本发明属于生物工程与水产疫病检测技术领域，具体涉及一种抗急性肝胰腺坏死综合症毒素蛋白卵黄抗体、其制备方法及应用。
背景技术：
自2009年以来，早期死亡综合症(EMS)，又称急性肝胰腺坏死综合症(AHPNS)给亚洲，特别是东南亚和中国的对虾养殖产业造成了前所未有的冲击。除了大规模减产外，该疾病还带来了诸多负面问题，例如：对虾养殖就业问题、社会福利问题、对虾供求问题和全球对虾总体价格问题等等。
2013年5月，美国亚利桑那大学水产病理实验室(UAZ-APL)定义急性肝胰腺坏死综合症(AHPNS)病原为副溶血弧菌的特异菌株，该菌株能够产生毒素并诱导健康对虾致病。2014年，在世界范围内普遍证实目前APHND的病因与副溶血弧菌所携带的毒素质粒所表达的PirA和PirB两种毒素相关。
目前针对该疾病的诊断集中在对毒素质粒的基因检测。现阶段已出现了一种商业化的基因检测试剂盒和三种通过基础研究得出的不同引物设计得到的诊断方法。
CN 103667498 A公开了副溶血性弧菌的检测方法。所述方法用于副溶血性弧菌检测的特异性引物是根据副溶血性弧菌种特异性基因tlh的保守区域所设计的一对外围引物、一对交叉引物和一对特异性检测探针；副溶血性弧菌种特异性基因tlh是编码副溶血性弧菌不耐热溶血毒素TLH的毒力基因。检测方法：副溶血性弧菌模板DNA的提取；外围引物的验证；交叉引物恒温扩增反应体系的建立；交叉引物恒温扩增程序；扩增产物的检测。CN 102747148 A公开一种副溶血性弧菌检测用引物组，包括下列引物：F3引物：GACGTACCATGTACTAGATC；B3引物：GCCATCACTAGCCATAGCG；FIP引物：CGATCGCCAGCATGCGCGGCATGTCTATTGGTGAGAGGTCTTG；BIP引物：CATGATTTCAATGACGTCCCATTCTGAACCCAAAATCCGGGC。该发明还提供一种使用上述引物组检测副溶血性弧菌的方法。
现阶段的诊断方法存在的不足之处主要在三个方面：(1)基因诊断需要PCR仪器以及复杂的操作过程，且时间一般在4个小时以上，不利于基层以及现场对疫情的快速诊断。而且目前该诊断方法在国内还没有商品化的产品，全球范围内的三种基因检测方法均由国外提供，其中一种已得到商品化。(2)基因诊断只能检测是否存在毒素表达基因，并不能诊断出毒素是否得以表达。而急性肝胰腺坏死综合症得根本原因是表达的毒素蛋白对机体的损伤，因此只有检测毒素蛋白才能更准确地判断疫病的爆发，减少假阳性。(3)目前的基因诊断技术只有95％的准确性，还有待进一步提高。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供免疫诊断急性肝胰腺坏死综合症的蛋白卵黄抗体及其制备工艺和应用。能够对急性肝胰腺坏死综合症这类疾病的防治及检测提供了首创的免疫诊断技术。
为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种抗急性肝胰腺坏死综合症毒素蛋白卵黄抗体，以pirA和pirB蛋白作为抗原免疫产蛋禽类，并从其卵黄中提取，能够与所述pirA和pirB蛋白特异性结合。
本发明的pirA和pirB蛋白可以通过在适当的宿主中表达得到，也可以通过常规肽合成技术化学合成得到，优选的是在适当的宿主中表达得到。
本发明中，所述的pirA和pirB作为一种毒素蛋白，通过基因工程手段从副溶血弧菌中获得，作为一种特异性可产生特异性抗体的蛋白，其产生的抗体具有抗急性肝胰腺坏死综合症，相比于直接用副溶血弧菌直接免疫产生抗体，以pirA和pirB蛋白免疫产生的抗体，专一性更强，效果更好；除此之外，通过pirA和pirB免疫产蛋禽类产生的卵黄抗体，相较于别的抗体，抗性更强，效率更高。
优选地，所述pirA蛋白含有111个氨基酸。
优选地，所述pirA蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示片段，所述序列如下：
优选地，所述pirB蛋白含有438个氨基酸。
优选地，所述pirB蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.2所示片段，所述序列如下：
