本发明属于医药材料生物工程领域，更具体地，涉及一种撞击流辅助提取胶原蛋白的方法。
背景技术：
胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多的纤维状、大分子蛋白质，占体内蛋白质总量的25％～30％，主要分布在哺乳动物的结缔组织中，对动物和人体软骨、皮肤和肌腱的形成都十分重要。典型的胶原分子是长且坚韧的三螺旋结构。目前已发现有27种不同类型的胶原，按照被发现的先后顺序分别称为I型胶原、II型胶原、III型胶原等，用大写的罗马数字来进行命名。
胶原蛋白具有诸多优异的生物学性质：胶原分子结构中的重复性单元大，免疫原性非常低，对机体无排异反应；具有较高的生物相容性，一般生物机体不会对其产生慢性的排斥现象；具有非常高的生物活性、细胞适应性和促进细胞增殖的作用；具有生物降解性能，在体内胶原酶的作用下逐渐降解成低分子寡肽或氨基酸，被机体吸收或排出体外。因此胶原蛋白被广泛应用于制备止血敷料、人工皮肤、血管、神经、软骨、粘膜组织以及骨组织等领域的研究中，是一种应用前景非常大的医学生物高分子材料。
I型胶原蛋白是动物体内含量最多的一类胶原，是脊椎动物结缔组织中最重要和最常见的胶原类型。I型胶原蛋白目前在组织工程中大量使用，使得从动物组织中提取型胶原蛋白成为了近年来研究的热点。目前，用于提取胶原蛋白纤维的方法主要有酸提取法(中国专利，申请号CN201510640370.6、CN200510047408.5)、酶提取法(中国专利，申请号CN201410050681.2、CN201410050678.0)、超声波辅助提取法(中国专利，申请号CN201180063095.6、CN200810229068.1)等，这些方法提取出来的胶原蛋白或者生产周期较长，或者容易破坏胶原蛋白的天然三螺旋结构导致提取的胶原蛋白纯度比较低，而且某些提取方法还会出现端粒残留的现象，导致免疫原性问题，并且生物相容性较低，大大限制了其在医学生物领域的应用。
技术实现要素：
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种提取胶原蛋白的方法，其目的在于通过将酸提取与酶提取结合起来，并借助于撞击流辅助提取这一技术提取胶原蛋白，由此解决现有技术胶原蛋白提取方法生产周期长、提取得到的胶原蛋白纯度和生物活性低的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种撞击流辅助提取胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)碱处理牛跟腱：将牛跟腱除去筋膜和脂肪，切成块状，加入氢氧化钠水溶液浸泡6～12小时，过滤，并用水洗涤牛跟腱至中性，得到预处理后的牛跟腱；
(2)撞击流辅助提取胶原蛋白：将步骤(1)得到的预处理后的牛跟腱置于撞击流装置中，加入乙酸溶液和胃蛋白酶，得到所述牛跟腱、乙酸和胃蛋白酶的混合液，通过所述撞击流装置使混合液同轴相向撞击，通过撞击辅助提取,获得提取液；
(3)胶原蛋白提取物的分离：将步骤(2)得到的提取液固液分离，保留上层清液，调节所述清液的pH值至中性，加入NaCl使胶原蛋白盐析，收集沉淀物，洗涤、干燥获得胶原蛋白提取物。
优选地，步骤(1)所述切成块状的具体方法为：先沿所述牛跟腱的纤维方向切成厚度为1毫米的薄片，再切成1mm×1mm的块状。
优选地，步骤(1)所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.1mol/L～2.0mol/L；步骤(1)所述牛跟腱与所述氢氧化钠的质量比为2:1～15:1。
优选地，步骤(1)所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.2mol/L。
优选地，步骤(2)所述乙酸溶液中乙酸的浓度为0.5～2mol/L；所述预处理后的牛跟腱与乙酸的质量比为1:0.75～1:4。
优选地，步骤(2)所述乙酸的浓度为1mol/L。
优选地，步骤(2)所述胃蛋白酶的质量与所述预处理后的牛跟腱的质量比为1:5～1:20。
优选地，步骤(2)所述胃蛋白酶的质量与所述预处理后的牛跟腱的质量比为1:10。
