一种用于捕获肿瘤细胞的抗人角蛋白18的单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明属于单克隆抗体生物技术领域，特别涉及一种用于捕获肿瘤细胞的抗人角蛋白18的单克隆抗体及其应用。

背景技术：

角蛋白18(CK18)是一类角蛋白的一种，大小约为48kd；在人体单层上皮组织里面广泛表达，一般和CK8成对出现。CK8/CK18的突变可以引起多种疾病(Gastroenterology 2005；129:885)。CK18是多种肿瘤诊断的血清标志物，同时也是肝损伤的血清标志物(Am J Clin Pathol 2005；123:66，Clin Bi ochem 2002；35:327，J Histochem Cytochem 2005；53:229)；而CK18在乳腺癌中的低表达是不良预后的标志(Clin Cancer Res 2004；10:2670)。

进入人体外周血的肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)。它的捕获、鉴定在肿瘤诊断以及精准医疗指导用药中起到重要的作用。CK18是临床广泛应用的CTC鉴定标志物。目前市场中有大量产品基于抗体捕获循环肿瘤细胞，而大部分是使用抗体偶联其他磁珠等对肿瘤细胞进行富集。但未见使用CK18抗体捕获CTC的产品。市面上现有的CK18抗体，全部没有数据表明可以用于活肿瘤细胞富集，从而限制了市场上的抗体在CTC捕获这个重要领域的应用。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种用于捕获肿瘤细胞的抗人角蛋白18(CK18)的单克隆抗体，识别并结合人肿瘤细胞膜表面标志物CK18胞外片段的高亲和力鼠单抗，使该抗体能够应用于针对CK18蛋白的活细胞富集、分选、流式细胞术、免疫荧光、免疫共沉淀及Western Blotting。

本发明的第二目的在于提供一种上述用于捕获肿瘤细胞的抗人角蛋白18(CK18)的单克隆抗体在富集肿瘤活细胞中的应用，特别是应用于捕获富集表达CK18的肺癌细胞等循环细胞。

本发明的技术方案如下：

本发明合成人角蛋白18(CK18)的胞外区多肽，以其作为免疫原，免疫小鼠得到淋巴细胞，并利用杂交瘤细胞融合技术制得融合细胞，经免疫印迹法、有限稀释法和ELISA法，得到能够富集肿瘤活细胞的抗人角蛋白18(CK18)的单克隆抗体的细胞株，及由该细胞株分泌的单克隆抗体，并经免疫酶联，蛋白印记，免疫荧光，免疫共沉淀加质谱和活细胞杂交捕获等验证，确定最有效抗体。

一种用于捕获肿瘤细胞的抗CK18单克隆抗体，所述的抗CK18单克隆抗体的重链可变区序列包含SEQ ID NO.8所示的CDR3的氨基酸序列；和轻链可变区序列包含SEQ ID NO.15所示的CDR3的氨基酸序列。

优选为，所述的重链可变区序列包含SEQ ID NO.4所示的CDR1的氨基酸序列、SEQ ID NO.6所示的CDR2的氨基酸序列和SEQ ID NO.8所示的CDR3的氨基酸序列；所述的轻链可变区序列包含SEQ ID NO.11所示的CDR1的氨基酸序列和SEQ ID NO.15所示的CDR3的氨基酸序列。

优选为，所述的重链可变区序列包含SEQ ID NO.4所示的CDR1的氨基酸序列、SEQ ID NO.6所示的CDR2的氨基酸序列和SEQ ID NO.8所示的CDR3的氨基酸序列；所述的轻链可变区序列包含SEQ ID NO.11所示的CDR1的氨基酸序列、SEQ ID NO.13所示的CDR2的氨基酸序列和SEQ ID NO.15所示的CDR3的氨基酸序列。

优选为，所述的重链可变区序列的框架区依次包含SEQ ID NO.3、5、7和9所示的氨基酸序列，和所述的轻链可变区序列的框架区依次包含SEQ ID NO.10、12、14和16所示的氨基酸序列。

优选为，所述的重链可变区序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述的轻链可变区序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明还公开了上述的用于捕获肿瘤细胞的抗CK18单克隆抗体在富集肿瘤活细胞中的应用，特别是在捕获富集表达CK18的肺癌细胞等循环细胞上的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