第二方面，本发明还提供一种如第一方面所述的抗急性肝胰腺坏死综合症毒素蛋白卵黄抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备所述pirA和pirB蛋白抗原；
(2)使用所述pirA和pirB蛋白抗原及佐剂，对产蛋禽类进行注射免疫，检取免疫禽类所产的免疫蛋；
(3)取所述免疫蛋的蛋黄，分离纯化IgY卵黄抗体。
优选地，所述步骤(1)具体包括：
(a)通过PCR扩增技术获得所述pirA和pirB的基因序列，并将pirA和pirB的基因序列重组到表达载体中，构建重组载体；具体地，使用pirA基因序列的PCR扩增引物SEQ ID NO.3-4和pirB基因序列的PCR扩增引物SEQ ID NO.5-6，以提取的副溶血弧菌中的质粒为模板，进行PCR扩增得到SEQ ID NO.7所示的pirA和SEQ ID NO.8所示的pirB的基因序列，再将上述序列重组到表达载体中，可以为pET-28a(+)载体；
(b)将重组载体转化到克隆菌中，筛选含有所述pirA和pirB基因序列的阳性转化菌；具体地，克隆菌可以是DH5α大肠杆菌等，筛选可以通过X-Gal等方法筛选含有所述pirA和pirB基因序列的阳性转化菌；
(c)从所述阳性转化菌中提取所述重组载体，并转化到表达菌中，得到含有所述pirA和pirB基因序列的阳性表达菌，对所述阳性表达菌扩大培养，诱导所述pirA和pirB蛋白表达；具体地，表达菌可以是BL21大肠杆菌等，诱导可以通过IPTG等方法诱导所述pirA和pirB蛋白表达；
(d)分离纯化所述pirA和pirB蛋白，具体地，可以通过Ni-NTA柱亲和层析纯化等方式分离纯化所述pirA和pirB蛋白。
优选地，所述PCR扩增的引物为：
其中，所述pirA基因序列的PCR扩增引物为：
上游引物：5’-CGCGGATCC ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3’(SEQ ID NO.3)，
下游引物：5’-CCCGCGGCCGC TTAGTGGTAATAGATTGTACAGAAA-3’(SEQ ID NO.4)。
其中，所述pirB基因序列的PCR扩增引物为：
上游引物：5’-CGCGGATCC ATGACTAACGAATACGTTGTAACAA-3’(SEQ ID NO.5)，
下游引物：5’-CCCGCGGCCGC CTACTTTTCTGTACCAAATTCATCG-3’(SEQ ID NO.6)。
优选地，所述PCR退火温度为57-58℃。
优选地，步骤(2)所述免疫产蛋鸡的方法为将纯化后的pirA和pirB的重组抗原与弗氏佐剂按1:1混合乳化3-5h，进行四点肌肉注射免疫产蛋禽类。
优选地，所述注射免疫进行五次，第三次免疫后的第二周开始收集鸡蛋，并测定抗体效价，具体地，第一次免疫后隔两周进行第二次免疫，再隔两周进行第三次免疫，隔一个月后进行第四次免疫，最后隔40天进行第五次免疫；通过蒸馏水及硫酸铵溶液稀释，然后沉淀并透析等方法提取所述IgY，最后用SDS-PAGE和Wester bolt电泳检测纯化后的抗体IgY的纯度，用Dot blot检测抗体的滴度，并用间接竞争ELISA检测IgY的效价。
优选地，所述制备方法包括以下步骤：
(1)制备所述pirA和pirB蛋白抗原，具体步骤如下：
(a)通过PCR扩增技术获得所述pirA和pirB的基因序列，并将pirA和pirB的基因序列重组到表达载体中，构建重组载体；
其中，所述pirA基因序列的PCR扩增引物为：上游引物如SEQ ID NO.3所示，下游引物如SEQ ID NO.4所示；
其中，所述pirB基因序列的PCR扩增引物为：上游引物如SEQ ID NO.5所示，下游引物如SEQ ID NO.6所示；
(b)将重组载体转化到克隆菌种，筛选含有所述pirA和pirB基因序列的阳性转化菌；
(c)从所述阳性转化菌中提取所述重组载体，并转化到表达菌中，得到含有所述pirA和pirB基因序列的阳性表达菌，对所述阳性表达菌扩大培养，诱导所述pirA和pirB蛋白表达；
(d)分离纯化所述pirA和pirB蛋白；
(2)使用所述pirA和pirB蛋白抗原及佐剂，对产蛋禽类进行注射免疫，检取免疫禽类所产的免疫蛋，具体步骤如下：
所述免疫产蛋鸡的方法为将纯化后的pirA和pirB的重组抗原与佐剂按1:1混合乳化3-5h，进行四点肌肉注射免疫产蛋禽类；
