本发明涉及一种利用喜树悬浮细胞生产喜树碱和10-羟基喜树碱的方法，属于医药生物
技术领域：
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背景技术：
：喜树(camptothecaacuminate)，别名旱莲、水栗、水桐树、天梓树、旱莲子、千丈树、野芭蕉、水漠子，是珙桐科、喜树属植物。主要分布于中国长江以南地区。1999年8月，经中华人民共和国国务院批准，喜树被列为第一批国家重点保护野生植物，保护级别为ⅱ级。喜树具有很好的药用价值，其果实、树皮、根、树枝、叶均可用药。现代研究表明，喜树植物中主要药用活性成分为生物碱。临床多提取喜树碱用于治疗肿瘤等疾病。同时，喜树碱类药物也是目前临床上常用的三大天然抗癌药物之一。喜树碱最早从我国特有植物喜树(camptothecaacuminata)树皮中分离获得，后来陆续在多种植物中发现，如夹竹桃科的海木狗牙花(ervatamiaheyneana)、茶茱萸科的臭味假柴龙树(nothapodytesfoetida)以及茜草科的短小蛇根草(ophiorrhizapumila)等。喜树碱通过抑制拓扑异构酶i而发挥抗肿瘤活性。通过对喜树碱构效关系研究，衍生出一系列化合物用于治疗胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肠癌、子宫颈癌、胃癌和血液肿瘤等疾病，是全球抗肿瘤药物市场上的主要品种。喜树碱的来源主要有：1)植物提取；2)化学合成。植物提取喜树碱是目前采用的主要方式。然而，喜树碱在植物中的含量较低(一般为0.1-0.2％左右，在新鲜树叶中含量稍高，达0.4-0.5％)，其提取、分离、纯化、制备过程繁琐；另外产喜树碱植物的生长周期均较长，并且喜树碱的积累进程缓慢。单纯从植物中提取势必造成对植物资源和生态环境的巨大破坏。此外，提取过程中大量有机溶剂的使用导致环境污染。喜树碱的化学合成是通过不同的建环方法，例如拆分法、不对称氧化法等，多数方法存在路线过长，总产率过低等不足，较难实现工业化。总之，喜树碱的来源有限，不能满足市场需求(国际市场每年喜树碱需求量3000kg，但是全球喜树碱年产量仅600kg)，需要发现和研发替代资源及技术。随着植物细胞法的建立和运用，目前有很多研究通过该方法获得目的产物以及高附加值的植物次生代谢产物。植物细胞培养法是在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行震荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。该方法具有以下优势：1)不受地理、季节和气候条件的限制；2)节省土地，降低成本，生产周期短，可大大提高经济效益；3)可代替整体植株在工厂内连续生产所需产物；4)可通过添加抑制剂等使生物合成按照人的意志进行；5)可通过诱变筛选，获得高产细胞株，并且可以进行特定的生物转化获得新的有用物质。迄今已有关于通过培养喜树悬浮细胞产喜树碱的报道，并且通过不同的方法使喜树碱含量得到一定的提高，但含量提高倍率较低，通常为3～10倍，如通过添加氮源于喜树悬浮细胞的方法来提高喜树碱的方法，提高倍数最高位3.4倍；或通过紫外照射提高喜树悬浮细胞中喜树碱的产量，提高倍数最高为11倍。这些研究充分表明利用悬浮细胞生产喜树碱成为一种可能，并且采用悬浮细胞生产喜树碱无疑是解决喜树碱原料来源的绿色途径。但还需寻找一种使喜树碱、10-羟基喜树碱含量提高更多的制备方法。技术实现要素：针对现有通过喜树悬浮细胞生产喜树碱和10-羟基喜树碱存在产物含量低的问题，本发明提供了一种通过在喜树悬浮细胞的培养过程中添加诱导因子提高喜树碱和10-羟基喜树碱产量的方法。为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：利用喜树悬浮细胞生产喜树碱和10-羟基喜树碱的方法，包括以下步骤：(1)将喜树悬浮细胞细胞接种到ms30液体培养基进行培养，培养过程中添加山梨糖醇；(2)收集相应的悬浮细胞和细胞培养液；(3)分离提取喜树碱和10-羟基喜树碱。进一步地，在步骤(1)中，添加浓度为10～200g/l的山梨糖醇作为诱导因子，优选浓度为50g/l。