通过实验验证，本发明的一种用于捕获肿瘤细胞的抗人角蛋白18(CK18)的单克隆抗体具有高亲和力，高特异性，多应用场景等特点，最大特点在于靶向CK18胞外区，并且提供足够的亲和力捕获表达CK18的肺癌细胞，且是第一个已知可以应用于活细胞富集捕获的CK18抗体，使之具有用于循环肿瘤细胞(CTC)捕获的潜在可能。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

图1为重组蛋白SDS-PAGE的示意图；

图2为PC9人肺癌细胞在克隆号1P1anti-CK18抗体的内源蛋白印记WB验证示意图；

图3为PC9人肺癌细胞在克隆号1P1anti-CK18抗体的免疫荧光IF验证示意图；

图4为PC9人肺癌细胞与克隆号1P1anti-CK18抗体的杂交原理示意图；

图5为PC9人肺癌细胞与克隆号1P1anti-CK18抗体的捕获富集示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本发明未特别的说明，以下实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段，且所用的原料、试剂也均为市售可购买得到的商品。

实施例1一种用于捕获肿瘤细胞的抗CK18单克隆抗体杂交瘤细胞的制备和抗CK18单克隆抗体的制备和纯化

1.1抗原的制备

合成人CK18胞外区多肽’LEDGEDFNLGDALD’作为免疫原，该多肽偶联了VLP以及传统KLH系统的免疫原性增强因子。

1.2免疫小鼠

每组抗原将用来免疫6只Balb/c小鼠(8-12周龄)，并监测其血清效价以决定最优的免疫次数。每个6免疫原多肽混合成一组。每个可溶片段免疫原单独为一组。优化了的佐剂和免疫方法能产生针对大多数抗原多肽的高亲和力的抗体(IgG亚型)。初次免疫后会经过3到4次的加强，加强后将取小鼠血清检测滴度(重组蛋白作为抗抗原包被)。滴度合格的小鼠将冲击一次并用于融合，不合格的小鼠将继续一到两次加强，至滴度最高后融合。