其中，所述注射免疫进行五次，第三次免疫后的第二周开始收集鸡蛋，并测定抗体效价；
(3)取所述免疫蛋的蛋黄，分离纯化IgY卵黄抗体。
根据本发明，所述抗急性肝胰腺坏死综合症毒素蛋白卵黄抗体的制备方法采用的是本领域的常规方法。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的抗急性肝胰腺坏死综合症毒素蛋白卵黄抗体在制备抗急性肝胰腺坏死综合症的药物和/或试剂中的应用；
优选地，所述综合症为抗对虾急性肝胰腺坏死综合症。
第四方面，本发明提供一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如第一方面所述的抗急性肝胰腺坏死综合症毒素蛋白卵黄抗体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过制备pirA和pirB蛋白抗原；利用所述pirA和pirB蛋白抗原，对产蛋禽类进行注射免疫；然后从所述免疫蛋的蛋黄，提取抗急性肝胰腺坏死综合症毒素蛋白卵黄抗体。本发明的免疫诊断技术为全国首创，制备得到的蛋白卵黄抗体具有良好的活性和特异性，具有良好的稳定性和耐高渗性，同时制备方法是一种全新的效益高、安全、成本低、环保和高效预防等特点，为急性肝胰腺坏死综合症的防治及检测提供有创造性的新方案。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1：制备pirA和pirB蛋白
(1)副溶血性弧菌pirA和pirB基因的克隆，表达载体的构建及鉴定
(a)根据副溶血性弧菌pirA和pirB基因的序列设计引物：
pirA基因序列的PCR扩增引物为：
上游引物：5’-CGCGGATCC ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3’(SEQ ID NO.3)，其中下划线部分为BamH I酶切位点；
下游引物：5’-CCCGCGGCCGC TTAGTGGTAATAGATTGTACAGAAA-3’(SEQ ID NO.4)，其中下划线部分为Not I酶切位点。
pirB基因序列的PCR扩增引物为：
上游引物：5’-CGCGGATCC ATGACTAACGAATACGTTGTAACAA-3’(SEQ ID NO.5)，其中下划线部分为BamH I酶切位点；
下游引物：5’-CCCGCGGCCGC CTACTTTTCTGTACCAAATTCATCG-3’(SEQ ID NO.6)，其中下划线部分为Not I酶切位点。
采用常规小量细菌DNA提取方法即碱裂解法提取副溶血性弧菌的质粒。
PCR扩增：以提取的质粒为模板进行PCR扩增，反应体系如下：
设置一组以水为样本的阴性对照。
反应条件如下：
所获得PCR产物进行1.2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction)纯化。采用TAKARA pMD18-T kit参照说明书体系进行连接。
(b)验证，将得到的pirA和pirB基因序列进行转化并克隆验证；具体地，所述转化为取10ul连接产物加至100ul DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激30s，立即冰上冷却2min。加入890ul LB培养基。37℃培养1h。
采用蓝白斑初步筛选克隆，取40ul X-Gal和8ul IPTG混合均匀后涂布于氨苄抗性培养基上，室温静置干燥，于其上涂布100ul转化培养菌夜，37℃过夜培养。
具体地，所述PCR验证M13引物，对经过夜培养后的透明无色单菌落进行PCR，具体如下：
标记平板上的预选的单菌落，用枪头依次挑取单菌落重悬于10ul灭菌去离子水中，沸水10min处理。12000g离心1min，取上清为模板，PCR体系如下：
设置一组以水为样本的阴性对照。
反应条件如下：
所述酶切采用将过夜培养的菌夜采用试剂盒的提取的方法纯化质粒，电泳检测无误后进行双酶切，酶切体系如下：
同时酶切Pet28a质粒，作为阴性对照，酶切温度为37℃，时间1h。所获得酶切产物进行1.2％的琼脂糖凝胶回收目的条带。