优选地，步骤(2)所述撞击流装置为双喷头喷射撞击反应器，所述撞击反应器的喷嘴喷出的液体为环状液膜相。
优选地，步骤(2)所述撞击流装置的射流口直径为0.1～5mm，所述喷嘴喷出液体的流速为0.5～20m/s。
优选地，步骤(2)所述撞击流装置的射流口直径为0.2～3mm。
优选地，步骤(2)所述喷嘴喷出液体的流速为1～10m/s。
优选地，步骤(2)所述撞击辅助提取的温度控制在0～32℃，时间控制在2～8h。
优选地，步骤(3)所述加入NaCl使胶原蛋白盐析，其中NaCl的浓度控制在1～5mol/L。
优选地，步骤(3)所述干燥为冷冻干燥。
撞击流最早是由苏联科学家Elperin在1961年提出。最初的构想，是使两股等量气体充分加速固体颗粒后形成的气-固两相流同轴高速相向流动并在两加速管的中间即撞击面上互相撞击。两股高速两相流撞击的结果，形成了一个高度湍动、颗粒浓度最高的撞击区，为强化热、质传递提供了极好的条件。本发明所使用的撞击流是其最初构想的一个延伸应用，称之为液体连续相撞击流。其原理为溶液通过反应器内部构件的导流作用产生相向撞击，在中间区域产生一个环状液相膜，由于安装在同一个轴上面的上、下两个导流筒内螺旋桨的方向相反，在环状液相膜撞击面提供各方向强劲的撕扯力，其力度随射流口直径的减小和流速的增大而增强，能够加速胶原分子从稳定的三螺旋结构解螺旋为单螺旋结构，从而加速胶原提取过程。目前，尚未见使用撞击流辅助提取胶原蛋白方法的报道。
本发明所要解决的技术问题是在保证较高的提取产率、纯度的基础上缩短胶原蛋白的提取周期。该方法是在酸性条件下使用胃蛋白酶提取这一现有的技术之上，创造性的加入了撞击流辅助这一方法，能明显缩短提取周期并获得较高纯度的胶原蛋白产品。由于胶原蛋白的特性，本领域的技术人员一直在探索各种方法加速其解螺旋过程来提高提取效率和产率，如传统的机械搅拌和超声波辅助提取，但传统的机械搅拌方法不能提供各向异性力，所需要的提取时间相对较长；超声波辅助提取法因局部超声场强过大，容易打断胶原分子链引起降解，从而使其纯度降低并降低胶原蛋白的生物活性。而本发明提出来的撞击流辅助提取方法可以说是传统的机械搅拌的升级版，能够提供各向异性且更加强劲的机械力以加速胶原分子从稳定的三螺旋结构解螺旋为单螺旋结构，而且其机械力度不足以打断胶原分子链，不会引起胶原分子的降解。因此本发明所提出来的撞击流辅助提取方法能够兼顾机械搅拌和超声波辅助提取的优点并摒弃其缺点。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果。
(1)本发明在酸性水溶液体系中、在胃蛋白酶和撞击流辅助外力的作用下提取胶原蛋白，工艺流程简单，提高了胶原蛋白的提取率，缩短了生产周期，并保持了胶原蛋白的生物活性。
(2)本发明利用撞击流反应器在环状液相膜撞击面提供各方向强劲的撕扯力，加速胶原分子从稳定的三螺旋结构解螺旋为单螺旋结构，从而加速胶原蛋白的提取过程。
附图说明
图1为本发明实施例中提取的大分子胶原蛋白SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，结合以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的撞击流辅助提取胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)用碱处理牛跟腱：将牛跟腱除去筋膜、脂肪等杂物，洗净，沿牛跟腱的纤维方向切成厚度为1毫米的薄片，再切成1mm×1mm的小块，加入氢氧化钠水溶液浸泡6～12小时，过滤，并用水洗涤牛跟腱至中性，得到预处理后的牛跟腱；其中氢氧化钠水溶液的浓度为0.1mol/L～2.0mol/L，优选为0.2mol/L；牛跟腱与氢氧化钠的质量比为2:1～15:1。
(2)撞击流辅助提取胶原蛋白：将步骤(1)得到的预处理后的牛跟腱置于撞击流装置中，加入乙酸溶液和胃蛋白酶，得到牛跟腱、乙酸和胃蛋白酶的混合液，然后使混合液通过双喷头喷射撞击反应器的喷嘴高速喷出环状液膜相，在0～32℃同轴相向撞击2～8h，优选为4h，通过撞击辅助提取获得提取液；其中，撞击流反应器的射流口直径为0.1～5mm，优选0.2～3mm，喷嘴喷出液体的流速为0.5～20m/s，优选为1～10m/s。