CK18重组蛋白由上海交通大学系统生物医学研究院癌基因及相关基因国家重点实验室提供，蛋白序列取自UniProt P05783：

MSFTTRSTFSTNYRSLGSVQAPSYGARPVSSAASVYAGAGGSGSRISVSRSTSFRGGMGS

GGLATGIAGGLAGMGGIQNEKETMQSLNDRLASYLDRVRSLETENRRLESKIREHLEKKG

PQVRDWSHYFKIIEDLRAQIFANTVDNARIVLQIDNARLAADDFRVKYETELAMRQSVEN

DIHGLRKVIDDTNITRLQLETEIEALKEELLFMKKNHEEEVKGLQAQIASSGLTVEVDAP

KSQDLAKIMADIRAQYDELARKNREELDKYWSQQIEESTTVVTTQSAEVGAAETTLTELR

RTVQSLEIDLDSMRNLKASLENSLREVEARYALQMEQLNGILLHLESELAQTRAEGQRQA

QEYEALLNIKVKLEAEIATYRRLLEDGEDFNLGDALDSSNSMQTIQKTTTRRIVDGKVVS

ETNDTKVLRH

DNA序列取自NCBI CCDS31809.1：

ATGAGCTTCACCACTCGCTCCACCTTCTCCACCAACTACCGGTCCCTGGGCTCTGTCCAGGCGCCCAGCT

ACGGCGCCCGGCCGGTCAGCAGCGCGGCCAGCGTCTATGCAGGCGCTGGGGGCTCTGGTTCCCGGATCTC

CGTGTCCCGCTCCACCAGCTTCAGGGGCGGCATGGGGTCCGGGGGCCTGGCCACCGGGATAGCCGGGGGT

CTGGCAGGAATGGGAGGCATCCAGAACGAGAAGGAGACCATGCAAAGCCTGAACGACCGCCTGGCCTCTT

ACCTGGACAGAGTGAGGAGCCTGGAGACCGAGAACCGGAGGCTGGAGAGCAAAATCCGGGAGCACTTGGA

GAAGAAGGGACCCCAGGTCAGAGACTGGAGCCATTACTTCAAGATCATCGAGGACCTGAGGGCTCAGATC

TTCGCAAATACTGTGGACAATGCCCGCATCGTTCTGCAGATTGACAATGCCCGTCTTGCTGCTGATGACT

TTAGAGTCAAGTATGAGACAGAGCTGGCCATGCGCCAGTCTGTGGAGAACGACATCCATGGGCTCCGCAA

GGTCATTGATGACACCAATATCACACGACTGCAGCTGGAGACAGAGATCGAGGCTCTCAAGGAGGAGCTG

CTCTTCATGAAGAAGAACCACGAAGAGGAAGTAAAAGGCCTACAAGCCCAGATTGCCAGCTCTGGGTTGA

CCGTGGAGGTAGATGCCCCCAAATCTCAGGACCTCGCCAAGATCATGGCAGACATCCGGGCCCAATATGA

CGAGCTGGCTCGGAAGAACCGAGAGGAGCTAGACAAGTACTGGTCTCAGCAGATTGAGGAGAGCACCACA

GTGGTCACCACACAGTCTGCTGAGGTTGGAGCTGCTGAGACGACGCTCACAGAGCTGAGACGTACAGTCC

AGTCCTTGGAGATCGACCTGGACTCCATGAGAAATCTGAAGGCCAGCTTGGAGAACAGCCTGAGGGAGGT

GGAGGCCCGCTACGCCCTACAGATGGAGCAGCTCAACGGGATCCTGCTGCACCTTGAGTCAGAGCTGGCA

CAGACCCGGGCAGAGGGACAGCGCCAGGCCCAGGAGTATGAGGCCCTGCTGAACATCAAGGTCAAGCTGG

AGGCTGAGATCGCCACCTACCGCCGCCTGCTGGAAGATGGCGAGGACTTTAATCTTGGTGATGCCTTGGA

CAGCAGCAACTCCATGCAAACCATCCAAAAGACCACCACCCGCCGGATAGTGGATGGCAAAGTGGTGTCT

GAGACCAATGACACCAAAGTTCTGAGGCATTAA

蛋白表达载体采用Novagen pET28a表达载体。

表达体系为E.coli Rosetta细胞，IPTG诱导表达体系。

蛋白纯化体系为Ni-NTA(Invitrogen)纯化，SDS-PAGE检验表达合格，如图1所示。

1.3血清检测和筛选

免疫小鼠眼眶取血，并用ELISA检测血清滴度(重组蛋白作为抗原包被)。血清效价需大于10K，否则继续加强免疫。

1.4融合及筛选

取全脾和1/2的淋巴结，与骨髓瘤SP2/0细胞系融合。工艺为优化过的PEG融合。融合细胞铺到4块384孔板上(每孔细胞102到104)，进行培养。收集所有孔的上清，用ELISA对多肽检测原进行筛选，镜检有细胞的阳性孔转到96孔板继续培养。生长几天后，收集所有孔的上清用ELISA检测与可溶片段检测原的反应。阳性孔进一步检测不同稀释度的可溶片段检测原结合，以进行亲和力排序。每个多肽免疫原亲和力最高的20个亲代克隆进入亚克隆。每个可溶片段免疫原亲和力最高的60个亲代克隆进入亚克隆。

1.5亚克隆及筛选

通过有限稀释法和ELISA筛选进行亚克隆，得到单克隆杂交瘤细胞。细胞铺96孔板，并培养至覆盖约1/6的底部。ELISA检测每个孔上清针对可溶片段检测原和相应多肽检测原的反应，取OD值高且细胞状态良好的两个孔进入下轮亚克隆。重复上述步骤直到孔中细胞株阳性率100％。此时我们得到单克隆细胞株。经过最后一轮亚克隆后，所有阳性细胞立即扩大培养，一部分冻存供以后使用，另一部分进行上清或腹水制备。