(b)通过同源重组法，将连接产物重组到表达载体体pET-28a(+)(购自TAKARA公司)中，构建重组载体；将所述重组载体转化到克隆菌DH5α大肠杆菌中，筛选含有所述pirA和pirB基因序列的阳性转化菌；具筛选可以通过X-Gal等方法筛选含有所述pirA和pirB基因序列的阳性转化菌；
具体地，将上述中回收到的目的片段和载体进行连接。采用TAKARAT4连接酶体系如下：
按上述方法将连接产物转化到DH5α感受态，并在LB(Kan+)平板进行培养，37℃过夜，挑取单菌落进行PCR鉴定。
(c)从所述阳性转化菌中提取所述重组载体，PCR验证并酶切验证，验证基因片段的大小，证明PCR得到的序列正确。将所述测序证明正确的重组载体转化到表达菌BL21大肠杆菌中，得到含有所述pirA和pirB基因序列的阳性表达菌；
具体地，挑取6个单菌落37℃过夜培养。将过夜培养的菌液以1:100的比例加入5ml Amp+LB培养基中，37℃220rpm培养2h。取出1ml菌液作为未诱导对照，其余按照体积加入IPTG至终浓度为0.4mM，37℃180rp培养4h。取1ml菌液12000g离心10min，弃上清，用100ul去离子水重悬沉淀，加入等体积的2×SDS loadingbuffer，沸水浴10min，取上清用12％SDS-PAGE电泳检测。
将经检测诱导成功的菌株扩大培养和诱导，将过夜培养的菌液1:100稀释至200ml新鲜LB培养基中，按照上述诱导条件对其进行诱导。
经诱导后的菌液12000g离心10min，收集菌体。以1/10体积的裂解缓冲液重悬菌体，超声破碎，控制功率200W，工作条件为超声4s暂停10s 90次，以冰浴降温，重复3次以彻底破碎细菌。将经超声破碎处理的菌液12000g离心10min后，分别取上清和沉淀经12％SDS-PAGE验证蛋白表达方式。
(d)分离纯化所述pirA和pirB蛋白，具体地，可以通过Ni-NTA柱亲和层析纯化等方式分离纯化所述pirA和pirB蛋白。
具体地，可以采用GE公司的Ni-NTA亲和层析预装柱(NiSepharose High Performance)按照产品说明书纯化目的蛋白pirA和pirB。实验中，以50-100cm/h的线性流速用蒸馏水洗5个柱体积，以150cm/h的线性流速用6个柱体积的结合缓冲液平衡柱子，然后加入预处理过的样品，用缓冲液洗涤，直到吸收达到基线。采用逐步洗脱法用洗脱缓冲液洗脱，收集各阶段样品，SDS-PAGE检测蛋白纯化效果。
实施例2：免疫蛋鸡
免疫，将pirA和pirB蛋白作为抗原与等体积的费氏佐剂混合，采用皮下多点注射免疫蛋鸡；
具体地，测定纯化后毒素蛋白的浓度，用PBS将纯化后的重组蛋白的浓度调整至0.01～0.1mg/ml，将调整后的重组蛋白与佐剂按照1:1比例相混合后按照公司特有的五次两途径免疫的方式免疫蛋鸡。第一次免疫为1ml重组蛋白与1ml弗氏完全佐剂充分混合后进行胸肌四点注射，两周后用0.5ml重组蛋白与0.5ml弗氏不完全佐剂充分混合后进行胸肌四点注射免疫。两周后再次重复以上操作，但免疫总剂量改为1.5ml。第四次免疫为一个月以后，采用0.75ml重组蛋白与0.5ml弗氏不完全佐剂充分混合后进行翅静脉注射免疫。40天后重复以上操作。至此一共五次免疫完成。；第三次免疫结束7天后开始收集鸡蛋提取纯化IgY。
实施例3：提取抗急性肝胰腺坏死综合症毒素蛋白卵黄抗体
(1)卵黄抗体的初步分离：将卵黄液与醋酸-醋酸钠的酸化水缓冲液按1：10混合，4度静置过夜，10000g离心20min，留上清。缓慢加入饱和硫酸铵至终浓度为35％，4度静置至明显分层。将混合液10000g离心20min，去上清，沉淀用30ml PBS溶解。缓慢加入饱和硫酸铵至终浓度为35％，4度静置至明显分层。10000g离心20min，去上清，沉淀用PBS溶解；
(2)抗PEDV特异性卵黄抗体的免疫亲和层析：将重组得到的Pri毒素蛋白与HiTrap进行偶联，制备得到亲和层析柱。将步骤(1)得到的粗提卵黄抗体经Pri毒素蛋白亲和层析柱以1ml/min的速度过柱，最后用洗脱液洗下挂在柱上的抗Pri毒素蛋白的特异性卵黄抗体，经离心后用PBS重悬抗体沉淀得到抗Pri毒素蛋白特异性卵黄抗体液。
实施例4：蛋白卵黄抗体的纯度和效价测定
(1)以1:100的比例用0.01M PBS稀释后测定溶液蛋白液浓度；
