本发明属于药物标记技术领域，具体涉及一种利用氯胺T标记OxLDL-Ab的方法。
背景技术：
OxLDL-Ab是一类以OxLDL作为抗原诱发自身机体免疫应答产生的抗体，针对不同位点的抗原决定簇产生的OxLDL-Ab也不同。目前学术界公认氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，OxLDL)在动脉粥样硬化的形成与发展过程中起关键作用，是动脉粥样硬化早期及全病程中最重要的标志物。
OxLDL-Ab与AS(动脉粥样化)的密切相关性也已得到公认，并已实现了生物样品中OxLDL-Ab等重要因子的体外准确定量检测。通常OxLDL-Ab为IgG型，分子量在几kDa到数十kDa不等(Da为道尔顿)，目前成都华神生物技术有限责任公司研发了一种新型的IgM型OxLDL-Ab抗体，其是一类全新的抗体，其分子量为900KDa，属于μ型免疫球蛋白，以五聚体存在，由二硫键连接，结构较稳定。该抗体特异性高，在动脉粥样硬化放射性免疫诊断和治疗方向有开发前途。
但是目前OxLDL-Ab尤其是IgM型OxLDL-Ab在体内的显像诊断方面仍缺乏特异性高、稳定性好的标记抗体用于显像诊断，也尚无动物活体成功进行AS显像的报道，对于放射性显像用于AS早期诊断还需要进行深入的研究。碘是医学上常用的放射性核素，碘标记物的性质比其它放射性金属核素标记物更接近前体的生化特性，且用一般晶体闪烁计数器就能获得较高效率，结果精确。刘子华等于2009年在《同位素》杂志上公开报道了名为《125I标记氧化低密度脂蛋白抗体》的文章，文章中公开了利用Iodogen碘化法标记OxLDL-Ab的方法，该方法存在标记时间长(>8min)、稳定性差、重复率差等缺陷，因此急需研发一种用碘标记OxLDL-Ab的新方法。
技术实现要素：
(一)发明目的
根据现有技术所存在的问题，本发明提供了一种标记率高、标记时间短、稳定性好、放射化学纯度高且易于标准化规范操作的用碘标记OxLDL-Ab的方法。
(二)技术方案
为了解决现有技术所存在的问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种利用氯胺T标记OxLDL-Ab的方法，该方法包括以下步骤：
(1)在反应容器中依次加入PBS缓冲液、NaI溶液并混合均匀后，再利用移液管向该混匀后的溶液中加入OxLDL-Ab溶液，加入时移液管下端要伸入至混合溶液液面内1～3mm处，再次混合均匀；然后加入氯胺T，并于2～10秒内盖上瓶盖，反应1～5min；
所述PBS缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述NaI为Na125I、Na123I或Na131I；所述氯胺T溶液的浓度为2～6mg/ml，PBS缓冲液的浓度为0.1～0.4mg/ml，pH值为7.0～7.8；OxLDL-Ab溶液与NaI溶液的用量比为30μg/28MBq～40μg/28MBq；以分子量计算，氯胺T与OxLDL-Ab的用量比为3963.6：1。
(2)在步骤(1)得到的反应产物中加入偏重亚硫酸钠Na2S2O5溶液以使反应终止；其中Na2S2O5溶液的浓度为2.5～6mg/ml；Na2S2O5与氯胺T的摩尔比例为1.2～2.4；
(3)以PBS缓冲液为淋洗液淋洗PD-10柱，淋洗3～5个柱体积后，加入含有牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液再次淋洗PD-10柱，然后加入PBS缓冲液淋洗至柱平衡；
(4)将步骤(2)得到的反应产物过步骤(3)中得到的平衡后的PD-10柱，该反应产物是利用移液管转移至PD-10柱上方且移液管不能接触柱壁及柱面，待反应产物完全渗入柱面后，立即加入PBS缓冲液淋洗，并收集淋洗液，该淋洗液即为最终的纯化后的反应产物；
所述PD-10柱为交联葡聚糖(sephandexG50)凝胶过滤色谱柱，流速为6～10cm/min；
优选地，步骤(1)中所述OxLDL-Ab为IgM型OxLDL-Ab，其分子量为900KDa，以五聚体存在，由二硫键连接。
优选地，步骤(1)所述氯胺T溶液的浓度为5mg/ml，PBS缓冲液的浓度为0.2mg/ml，pH值为7.3；OxLDL-Ab溶液与NaI溶液的用量比为30μg/28MBq；反应时间为1min。