进一步地，步骤(1)中的ms30液体培养基含有0.2～1mg/lnaa(萘乙酸)、0.2～1mg/lbap(6-苄基氨基嘌呤)、0.05～0.3mg/l2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸)和20-50mmnh4+/no3-，nh4+与no3-的摩尔比为5:1；喜树悬浮细胞在ms30液体培养基中进行光照摇床培养，培养条件：光照，摇床100～150rpm，温度25±3℃，ph5-6.5。优选含有0.5mg/l萘乙酸、0.5mg/l6-苄基氨基嘌呤、0.1mg/l2,4-二氯苯氧乙酸和40mmnh4+/no3-的ms30液体培养基，所述nh4+与no3-的摩尔比为5:1；培养条件优选：光照25μmolm-2s-l，摇床125rpm，温度25±0.5℃，ph5-6.5。将收集到的悬浮细胞和细胞培养液混合物按常规方法分离提取即可得到喜树碱和10-羟基喜树碱。将收集到的悬浮细胞和细胞培养液混合物经抽滤漏斗过滤至无液体滴出，分别收集滤液与滤纸上的喜树细胞；所述滤液为细胞培养液，其中含有喜树碱和10-羟基喜树碱，将滤液经乙酸乙酯萃取，有机相于40℃减压浓缩干燥得到培养液提取物；所述滤纸上的喜树细胞经60℃干燥研磨破碎，甲醇浸泡过夜，40℃减压浓缩得到细胞提取物，提取物用纯水溶解，乙酸乙酯萃取，有机相于40℃减压浓缩干燥得到细胞提取物；培养液提取物和细胞提取物加入乙酸乙酯溶解，经针头过滤器过滤得到喜树碱和10-羟基喜树碱粗提物。喜树悬浮细胞经培养制得的喜树碱和10-羟基喜树碱粗提物的成分分析显示，山梨糖醇能大幅度提高喜树碱和10-羟基喜树碱的产量，提高倍数为100～500余倍。本发明的有益效果：(1)系统性完整地构建了从喜树种子到无菌幼苗，再到愈伤组织，最后到喜树悬浮细胞的全过程，并且对不同阶段的培养基进行优化；(2)在构建好的喜树悬浮细胞培养液中检测到喜树碱、10-羟基喜树碱的产生；(3)与传统喜树碱和10-羟基喜树碱的制备方法相比，本发明采用山梨糖醇作为诱导因子能100～500余倍地提高喜树碱和10-羟基喜树碱产量。(4)与现有技术相比，本发明所述对象为喜树悬浮细胞，具有生长繁殖迅速，易培养、发酵等优点；利用喜树悬浮细胞获得喜树碱、10-羟基喜树碱的方法简单易控制。具体实施方式以下对本发明的实施方式进行详细说明。实施例一：喜树无菌苗建立1.试验材料1.1植物材料选取正常健康生长的喜树果实，按照常规操作去皮、清洗、消毒。本实施例中采用先去除果实种皮，再依次用5％triton浸泡3min，无菌水反复冲洗，浓度为75％乙醇浸泡1min，1％次氯酸钠溶液浸泡3min，无菌水冲洗10次，每次1min，最后用无菌滤纸吸除喜树种子表面水分，待用。1.2培养基1/2ms固体培养基：1/2ms培养基添加0.35％琼脂(sigmachemical,mo)，ph5.8，121℃高压灭菌30min。2.种子接种到培养基将准备好的种子按常规无菌操作方法接种培养。将准备好的种子接种到本例1.2节中的培养基上，25℃避光培养1周，再光照培养。光照培养条件：白光(40μmolm-2s-l)，光周期为16h，温度25℃，待幼苗长出。实施例二：喜树愈伤组织建立1试验材料1.1植物材料实施例一中得到的无菌幼苗。按照常规无菌操作，用无菌手术刀将叶片切成10mm×10mm小块，待用。1.2培养基7种以ms30(ms培养基添加30mg/l的蔗糖)为基础培养基，以及不同组成和浓度的生长调节因子的固体培养基。如表1：表1培养基a-j组成成分2.无菌叶片接种到培养基将准备好的叶片按常规无菌操作方法接种培养。将准备好的叶片接种到表1中相应的培养基上，温度25℃避光培养5～6周，待愈伤组织长出。不同培养基进行3组平行实验。3.制备喜树愈伤组织代谢产物每组实验分别取2g新鲜的愈伤组织，60℃烘干研磨破碎，甲醇浸泡过夜，过滤收集滤液，40℃减压浓缩得到愈伤组织提取物。提取物用纯水溶解，乙酸乙酯萃取，有机相于40℃减压浓缩至干燥得到发酵液提取物，细胞提取物加3ml乙酸乙酯溶解，经针头滤器过滤得到代谢产物粗提物。4.喜树愈伤组织代谢产物的hplc-dad检测采用hplc-dad分别检测喜树愈伤组织的代谢产物。hplc-dad分析检测条件：altimacolumnc18柱(5μm,250mm×4.6mm)，流动相a：甲醇，流动相b：水+0.1％甲酸，柱温：35℃，流速：1ml/min；进样量：20μl；检测器：二极管阵列(dad)；检测波长：254nm、266nm、373nm；梯度洗脱程序如表2所示。