其中乙酸的浓度为0.5～2mol/L，优选为1mol/L，所述预处理后的牛跟腱与乙酸的质量比为1:0.75～1:4；胃蛋白酶的质量与所述预处理后的牛跟腱的质量比为1:5～1:20，优选为1:10。
(3)胶原蛋白提取物的分离：将步骤(2)得到的提取液固液分离，除掉沉淀物，保留上层清液，调节清液的pH值至中性，加入NaCl，使体系中NaCl的浓度控制在1～5mol/L，优选为3mol/L，使胶原蛋白盐析，静置12～24h以后，过滤收集沉淀物，洗涤、冷冻干燥获得胶原蛋白提取物。
以下为实施例：
实施例1
将500g牛跟腱去除筋膜、脂肪等杂物，洗净，切成1mm×1mm的小块，加入5000毫升浓度为0.2mol/L的NaOH溶液，浸泡7h，过滤并用水洗涤至中性；取20g处理后的牛跟腱，加入500毫升浓度为0.5mol/L的乙酸和2g胃蛋白酶，然后通过射流口直径为0.1mm、流速为20m/s的双喷头撞击流装置喷出环状液膜相，使体系发生撞击，反应体系的温度控制在4℃，撞击反应时间控制在2.5h，获得提取液，过滤，保留上层清液，调节其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的浓度为1.5mol/L，静置12h后，将其过滤收集沉淀物；将收集的沉淀物洗涤并冻干，即得到胶原蛋白提取物。
实施例2
取100g实施例1中经过碱处理后的牛跟腱，加入3000毫升浓度为1.0mol/L的乙酸和20g胃蛋白酶，然后通过射流口直径为3mm、流速为10m/s的双喷头撞击流装置喷出环状液膜相，使体系发生撞击，反应体系的温度控制在15℃，撞击反应时间控制在5h，获得提取液，过滤，保留上层清液，调节其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的浓度为3mol/L，静置16h后，将其过滤收集沉淀物；将收集的沉淀物洗涤并冻干，即得到胶原蛋白提取物。
实施例3
取200g实施例1中经过碱处理后的牛跟腱，加入8000毫升浓度为1.5mol/L的乙酸和10g胃蛋白酶，然后通过射流口直径为5mm、流速为0.5m/s的双喷头撞击流装置喷出环状液膜相，使体系发生撞击，反应体系的温度控制在30℃，撞击反应时间控制在8h，获得提取液，过滤，保留上层清液，调节其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的浓度为5mol/L，静置24h后，将其过滤收集沉淀物；将收集的沉淀物洗涤并冻干，即得到胶原蛋白提取物。
实施例4
将500g牛跟腱去除筋膜、脂肪等杂物，洗净，切成1mm×1mm的小块，加入15000毫升浓度为0.2mol/L的NaOH溶液，浸泡7h，过滤并用水洗涤至中性；取20g处理后的牛跟腱，加入500毫升浓度为0.5mol/L的乙酸和2g胃蛋白酶，然后通过射流口直径为0.1mm、流速为20m/s的双喷头撞击流装置喷出环状液膜相，使体系发生撞击，反应体系的温度控制在4℃，撞击反应时间控制在2.5h，获得提取液，过滤，保留上层清液，调节其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的浓度为1.5mol/L，静置12h后，将其过滤收集沉淀物；将收集的沉淀物洗涤并冻干，即得到胶原蛋白提取物。
实施例5
取100g实施例4中经过碱处理后的牛跟腱，加入3000毫升浓度为1.0mol/L的乙酸和20g胃蛋白酶，然后通过射流口直径为3mm、流速为10m/s的双喷头撞击流装置喷出环状液膜相，使体系发生撞击，反应体系的温度控制在15℃，撞击反应时间控制在5h，获得提取液，过滤，保留上层清液，调节其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的浓度为3mol/L，静置16h后，将其过滤收集沉淀物；将收集的沉淀物洗涤并冻干，即得到胶原蛋白提取物。
实施例6
