一种HuR蛋白可识别的RNA片段及在HuR活性检测中的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，更特别地，涉及一种hur蛋白可识别的rna片段及其在检测细胞内hur转录后调控活性中的应用。

背景技术：

人抗原r(humanantigenr，hur)属于rna结合蛋白中胚胎致死异常视觉(embryoniclethalabnormalvision，elav)家族，elav家族包括4个成员：hub、huc、hud及hur，前3个成员主要在神经组织和生殖器官中表达，并与神经发育有关。近年来研究表明，hur在靶基因转录后调控中发挥稳定mrna和促进翻译的作用。多项实验证实：hur结合的靶因子多是癌基因、抑癌基因及肿瘤发生的调控因子，因而hur与多种肿瘤的发生、发展及预后密切相关。hur与人乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌和胃癌的发生、侵袭及转移有关，可能是影响肿瘤发生、发展及预后的重要因素。

hur是一种mrna结合蛋白，其活性形式能够与mrna的3’-utr结合，并通过该方式来调控mrna的稳定性和翻译效率。因此，针对hur的研究需要检测hur的活性形式。

然而，目前检测内源性hur仍然依靠的是westernblot技术，虽然灵敏度高，但检测到的只是hur蛋白含量的差异，并不能直接体现其激活水平的改变。

因此，需要设计一种新的用于检测细胞内hur转录后调控活性的方法。

技术实现要素：

发明人通过研究发现，在hur蛋白上有3个rna识别模序(rrms)，可以与ares特定位点结合。rrm1和rrm2与富含u/a拷贝序列结合。rrm3与poly(a)尾结合，帮助维持rna蛋白复合物的稳定。通过分析，发明人发现，将seqidno:1所示的序列编码的rna序列接在mrna3’端时，hur蛋白可有效结合该mrna的3’区，激活该mrna翻译并提高mrna的稳定性。

基于以上研究，本发明提供了一种hur蛋白可识别的rna片段，其由seqidno:1所示的dna序列转录得到。

本发明还提供了上述rna片段在检测细胞内hur转录后调控活性中的应用。

本发明还提供了一种用于检测细胞内hur转录后调控活性的方法，其包括以下步骤：

s1：将包含报告基因表达框的报告基因系统导入所述细胞，所述报告基因表达框的3’-utr区包含seqidno:1所示的dna片段；

s2：通过检测所述报告基因的表达来计算所述细胞内hur转录后调控活性。可将报告基因的表达强度作为指示hur转录后调控活性的指标。

优选地，所述报告基因系统为双荧光素酶报告基因系统，包括荧光素酶i表达框和荧光素酶ii表达框，所述dna片段连接在荧光素酶i表达框的3’-utr区，所述荧光素酶i激发产生的荧光波长与荧光素酶ii不同。将hur转录后调控活性表示为荧光素酶i激发产生的荧光强度与荧光素酶ii激发产生的荧光强度的比值。

优选地，所述荧光素酶i表达框和荧光素酶ii表达框处于同一个载体上。

优选地，所述双荧光素酶报告基因系统通过将所述dna片段插入至质粒psicheck中海肾荧光素酶基因的3’-utr区得到。

优选地，s1具体包括：

s11：将所述细胞培养至贴壁，并恢复形态；

s12：将所述报告基因系统转染至细胞中。

优选地，s2具体包括：

s21：转染后将细胞继续培养24-36小时，洗涤细胞；

s22：分别检测转染后的细胞中的荧光素酶i和荧光素酶ii的活性；

s23：将荧光素酶ii活性归一化荧光素酶i活性得到值作为衡量hur转录后调控活性的指标。

通过使用本发明的rna片段和方法，可直接针对性地检测细胞内hur的转录后调控活性，而非仅仅检测其转录本或蛋白质的含量，从而使得能够更准确地分析hur作为mrna结合因子在一些发育生物学和病理学发展中所起的作用。

附图说明

图1为xhoi与noti对重组质粒进行双酶切后的琼脂糖凝胶电泳照片；

图2为分别转染有psicheck2和psicheck2-hur-rlu的人前列腺癌细胞系pc-3、人宫颈癌细胞系hela和人胚肾细胞系hek-293t细胞中的相对hur活性(即，萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值)的统计图；

图3为分别转染有pcdna-tap(即，空载体)和pcdna-tap-hur的人前列腺癌细胞系pc-3、人宫颈癌细胞系hela和人胚肾细胞系hek-293t细胞中的相对hur活性(即，萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值)的统计图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.构建hur蛋白可结合的rna片段的dna编码序列

发明人对hur进行研究分析，找到hur结合的mrna核心序列，参考该序列设计出编码hur蛋白可结合的rna片段的dna编码序列，其序列如seqidno:1所示。将其连接至psicheck^tm-2vector海肾荧光素酶基因(hrluc)下游位点，即hrluc3'-utr区，组成hrluc-hurtargetrnamotif-hluc双荧光素酶报告基因质粒。

为保证载体构建的成功，在末端加入相应的限制性内切酶酶切位点的粘性末端，本例在5’端加入xhoi酶切位点的粘性末端(ctcgag)，在3’端加入noti酶切位点的粘性末端(gcggccgc)，序列两边的粘性末端的设计有助于片段与载体的连接。

通过从头合成的方法，分别合成该片段的两条寡核苷酸链，其序列分别如seqidno:2和3所示。两条寡核苷酸链互补配对后形成5’端包含xhoi酶切位点粘性末端和3’端包含noti酶切位点粘性末端的双链dna。100μl退火体系如下：annealingbufferfordnaoligos(5x)20μl、寡核苷酸链(50μm)各20μl，余下为ddh2o。