1.6抗体上清制备和纯化

最终我们获得8株单克隆细胞株，并通过腹部注射到F1小鼠用于抗体生产。产生的腹水用Protein A/G纯化，并用于后续检测。

实施例2抗CK18单克隆抗体的验证

对获得的8株单克隆抗体细胞株进行免疫酶联，蛋白印记，免疫荧光，免疫共沉淀加质谱，活细胞杂交捕获等验证，确定最有效抗体。

2.1抗体与抗原多肽的Elisa(免疫酶联)配对验证

取待配对腹水抗体包被96孔ELISA板，孵育，洗涤后脱脂牛奶过夜封闭，PBS洗涤，4℃保存待用。抗原多肽孵育，PBS洗涤，同时设置对照。HRP标记检测抗体，加入到孵育有前述的ELISA板中。TMB显色反应，酶标仪读数。我们筛选得到8个细胞株的效价如表一所示：

表一

2.2抗体的内源蛋白印记(WB)验证

使用PC9人肺癌细胞系全细胞裂解液，抗体稀释浓度1：1000及1：2000进行WB验证。实验结果显示，anti-CK18(克隆号1P1)在PC-9的WB验证中，可以特异性的识别48KD条带，与预期大小相符，如图2所示。

2.3抗体免疫荧光(IF)验证

PC9细胞使用PFA固定，在不通透细胞的条件下进行一抗孵育，因此抗体直能结合于膜蛋白胞外区。anti-CK18(克隆号1P1)的工作浓度为1：1000。使用FITC耦联羊抗鼠二抗进行显色，结果如图3所示，本抗体可以应用于CK18的免疫荧光实验。

2.4抗体的免疫共沉淀(IP)加质谱验证

提取PC9膜蛋白1mg，使用anti-CK18(克隆1P1)进行免疫沉淀，IP产物切取48kd大小条带进行质谱检测。质谱结果如表二所示，CK18在IP样品中大量富集，说明本抗体对CK18识别的特异性高。并且，本抗体可以应用于IP实验。

表二

2.5肿瘤活细胞杂交捕获实验

使用芯片点样仪将anti-CK18(克隆号1P1)抗体及对照抗体点制于以NC膜为基质的玻璃片，形成直径为100um的抗体点。将细胞核荧光着色(染料：syto14)的PC-9细胞悬液以10⁷/ml的密度孵育在抗体芯片上，室温孵育半小时。PBS轻柔清洗三遍。使用GenePix荧光芯片扫描仪扫描芯片。杂交原理示意如图4所示。

实验结果如图5所示，PC-9细胞在anti-CK18(克隆号1P1)抗体点上大量富集，而在对照抗体上完全无结合。结果说明本抗体可以应用于表达CK18的肿瘤活细胞捕获富集。

实施例3

anti-CK18(克隆号1P1)抗体的可变区测序采用Novagen Mouse Ig-Primer Set#69831-3。RNA提取、反转录cDNA、PCR扩增依照Novagen User Protocol TB326Rev.C 0308。扩增序列克隆采用Thermo Fisher TOPO TA Cloning Kit，Cat:450641。构建好的载体由GENEWIZ提供测序及分析服务。序列同时在www.igmt.org上进行可变区序列分析。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

SEQUENCE LISTING

<110> 艾比玛特医药科技（上海）有限公司

<120> 一种用于捕获肿瘤细胞的抗人角蛋白18的单克隆抗体及其应用

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> V-region

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<223> VH

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Phe Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Cys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Ser Ala Tyr Tyr Tyr Gly Ser Phe Tyr Asp Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> VL

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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

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Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<213> 人工序列

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Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr

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Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met Gly

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Tyr

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Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Cys

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<221> V_region

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<223> VHF3

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Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr

1 5 10 15

Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu Gln Met Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

35

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<221> V_region

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Ala Arg Ala Ser Ala Tyr Tyr Tyr Gly Ser Phe Tyr Asp Tyr Ala Met

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Asp Tyr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> V_region

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<223> VHF4

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Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> V_region

<222> (1)..(26)

<223> VLF1

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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser

20 25

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<212> PRT

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<221> V_region

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Gln Asn Val Asp Thr Ala

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> V_region

<222> (1)..(17)

<223> VLF2

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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

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<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> V_region

<222> (1)..(3)

<223> VLCDR2

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Ser Ala Ser

1

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> V_region

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<223> VLF3

<400> 14

Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser Glu Asp Leu Ala

20 25 30

Asp Tyr Phe Cys

35

<210> 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> V_region

<222> (1)..(9)

<223> VLCDR3

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Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Phe Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> V_region

<222> (1)..(10)

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Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10