研究在后基因组学的众多研究领域中尤为突出，为了更为准确的了解基因表达调控及其编码蛋白的功能，在转录和翻译水平上对目的基因和蛋白的分析极为重要。目前对基因进行表达定量的常用方法有实时定量 PCR、RNA印迹、核糖核酸酶保护分析、基因芯片等，在蛋白水平进行定量的方法有蛋白印迹、免疫共沉淀等，都需应用内参基因对目的基因和蛋白进行校正，以获得真实可靠的结果。

内参即内部参照，一般是由管家基因编码表达的蛋白，管家基因有几百种，最常用的有甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）、肌动蛋白（Actin3）、微管蛋白（Tubulin）、组蛋白（H3）、核糖体蛋白L3（RPL3）和泛素结合蛋白（UBC）等。不同的内参基因具有不同的生物学功能，参与不同的生物调节。GAPDH 是一种重要的糖酵解酶，它催化三磷酸甘油酸氧化磷酸化成为1，3-二磷酸甘油酸，主要有参与能量代谢、DNA 修复、蛋白表达调节等多种生理功能。另外哺乳动物 GAPDH 蛋白还具有各种生物性能，如运输和膜融合中的作用、微管组装、核输出和蛋白磷酸转移酶/激酶反应。同时也发现真核生物 GAPDH 与细胞附着有关，可能起到增强细胞骨架结构的作用。GAPDH 作为管家基因，在真核和原核生物中高度保守，氨基酸序列同源性高达70%-100%，且在同种组织或细胞的不同时期表达量相对恒定，因而被作为内参蛋白广泛应用。

家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目模式生物，在研究昆虫遗传发育、基因调控分子机制和功能基因组学中具有重要作用。针对家蚕特殊的生命周期，其信号传导、蛋白合成与代谢的变化快速显著，其各组织的分化特异性高，组织之间的功能差异较大，选择合适的内参不仅可用于分析家蚕中基因和蛋白表达水平，也可以用于鳞翅目其他昆虫基因和蛋白的功能研究。目前市场上商品化的 GAPDH 内参抗体的抗原多为哺乳动物来源，具有蛋白特异性和种属通用性的蛋白序列，其检测种属较为广泛。虽然商品化的 GAPDH、Actin和Tubulin 的抗体在大部分动物和分昆虫中都具有序列保守性，但其在家蚕中的杂交效果一直不佳，且商品化GAPHD内参抗体多为单克隆抗体，制备成本高，周期长，且为哺乳动物来源，虽与昆虫GAPDH蛋白序列具有一定同源性，但其在家蚕中的特异性不高。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体的制备方法，具有特异性高、成本低、周期短的优势，不仅为进一步获得可商品化的GAPDH抗体奠定了基础，为家蚕及其他近源昆虫蛋白的功能研究提供有力的工具和技术支撑，同时也弥补了市场上商品化内参抗体大多来源于哺乳动物的缺陷，增加了内参抗体的多样性和选择性。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

第一步、GAPDH /pET-28a原核表达载体的构建：

（1）家蚕RNA提取；

（2）反转录：以RNA为模板，反转录合cDNA；

（3）PCR扩增：设计一对引物：

上游引物GAPDH-BamH I：5＇-ATGGATCCATGTCAAAAATTGGAAT-3＇；

下游引物GAPDH-EcoR I：5＇-GCGAATTCTTAATCTTTAGATTGAAT-3＇；

以cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物通过胶回收试剂盒对目的片段进行切胶回收；

（4）GAPDH/pMD-19T构建：将回收的目的片段与pMD-19T载体按照摩尔比3：1用Solution I连接酶16℃连接30min，连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性菌落，进行PCR和双酶切鉴定，对两次鉴定后正确的质粒进行测序，获得GAPDH/pMD-19T；