表2hplc-dad梯度洗脱条件时间(min)流动相a％流动相b％05951250503080203998245982在上述条件下，喜树碱标准品的保留时间为：25.39min；10-羟基喜树碱标准品的保留时间为：23.14min；喜树愈伤组织提取物中喜树碱的保留时间为：25.38min；10-羟基喜树碱的保留时间为：23.15min。hplc-dad结果显示，b、c培养基中的喜树愈伤组织有喜树碱产生，b培养基培养出的愈伤组织中喜树碱含量较高些，从而筛选出喜树愈伤组织培养的最佳培养基，结果如表3。表3不同培养基诱导愈伤组织生成5.喜树愈伤组织继代培养将上一步的愈伤组织按常规无菌操作方法接种培养。将上一步得到的愈伤组织用无菌刀小心切割接种到b固体培养基，光照培养。光照培养条件：白光(40μmolm-2s-l)，光周期为16h，温度25℃，湿度70％。每20～25天继代一次。实施例三：喜树悬浮细胞系建立1试验材料1.1植物材料实施例二中得到的喜树愈伤组织，按照常规无菌操作，用无菌手术刀切成小块，待用。1.2培养基ms30液体培养基添加0.5mg/lnaa，2mg/lbap。2.喜树愈伤组织接种到培养基将准备好的愈伤组织按常规无菌操作方法接种培养。将愈伤组织接种到100ml液体培养基中，持续光照培养。光照培养条件：白光(25μmolm-2s-l)，温度25℃，湿度70％，转速125rpm。3～5天后，待培养液中有细胞长出，吸取5ml细胞悬浮液转入100ml新的液体培养基，相同条件下培养，得到喜树悬浮细胞，待用。以后每10天继代一次。实施例四：喜树悬浮细胞生长研究1.试验材料1.1植物材料喜树悬浮细胞液。1.2培养基ms30液体培养基添加0.5mg/lnaa，2mg/lbap。2.喜树悬浮细胞接种到培养基将准备好的喜树悬浮细胞按常规无菌操作方法接种培养。将喜树悬浮细胞接种到100ml本例1.2节所述的培养基中，持续光照培养。光照培养条件：白光(25μmolm-2s-l)，温度25℃，湿度70％，转速125rpm。3.喜树悬浮细胞重量测定和代谢产物制备每天收集2瓶喜树悬浮细胞培养液，采集天数总共为19天。培养液经抽滤漏斗过滤至无液体滴出。分别收集滤液与滤纸上的喜树细胞；将滤纸上的细胞称重，得到细胞鲜重；所述滤液经乙酸乙酯萃取，有机相于40℃减压浓缩至干得到培养液提取物；所述细胞经60℃干燥称重，得到细胞干重；将干燥的细胞研磨破碎，甲醇浸泡过夜，40℃减压浓缩得到细胞提取物，提取物用纯水溶解，乙酸乙酯萃取，有机相于40℃减压浓缩至干得到细胞提取物；培养液提取物或细胞提取物加入乙酸乙酯溶解，经针头过滤器过滤得到喜树碱和10-羟基喜树碱粗提物。4.喜树悬浮细胞代谢产物的hplc-dad检测方法同实施例二喜树愈伤组织代谢产物的hplc-dad检测方法。实施例五：喜树悬浮细胞培养基筛选1.试验材料1.1植物材料实施例三中得到的喜树悬浮细胞。1.2培养基10种不同组分的液体培养基，如表4：表4ms30培养基(a-g)和b5、ls、ds液体培养基添加相应的植物生长调节因子编号培养基植物生长调节因子(mg/l)ams30naa(0.5)+6-bap(2)bms30naa(0.5)+6-bap(2)+sorbitol(5g)cms30naa(0.3)+6-bap(0.8)+2,4-d(0.2)dms30naa(0.5)+6-bap(0.5)+2,4-d(0.1)+40mm(nh4+/no3-5:1)ems30naa(10.74μm)fms30iaa(1)+6-bap(0.5)+artemisinicacid(10)gms30naa(2)+iaa(2)+kinetin(0.1)+(nh4)2so4(2g)hb5naa(0.5)ilsnaa(0.19)+2,4-d(0.22)+thiamine(0.4)+inositol(100)+50mmβ-cdsjdsnaa(10)+kinetin(1)其中：6-bap为6-苄基氨基嘌呤；sorbitol为山梨糖醇；artemisinicacid为青蒿酸；thiamine为硫胺；inositol为肌醇；kinetin为激动素。2.喜树悬浮细胞接种到培养基将准备好的喜树悬浮细胞按常规无菌操作方法接种培养。将喜树悬浮细胞2ml分别接种到100ml表4中相应液体培养基a-j中，持续光照培养。