取200g实施例4中经过碱处理后的牛跟腱，加入8000毫升浓度为1.5mol/L的乙酸和10g胃蛋白酶，然后通过射流口直径为5mm、流速为0.5m/s的双喷头撞击流装置喷出环状液膜相，使体系发生撞击，反应体系的温度控制在30℃，撞击反应时间控制在8h，获得提取液，过滤，保留上层清液，调节其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的浓度为5mol/L，静置24h后，将其过滤收集沉淀物；将收集的沉淀物洗涤并冻干，即得到胶原蛋白提取物。
实施例7
将500g牛跟腱去除筋膜、脂肪等杂物，洗净，切成1mm×1mm的小块，加入25000毫升浓度为0.2mol/L的NaOH溶液，浸泡7h，过滤并用水洗涤至中性；取20g处理后的牛跟腱，加入500毫升浓度为0.5mol/L的乙酸和2g胃蛋白酶，然后通过射流口直径为0.1mm、流速为20m/s的双喷头撞击流装置喷出环状液膜相，使体系发生撞击，反应体系的温度控制在4℃，撞击反应时间控制在2.5h，获得提取液，过滤，保留上层清液，调节其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的浓度为1.5mol/L，静置12h后，将其过滤收集沉淀物；将收集的沉淀物洗涤并冻干，即得到胶原蛋白提取物。
实施例8
取100g实施例7中经过碱处理后的牛跟腱，加入3000毫升浓度为1.0mol/L的乙酸和20g胃蛋白酶，然后通过射流口直径为3mm、流速为10m/s的双喷头撞击流装置喷出环状液膜相，使体系发生撞击，反应体系的温度控制在15℃，撞击反应时间控制在5h，获得提取液，过滤，保留上层清液，调节其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的浓度为3mol/L，静置16h后，将其过滤收集沉淀物；将收集的沉淀物洗涤并冻干，即得到胶原蛋白提取物。
实施例9
取200g实施例7中经过碱处理后的牛跟腱，加入8000毫升浓度为1.5mol/L的乙酸和10g胃蛋白酶，然后通过射流口直径为5mm、流速为0.5m/s的双喷头撞击流装置喷出环状液膜相，使体系发生撞击，反应体系的温度控制在30℃，撞击反应时间控制在8h，获得提取液，过滤，保留上层清液，调节其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的浓度为5mol/L，静置24h后，将其过滤收集沉淀物；将收集的沉淀物洗涤并冻干，即得到胶原蛋白提取物。
实施例10
将500g牛跟腱去除筋膜、脂肪等杂物，洗净，切成1mm×1mm的小块，加入20000毫升浓度为1mol/L的NaOH溶液，浸泡5h，过滤并用水洗涤至中性；取300g处理后的牛跟腱，加入10000毫升浓度为2mol/L的乙酸和30g胃蛋白酶，然后通过射流口直径为2.5mm、流速为15m/s的双喷头撞击流装置喷出环状液膜相，使体系发生撞击，反应体系的温度控制在20℃，撞击反应时间控制在6h，获得提取液，过滤，保留上层清液，调节其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的浓度为3mol/L，静置24h后，将其过滤收集沉淀物；将收集的沉淀物洗涤并冻干，即得到胶原蛋白提取物。
本发明实施例1-10反应条件以及胶原蛋白的得率见表1，胶原蛋白的提取率最高可达13.2～15.3％，其中各实施例中胶原蛋白得率的计算公式为：胶原蛋白提取物的质量/未经预处理的牛跟腱的质量*100％。
表1实施例1-10反应条件以及胶原蛋白的得率
本发明胶原蛋白的提取时间为2.5～8小时，而传统的机械搅拌提取时间通常为12～72小时，超声波提取时间虽然比较短，但是使用该方法提取的胶原纯度较低，如图1的SDS-PAGE胶图中使用超生辅助提取的某公司样品，含有较多的杂带；同时由图1也可以看出实施例中提取的胶原蛋白纯度较高，因此本专利所述方法可以在保证胶原蛋白纯度较高的条件下大大缩短胶原蛋白的生产周期。另外，经分析，实施例1-10提取得到的胶原蛋白的主要分子量约为【10KDa】，而初始牛跟腱中胶原蛋白的分子量为【30KDa】，由此说明，本发明的撞击流辅助提取技术将胶原分子从稳定的三螺旋结构解螺旋为单螺旋结构，而且其机械力度不足以打断胶原分子链，不会引起胶原分子的降解。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。