优选地，步骤(2)中Na2S2O5溶液的浓度为5mg/ml；Na2S2O5与氯胺T摩尔比例为1.5。
优选地，步骤(3)中所述的含有牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液中，所述PBS缓冲液的PH为7.4，浓度为0.01mol/L；牛血清蛋白在PBS缓冲液中的体积比为1％～3％。
优选地，步骤(1)中所述NaI溶液为Na123I溶液。
优选地，步骤(1)中反应温度为室温。
(三)有益效果
本申请利用氯胺T法成功对OxLDL-Ab尤其是IgM型OxLDL-Ab进行碘标记，标记率在80％以上且重复性好，适用于临床显像需要。该方法具有的有益效果具体如下：
①常规的OxLDL-Ab标记抗体多是用分子量较小的IgG型抗体，是免疫应答中分泌的中段抗体，属于二级免疫应答产物，抗体生产量大，结构稳定，其分子量小，多为150kDa，且裸露的标记位点多(酪氨酸和丝氨酸残基多)，容易标记，但是标记重复性差，标记时间长。而本申请中的IgM型抗体与传统的抗体具有本质区别，具有标记物稳定、对环境温度等要求低等优点，是免疫应答中首先分泌的抗体，起“先锋免疫”作用，具有很强的免疫活性，多为保护性抗体，属于一级免疫应答产物。但是该抗体产量少且不易提取分离，分子量为900kDa，且裸露的标记位点少，且有空间位阻作用，不容易标记。在结构上它是由IgM单体形成一个封闭的五聚体环状结构，表面裸露位点少，并带有一个非常疏水的核心，也是容易吸附到容器壁的原因。
②本申请步骤(1)反应溶液的加入次序不同于一般的标记方法，多数标记方法是先加抗体，后加放射性核素以减少放射性对操作者的影响。但本申请提供的标记方法由于抗体的裸露位点小，极易吸附，需先加放射性核素NaI溶液，然后加入OxLDL-Ab溶液，才能满足对标记率的要求。
③本申请步骤(1)在加入氯胺T后，于2～10秒内盖上瓶盖。是申请人充分考虑到氯胺T在水溶液中产生次氯酸，而次氯酸可使碘阴离子氧化成碘分子(游离I2)然后与抗体分子中酪氨酸和一些组氨酸发生卤化反应。因为在加入氯胺T的瞬间会发生活化反应，容易产生升化的I2蒸汽，需要迅速盖上瓶盖，避免放射性物质污染，同时也避免了I2浓度的降低，提高了反应活性，提高了标记率。
④本申请步骤(1)中加入OxLDL-Ab溶液时，移液管下端要伸入至混合溶液液面高度内1～3mm处；否则抗体容易吸附器壁上，严重影响标记率，甚至导致标记失败，且标记率<20％。
⑤本申请步骤(2)中，加入还原剂Na2S2O5来终止反应，而传统的做法是加入Na2S2O5及游离酪氨酸来终止反应，因为活化的I2是与抗体上的酪氨酸残基发生取代反应，加入酪氨酸会加速中和反应中的碘分子，再经凝胶过滤法将标记的抗体与碘化酪氨酸及还原剂分离开。而本申请则省去了这一步骤，且省去这一步骤对终止反应时间(终止反应时间<30s)及对标记率没有影响，标记率均在80％以上。
⑥本申请中NaI溶液优选为Na123I，不同于常用的Na125I，这主要是由于123I半衰期为13.2h，可发射159kev的γ光子，非常适合核医学显像使用。
附图说明
图1是反应时间对标记率的影响示意图。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式和说明书附图对本发明做进一步阐述。
实施例1
一种利用氯胺T标记OxLDL-Ab的方法，该方法包括以下步骤：
(1)在反应容器中依次加入PBS缓冲液、NaI溶液并混合均匀后，再利用移液管向该混匀后的溶液中加入OxLDL-Ab溶液，加入时移液管下端要伸入至混合溶液液面内2mm处，再次混合均匀；然后加入氯胺T，并于2秒内盖上瓶盖，反应时间为1min；
所述PBS缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为0.2mg/ml，pH值为7.3；所述NaI为Na123I；氯胺T溶液的浓度为5mg/ml；OxLDL-Ab溶液与Na123I溶液的用量比为30μg/28MBq；反应温度为室温。
(2)在步骤(1)得到的反应产物中加入偏重亚硫酸钠5mg/ml的Na2S2O5溶液以使反应终止，Na2S2O5与氯胺T摩尔比例为1.5。