光照培养条件：白光(25μmolm-2s-l)，温度25℃，湿度70％，转速125rpm。3.喜树悬浮细胞重量测定和代谢产物制备方法同实施例四，喜树悬浮细胞重量测定和代谢产物制备。4.喜树悬浮细胞代谢产物的hplc-dad检测检测方法同实施例二，喜树愈伤组织代谢产物的hplc-dad检测方法，最后筛选得到喜树悬浮细胞最优的培养基组成为：ms30培养基添加0.5mg/lnaa，0.5mg/lbap，0.1mg/l2,4-d，40mmnh4+/no3-(nh4+/no3-的摩尔比为5:1)，即d培养基。实施例六：诱导因子添加1.试验材料1.1植物材料实施例三中得到的喜树悬浮细胞。1.2培养基实施例五中的d培养基，诱导因子如表5：表5诱导因子诱导因子单位c1c2c3氯化钴cobaltchloride(co)μm5.02550硝酸银silvernitrate(ag)μm5.02550氯化镉cadmiumchloride(cd)μm5.02550氯化钙calciumchloride(ca)μm5.02550硫酸铜cuso4.5h2oμm5.02550硫酸锂li2so4.h2oμm5.02550硫酸锰mnso4.h2oμm5.02550硝酸铈铵ce(nh4)2(no3)6μm1005001000水杨酸(salicylicacid(sa))μm1050100茉莉酮酸甲酯(methyljasmonate(mj))μm1050100茉莉酸(jasmonicacid(ja))μm1050100酵母膏(yeastextract(ye))mgl-150100200壳聚糖(chitosan(ch))mgl-150100200山梨糖醇(sorbitol(so))gl-152550色胺(tryptamine)μm50250500断马钱子甙(secologanin)μm502505002.喜树悬浮细胞接种到培养基及产物制备和测定将准备好的喜树悬浮细胞按常规无菌操作方法接种培养。将喜树悬浮细胞2ml接种到100ml表4中的d培养基中，持续光照培养。光照培养条件：白光(25μmolm-2s-l)，温度25℃，湿度70％，转速125rpm。第3天添加表5中相应的诱导因子和对应的浓度，3组实验。第9天、15天检测细胞鲜重、培养液中喜树碱、10-羟基喜树碱的含量，方法同实施例四：喜树悬浮细胞重量测定和代谢产物制备。结果：山梨糖醇能很好地提高喜树悬浮细胞中喜树碱、10-羟基喜树碱的产量，分别能达到3.05mg/l和0.688mg/l，与对照组相比提高300～500倍。实施例七：不同山梨糖醇浓度对喜树悬浮细胞中喜树碱产量的影响1.试验材料1.1植物材料实施例三中得到的喜树悬浮细胞。1.2培养基采用实施例五中的d培养基和培养条件，诱导因子为山梨糖醇。2.喜树悬浮细胞接种到培养基及产物制备和测定将准备好的喜树悬浮细胞按常规无菌操作方法接种培养。将6组喜树悬浮细胞2ml分别接种到100mld培养基中，按实施例五的培养条件进行持续培养。第3天6组培养基中依次添加浓度为0、5、25、50、100和200g/l的山梨糖醇。第15天检测细胞鲜重、培养液中喜树碱、10-羟基喜树碱的含量，方法同实施例四：喜树悬浮细胞重量测定和代谢产物制备。结果：山梨糖醇添加浓度为0时为对照组，喜树碱的产量为1.23μg/l，10-羟基喜树碱的产量为0.57μg/l。山梨糖醇添加浓度分别为5g/l、25g/l、50g/l、100g/l和200g/l时，分别对应喜树碱的产量为1.1μg/l、272μg/l、537μg/l、167μg/l和1.7μg/l，10-羟基喜树碱的产量为1.35μg/l、212μg/l、294μg/l、144μg/l和6.4μg/l。实施例八：不同山梨糖醇浓度对喜树悬浮细胞中喜树碱产量的影响1.试验材料1.1植物材料实施例三中得到的喜树悬浮细胞。1.2培养基及培养条件培养基及培养条件如表6所示。2.喜树悬浮细胞接种到培养基及产物制备和测定将准备好的喜树悬浮细胞按常规无菌操作方法接种培养。将5组喜树悬浮细胞2ml分别接种到100ml表6所示培养基、植物生长调节因子中，按表6所示培养条件进行持续培养。第3天5组培养基中依次添加不同浓度的山梨糖醇。第15天检测细胞鲜重、培养液中喜树碱、10-羟基喜树碱的含量，方法同实施例四：喜树悬浮细胞重量测定和代谢产物制备。实验结果见表6。表6不同培养条件下添加不同浓度山梨糖醇的浓度时，喜树碱及10-羟基喜树碱的产量当前第1页12