具体地，以PBS调零，以紫外分光光度计测蛋白含量，按如下公式：蛋白含量(mg/ml)＝(1.45×OD280-0.74×OD260)×样品稀释度，计算蛋白含量。用SDS-PAGE电泳检测纯化抗体IgY，图谱呈现单一条带。
(2)用间接竞争ELISA检测IgY的效价；
具体地，IgY的效价为1:12500-1:48300
实施例5：蛋白卵黄抗体对急性肝胰腺坏死综合症的体外抑制
取6支装有10mL液体培养基的试管，个加入1mL指示菌悬液，使细菌浓度为106-7cfu/mL，向其中的5支试管分别加入1mL不同浓度的IgY，使抗体的终浓度分别为1mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、8mg/mL和10mg/mL，剩下的一支作为对照，加入1mg/mL无菌的PBS。将6支试管置于37℃恒温箱总培养，分别在第1h、3h和5h取培养液，用稀释平板法计算活菌数。
结果表明，制备的蛋白卵黄抗体IgY在浓度达到6mg/mL的时候，对副溶血弧菌具有明显的生长抑制作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市宝舜泰科技产业股份有限公司
<120> 免疫诊断急性肝胰腺坏死综合症的蛋白卵黄抗体及其制备工艺和应用
<130> 2015
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ser Asn Asn Ile Lys His Glu Thr Asp Tyr Ser His Asp Trp Thr
1 5 10 15
Val Glu Pro Asn Gly Gly Val Thr Glu Val Asp Ser Lys His Thr Pro
20 25 30
Ile Ile Pro Glu Val Gly Arg Ser Val Asp Ile Glu Asn Thr Gly Arg
35 40 45
Gly Glu Leu Thr Ile Gln Tyr Gln Trp Gly Ala Pro Phe Met Ala Gly
50 55 60
Gly Trp Lys Val Ala Lys Ser His Val Val Gln Arg Asp Glu Thr Tyr
65 70 75 80
His Leu Gln Arg Pro Asp Asn Ala Phe Tyr His Gln Arg Ile Val Val
85 90 95
Ile Asn Asn Gly Ala Ser Arg Gly Phe Cys Thr Ile Tyr Tyr His
100 105 110
<210> 2
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Thr Asn Glu Tyr Val Val Thr Met Ser Ser Leu Thr Glu Phe Asn
1 5 10 15
Pro Asn Asn Ala Arg Lys Ser Tyr Leu Phe Asp Asn Tyr Glu Val Asp
20 25 30
Pro Asn Tyr Ala Phe Lys Ala Met Val Ser Phe Gly Leu Ser Asn Ile
35 40 45
Pro Tyr Ala Gly Gly Phe Leu Ser Thr Leu Trp Asn Ile Phe Trp Pro
50 55 60
Asn Thr Pro Asn Glu Pro Asp Ile Glu Asn Ile Trp Glu Gln Leu Arg
65 70 75 80
Asp Arg Ile Gln Asp Leu Val Asp Glu Ser Ile Ile Asp Ala Ile Asn
85 90 95
Gly Ile Leu Asp Ser Lys Ile Lys Glu Thr Arg Asp Lys Ile Gln Asp
100 105 110
Ile Asn Glu Thr Ile Glu Asn Phe Gly Tyr Ala Ala Ala Lys Asp Asp
115 120 125
Tyr Ile Gly Leu Val Thr His Tyr Leu Ile Gly Leu Glu Glu Asn Phe