(3)以PBS缓冲液为淋洗液淋洗PD-10柱，淋洗3～5个柱体积后，加入含有牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液再次淋洗PD-10柱，然后加入PBS缓冲液淋洗至柱平衡；步骤(3)中所述的含有牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液中，所述PBS缓冲液的PH为7.4，浓度为0.01mol/L；牛血清蛋白在PBS缓冲液中的体积比为1％。
(4)将步骤(2)得到的反应产物过步骤(3)中得到的平衡后的PD-10柱，该反应产物是利用移液管转移至PD-10柱上方且移液管不能接触柱壁及柱面，待反应产物完全渗入柱面后，立即加入PBS缓冲液淋洗，并收集淋洗液，该淋洗液即为最终的反应产物；
所述PD-10柱为交联葡聚糖(sephandexG50)凝胶过滤色谱柱，流速为6～10cm/min；
申请人研究了反应条件对标记率的影响：
(1)反应时间对标记率的影响
取一只反应瓶，依次加入210μL 0.2mol/L的PBS(pH 7.3)，5μL Na123I(28MBq)，混合均匀后，再加入85μL OxLDL-Ab(30μg)，振摇反应瓶，使之混合均匀，然后加入6μL氯胺T(30μg)，振摇反应瓶，使之在室温下充分反应。其他条件一致，分别在反应时间为1min、2min、3min、4min和5min时，用毛细管取样，分别测定标记率，加入9μL Na2S2O5(45μg)终止反应。如图1所示。
由图1可看出，反应进行2min时标记率可达(81.4±2.6)％，随着反应时间的延长标记率略有下降，反应5min后标记率为(68.5±1.9)％，这可能是随着反应时间的延长氯胺-T的氧化作用致使部分标记物发生解离脱碘，由于氯胺T的氧化性较强，增加反应时间可能会对抗体的免疫活性产生一定的影响。因此，本实验条件下反应2min为最佳反应时间，但是综合考虑标记时间对抗体活性的影响等因素，实施例1中的反应时间为1min。
(2)标记反应液pH值对123I-OxLDL-Ab标记率的影响
在其它条件不变时，反应体系pH为7.0时，标记率仅为(62.5±1.7)％，标记率随pH的增大而升高，当反应体系pH 7.3时标记率最高(82.1±2.1)％，随后再增加pH，标记率反而下降。因此本实验确定pH 7.3为最佳反应条件。
另外，申请人还采用薄层色谱法测定标记率和放射化学纯度，所用层析液为85％甲醇/15％生理盐水。结果显示，标记率大于80％，放化纯为95％，比活度为3.29×1010Bq/g。
氯胺T法标记率高，重复性好，试剂便宜易得，适用于临床显像需要，是目前使用最多的标记方法。采用Iodogen法标记一次获得的标记抗体的量较少，不适宜动物显像实验，当标记大量抗体时，标记结果不稳定，主要是由于Iodogen管主要涂布在底部，反应截面较小，当加入较多的放射性碘时，不能反应完全，造成标记率下降或标记失败。本实施例中，采用氯胺T标记OxLDL-Ab，标记率大于80％，标记条件稳定，成功率高。
实施例2
与实施例1不同的是，所述OxLDL-Ab为IgM型OxLDL-Ab，其分子量为900KDa，以五聚体存在，由二硫键连接。步骤(1)中利用移液管溶液中加入OxLDL-Ab溶液，加入时移液管下端要伸入至混合溶液液面内1mm处，所述NaI为Na125I；所述氯胺T溶液的浓度为2mg/ml，PBS缓冲液的浓度为0.1mg/ml，pH值为7.0；OxLDL-Ab溶液与NaI溶液的用量比为35μg/28MBq；反应时间为2min。
步骤(2)中Na2S2O5溶液的浓度为2.5mg/ml；Na2S2O5与氯胺T的摩尔比例为1.2；
步骤(3)中牛血清蛋白在PBS缓冲液中的体积比为2％。
实施例3
与实施例1不同的是，移液管向该混匀后的溶液中加入OxLDL-Ab溶液，加入时移液管下端要伸入至混合溶液液面内3mm处；所述NaI为Na131I；所述氯胺T溶液的浓度为6mg/ml，PBS缓冲液的浓度为0.4mg/ml，pH值为7.8；OxLDL-Ab溶液与NaI溶液的用量比为40μg/28MBq；；反应时间为5min。
步骤(2)中Na2S2O5溶液的浓度为6mg/ml；Na2S2O5与氯胺T的摩尔比例为2.4；
步骤(3)中血清蛋白在PBS缓冲液中的体积比为3％。