（5）GAPDH/pET-28a重组质粒构建：测序正确的GAPDH/pMD-19T采用BamH I和EcoR I进行双酶切，切胶纯化回收目的片段，纯化的目的片段与pET-28a载体以摩尔比3：1用T4 DNA连接酶16℃连接30min，连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性菌落，进行PCR和酶切鉴定，得到GAPDH/pET-28a重组质粒；

第二步、GAPDH融合蛋白的原核表达：

将重组质粒GAPDH/pET-28a转入大肠杆菌Rosetta感受态细胞中，37℃，220r/min振荡培养过夜；次日，按照1：100的比例（v/v）接种到100ml新的含有卡那霉素培养基中，37℃，220r/min至OD600值为0.6-0.8时，按1：1000的比例（v/v）加入终浓度为0.4mmol/L IPTG，37℃，220r/min，3h，诱导目的蛋白表达，收集诱导后有目的蛋白表达的菌液，用pH7.4，50mmol/L Tris-HCl 缓冲液重悬，超声破碎后的样品4℃，12000r/min离心5min，得上清和沉淀，沉淀纯化后得纯化后得GAPDH融合蛋白，并利用His单抗与纯化后GAPDH融合蛋白进行Western blot杂交鉴定；

第三步、GAPDH多克隆抗体的制备：

将纯化后的GAPDH融合蛋白作为抗原与等体积的弗氏完全佐剂进行1：1充分混合乳化，在新西兰纯种大白兔双肩周围皮下进行多点注射，注射前取少量正常血清作为阴性对照。首次免疫10天后，以相同抗原与等体积的弗氏不完全佐剂1：1充分混合进行第2次免疫，之后每隔7-10天免疫1次，免疫3次后取少许血清检测免疫效果，经4次免疫 10 天后，进行心脏采血，分离血清，得到GAPDH多克隆抗体。

进一步的，所述第一步（3）中PCR反应体系：10×buffer 2µl，dNTP 1.6µl， cDNA 1µl，rTaq酶0.2µl，上下游引物各0.8µl，用无菌水补至20µl；PCR反应条件：95℃预变性5min，30个循环（95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s），72℃延伸10min。

一种利用上述制备方法制备的家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体。

本发明的有益效果是：

1、本发明参照家蚕GAPDH的999bp全长序列，设计一对引物，特异性高。

2、本发明制备的家蚕GAPDH多克隆抗体，可与GAPDH融合蛋白进行特异结合，且GAPDH抗体的效价为1：8000。

3、本发明的家蚕GAPDH多克隆抗体能特异的结合家蚕幼虫各龄期蛋白、家蚕成虫雄性与雌性不同部位的GAPDH蛋白，具有特异性高、成本低、周期短的优势，不仅为进一步获得可商品化的 GAPDH 抗体奠定了基础，为家蚕及其他近源昆虫蛋白的功能研究提供有力的工具和技术支撑，同时也弥补了市场上商品化内参抗体大多来源于哺乳动物的缺陷，增加了内参抗体的多样性和选择性。

附图说明

图1为IPTG诱导前后、超声破碎后的上清及沉淀、纯化后的GAPDH融合蛋白的SDS-PAGE电泳检测（A）以及His单抗的Western blot 杂交检测（B）；

图1（A）中M：蛋白质分子质量标准；1：IPTG诱导前总蛋白；2：IPTG诱导后总蛋白；3：超声破碎后上清；4：超声破碎后沉淀；5：纯化后的His-GAPDH融合蛋白；图1（B）中：5：纯化后的His-GAPDH融合蛋白。

图2为本发明ELISA检测GAPDH 多克隆抗体的效价。

图3为 GAPDH多克隆抗体在家蚕不同龄期幼虫（A）、雄性成虫（B）和雌性成虫（C）中的 Western blot 杂交检测；其中图3（A）中M：蛋白质分子质量；1：1 龄；2：2 龄；3：3 龄；4：4 龄；5：5 龄；图3（B）和（C）中6：头部；7：翅；8：足；9：胸部；10：腹部。