130 135 140
Lys Arg Glu Leu Asp Gly Asp Glu Trp Leu Gly Tyr Ala Ile Leu Pro
145 150 155 160
Leu Leu Ala Thr Thr Val Ser Leu Gln Ile Thr Tyr Met Ala Cys Gly
165 170 175
Leu Asp Tyr Lys Asp Glu Phe Gly Phe Thr Asp Ser Asp Val His Lys
180 185 190
Leu Thr Arg Asn Ile Asp Lys Leu Tyr Asp Asp Val Ser Ser Tyr Ile
195 200 205
Thr Glu Leu Ala Ala Trp Ala Asp Asn Asp Ser Tyr Asn Asn Ala Asn
210 215 220
Gln Asp Asn Val Tyr Asp Glu Val Met Gly Ala Arg Ser Trp Cys Thr
225 230 235 240
Val His Gly Phe Glu His Met Leu Ile Trp Gln Lys Ile Lys Glu Leu
245 250 255
Lys Lys Val Asp Val Phe Val His Ser Asn Leu Ile Ser Tyr Ser Pro
260 265 270
Ala Val Gly Phe Pro Ser Gly Asn Phe Asn Tyr Ile Ala Thr Gly Thr
275 280 285
Glu Asp Glu Ile Pro Gln Pro Leu Lys Pro Asn Met Phe Gly Glu Arg
290 295 300
Arg Asn Arg Ile Val Lys Ile Glu Ser Trp Asn Ser Ile Glu Ile His
305 310 315 320
Tyr Tyr Asn Arg Val Gly Arg Leu Lys Leu Thr Tyr Glu Asn Gly Glu
325 330 335
Val Val Glu Leu Gly Lys Ala His Lys Tyr Asp Glu His Tyr Gln Ser
340 345 350
Ile Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Ile Lys Tyr Val Asp Val Ile Ala Asn
355 360 365
Gly Pro Glu Ala Ile Asp Arg Ile Val Phe His Phe Ser Asp Asp Arg
370 375 380
Thr Phe Val Val Gly Glu Asn Ser Gly Lys Pro Ser Val Arg Leu Gln
385 390 395 400
Leu Glu Gly His Phe Ile Cys Gly Met Leu Ala Asp Gln Glu Gly Ser
405 410 415
Asp Lys Val Ala Ala Phe Ser Val Ala Tyr Glu Leu Phe His Pro Asp
420 425 430
Glu Phe Gly Thr Glu Lys
435
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgcggatcca tgagtaacaa tataaaacat gaaac 35
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cccgcggccg cttagtggta atagattgta cagaaa 36
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgcggatcca tgactaacga atacgttgta acaa 34
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccgcggccg cctacttttc tgtaccaaat tcatcg 36