充分混匀后，设置pcr仪程序进行退火反应，具体程序为：95℃退火2分钟(目的是让dnaoligo充分变性)；每90秒下降1℃，降至25℃后结束反应。dna退火产物用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定，测浓度后置冰上备用。

2.将上述dna片段插入荧光素酶表达载体

本发明实施例选用的荧光素酶表达报告基因质粒为psicheck^tm2质粒。用限制性内切酶xhoi和noti(购自takara公司，xhoi货号为1635，noti货号为1623)对上述psicheck^tm2质粒进行双酶切，20μl酶切体系如下：10xquickcutgreenbuffer2μl，xhoi1μl，noti1μl，psicheck^tm2空载体1μg，余下为ddh2o。

充分混匀后，37℃酶切反应90分钟，用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒双酶切后的情况，然后切胶回收(dna胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，货号为dp209)，回收结束后测样品浓度，置冰上备用。

将退火得到的双链dna连接至psicheck^tm2质粒荧光素酶报告基因质粒上。10μl连接体系如下：dna连接酶(购自takara公司，货号为6022)5μl，双链dna片段与经双酶切的psicheck^tm2载体共5μl。为促进酶连成功率，将dna片段与载体的摩尔比控制在8:1左右。充分混匀后，将酶连体系置于pcr仪中，16℃反应1小时，连接反应结束后得到重组质粒，置于冰上备用。

将重组质粒(含有编码hur蛋白可结合位点的dna序列的psicheck^tm2报告基因质粒)转化至大肠杆菌。具体方法如下：取解冻后的感受态大肠杆菌dh5α，加入上述连接好的重组质粒，轻柔吹打，冰上孵育20分钟，42℃热休克60秒，冰上静置3分钟，然后加入450μl不含抗生素的lb液体培养基，放置于恒温摇床中复苏1小时(37℃，200rpm)。取复苏后的菌液至铺有固体培养基(含氨苄青霉素)培养皿上，用玻璃铺菌器将菌液均匀地铺满整个平皿，放置10分钟后，倒置于37℃孵箱过夜后，观察细菌生长情况。挑取菌落至5ml含氨苄青霉素的lb液体培养基，摇菌(37℃，200rpm)繁殖12小时后提取质粒，1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定。

用内切酶xhoi和noti对上述提取的质粒进行双酶切鉴定，本发明实施例双酶切鉴定如图1所示(泳道1为marker，泳道1-3显示为阳性克隆)。阳性组送至武汉擎科生物技术有限公司测序，确认dna片段已整合至psicheck^tm-2vector报告基因质粒上。至此，含有编码hur蛋白可结合位点的dna片段的psicheck^tm2报告基因质粒(以下均表示为psicheck2-hur-rluc)构建成功。

3.psicheck2-hur-rluc转染细胞

本发明实施例采用人前列腺癌细胞系pc-3、人宫颈癌细胞系hela、人胚肾细胞系hek-293t进行双荧光素酶实验。分别将对数期生长的细胞均匀种植在24孔板内，每孔约10万个细胞，用10％胎牛血清，高糖dmem培养基培养过夜。待细胞贴壁并恢复形态后，将报告基因系统相关质粒转染至细胞中(转染时细胞密度约为60-80％为宜)。使用的转染试剂为neofect(购自零客创智生物科技有限公司，货号为tf20121201)。50μl转染体系如下：质粒0.5μg，neofect转染试剂0.5μl，余下为无血清培养基。

本实验中使用的质粒分别为：psicheck^tm-2vector报告基因质粒、psicheck2-hur-rluc(含有编码hur蛋白可结合位点的dna片段的psicheck^tm-2vector报告基因质粒)、pcdna-tap(空质粒)、pcdna-tap-hur(hur过表达质粒)。

4.计算hur的活性

以萤火虫荧光素酶活性作为内参进行标准化，计算hur活性。具体实验方法如下：转染后的细胞继续培养24-36小时，再弃培养基上清，用1xpbs清洗细胞3次，每次5分钟，清洗细胞时注意操作轻柔，避免正面吹打细胞。采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(购自盖宁生物科技有新公司，货号为gn201-01)进行检测。

本发明实施例为验证该报告基因系统是否具有活性，将psicheck^tm-2质粒和psicheck2-hur-rluc质粒转染至细胞中，检测报告基因系统的活性，测定结果如图2所示，处理组(转染psicheck2-hur-rluc)的相对荧光素酶活性明显高于对照组(转染psicheck^tm-2空载体)。

本发明实施例为验证该报告基因系统是否可以特异性检测hur活性，将pcdna-tap质粒和pcdna-tap-hur质粒分别转染至细胞，结果如图3所示，外源导入hur后，阳性处理组(转染pcdna-tap-hur)荧光活性明显高于对照组(转染pcdna-tap空载体)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120>一种hur蛋白可识别的rna片段及在hur活性检测中的应用

<130>1

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>66

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tggataccgttcgttgttaaccgttgatagccttggtttttaagccgtatatggctgtaa60

ataatt66

<210>2

<211>73

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tcgagtggataccgttcgttgttaaccgttgatagccttggtttttaagccgtatatggc60

tgtaaataattgc73

<210>3

<211>73

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ggccgcaattatttacagccatatacggcttaaaaaccaaggctatcaacggttaacaac60

gaacggtatccac73