图4为图3的阴性对照图。

图5为家蚕 GAPDH多克隆抗体（A）和商品化 GAPDH抗体（B）在家蚕幼虫和成虫中的特异性检测图；图中M：蛋白质分子质量标准；1：5龄幼虫；2：雌蛾胸部；3：雄蛾胸部。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。

一种家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

第一步、GAPDH/pET-28a原核表达载体的构建：

（1）家蚕RNA提取：家蚕组织用液氮研磨，用Trizol试剂（Invitrogen）和氯仿抽提，异丙醇沉淀，无水乙醇清洗干燥后溶于DEPC水，获得家蚕组织的总RNA；

（2）反转录：以RNA为模板，以oligodT为引物，按照大连宝生物的PrimeScript II 反转录试剂盒逆转录合成第一链cDNA；

（3）PCR扩增：参照家蚕GAPDH的999bp全长序列，设计一对引物：

上游引物GAPDH-BamH I：5＇-ATGGATCCATGTCAAAAATTGGAAT-3＇；

下游引物GAPDH-EcoR I：5＇-GCGAATTCTTAATCTTTAGATTGAAT-3＇；

其中斜体下划线为酶切位点，以cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系：10×buffer 2µl，dNTP 1.6µl， cDNA 1µl，rTaq酶 0.2µl，上下游引物各0.8µl，用无菌水补至20µl；PCR反应条件：95℃预变性5min，30个循环（95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30 s），72℃延伸10min；PCR产物通过胶回收试剂盒对目的片段 进行切胶回收；

（4）GAPDH/pMD-19T构建：将回收的目的片段与pMD-19T载体按照摩尔比3：1用Solution I连接酶16℃连接30min，连接产物转化大肠杆菌，挑取阳性菌落，进行菌液PCR鉴定，挑取阳性菌落摇菌提质粒，用BamH I和EcoR I进行小量双酶切鉴定，对两次鉴定后正确的质粒进行测序，获得GAPDH/pMD-19T；

（5）GAPDH/pET-28a重组质粒构建：测序正确的GAPDH/pMD-19T采用BamH I和EcoR I进行大量双酶切，酶切产物采用凝胶电泳进行分析，切胶后用Axygen的DNA凝胶回收试剂盒纯化目的片段，纯化的目的片段与pET-28a载体以摩尔比3：1用T4 DNA连接酶16℃连接30min，连接产物转化大肠杆菌，菌液PCR筛选阳性菌落，BamH I和EcoR I双酶切鉴定，得到GAPDH/pET-28a重组质粒。

第二步、GAPDH融合蛋白的原核表达：

将重组质粒GAPDH/pET-28a转入大肠杆菌Rosetta感受态细胞中，37℃，220r/min振荡培养过夜；次日，按照1：100的比例（v/v）接种到100ml新的含有卡那霉素培养基中，37℃，220r/min至OD600值为0.6-0.8时，按1：1000的比例（v/v）加入终浓度为0.4mmol/L IPTG，37℃，220r/min，3h，诱导目的蛋白表达。

收集诱导后有目的蛋白表达的菌液，用pH7.4，50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液重悬，超声破碎后的样品4℃，12000r/min离心5min，得上清和沉淀，SDS-PAGE检测IPTG诱导前后总蛋白、超声破碎后上清和沉淀，结果见图1（A）所示，图1（A）表明GAPDH融合蛋白诱导表达成功，且GAPDH以包涵体的形式存在于沉淀中。然后采用KCl染色切胶的方法对GAPDH包涵体蛋白进行纯化，具体纯化步骤如下：将超声破碎得到的沉淀加入适量蛋白上样缓冲液重悬，沸水浴加热10min后SDS-PAGE电泳分离，然后用适量的0.25mol/L的KCl溶液染色5min，用手术刀片切下染成银白色的目的条带，用PBS洗3次后，将胶条碾碎并移入EP 管中，并加入适量PBS于4℃振荡透析过夜，离心后取上清，得到纯化后GAPDH融合蛋白，电泳检测纯化后GAPDH融合蛋白的纯度和浓度，并利用His单抗与纯化后GAPDH融合蛋白进行Western blot杂交鉴定，结果见图1，纯化后GAPDH融合蛋白的SDS-PAGE电泳检测和His单抗的杂交结果显示都有一条单一的目的条带，并与目的融合蛋白39kD的理论分子量一致，由此表明该蛋白为带His标签的融合GAPDH蛋白（图1B），可作为抗原用于后续多克隆抗体制备。

第三步、GAPDH多克隆抗体的制备：

将纯化后的GAPDH融合蛋白作为抗原与等体积的弗氏完全佐剂进行1：1充分混合乳化，在新西兰纯种大白兔双肩周围皮下进行多点注射，注射前取少量正常血清作为阴性对照。首次免疫10天后，以相同抗原与等体积的弗氏不完全佐剂1：1充分混合进行第2次免疫，之后每隔7-10天免疫1次，免疫3次后取少许血清检测免疫效果，经4次免疫10天后，进行心脏采血，分离血清，得到GAPDH多克隆抗体，进行效价检测。

效价测定

采用酶联免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）测定方法检测抗体的效价，用浓度为0.5mg/mLHis-GAPDH融合蛋白于4 ℃过夜包被ELISA板，采用3%牛血清蛋白缓冲液进行封闭，将兔抗GAPDH的多抗血清按照1：500、1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000和1：32000进行稀释，一抗孵育2h，二抗孵育1h，最后加入显色液反应15min，用酶仪检测450nm处吸光值，未免疫前的血清为阴性对照。结果如图2所示，不同稀释比例的抗血清均可与GAPDH融合蛋白进行特异结合，由此表明GAPDH多抗血清具有较好的免疫原性。按照酶标仪检测的OD450值大于阴性对照2倍并且数值大于0.25的标准，能够检测到抗原抗体特异结合信号的最大稀释浓度为1：8000，即GAPDH抗体的效价为1：8000。

GAPDH多克隆抗体的特异性测定

提取家蚕幼虫不同龄期以及家蚕成虫不同部位总蛋白，SDS-PAGE电泳检测。将家蚕各样品的总蛋白通过半干转印系统（15V，10min）转到PVDF膜上，用PBST + 2.5%的脱脂牛奶室温封闭2h，然后加入1：500稀释的GAPDH 多克隆抗体室温孵育2h，洗膜后加入1：1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温孵育1h，最后用增强型DAB显色试剂盒显色至条带清晰，结果如图3所示；以采用未免疫兔血清检测家蚕不同组织的特异性作为阴性对照，阴性对照见图4。

由图3和图4可知，所有样品中在分子量为35kD处都有一清晰的条带，与GAPDH的理论分子量一致，而阴性对照在35kD处没有出现条带。由此表明，GAPDH多克隆抗体能特异的结合家蚕幼虫各龄期蛋白、家蚕成虫雄性与雌性不同部位的GAPDH蛋白。

Western blot检测商品化和自制GAPDH抗体在家蚕中的特异性

按照上述GAPDH多克隆抗体的特异性测定的方法，分别选取家蚕5龄幼虫和雌雄成虫的不同部位蛋白样品，相同上样量和条件电泳转膜后，分别用实验室购买的商品化的GAPDH抗体（proteintech, 10494-1-AP）和本技术制备的家蚕GAPDH抗体检测，结果如图5所示，本发明制备的家蚕GAPDH抗体能够很好的结合家蚕5龄幼虫和雌雄成虫胸部的样品蛋白，且目的条带单一；而购买的商品化GAPDH抗体则不能结合待测的家蚕任一蛋白样品，由此表明，本技术制备的GAPDH抗体具有较高的特异性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

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