一种分泌表达蛋白的稳定细胞株构建方法与流程

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种分泌表达蛋白的稳定细胞株构建方法。

背景技术：

构建真核表达质粒，在将其转染到293t细胞中，可以实现蛋白的瞬时表达，是目前最常用的真核蛋白表达方法。但如果需要大量表达目的蛋白就需要进行大量质粒提取、细胞培养、转染、破碎细胞提取总蛋白，再进行纯化，工作量大、纯化难度大。

将慢病毒表达载体和包装质粒同时共转染293t细胞，可以产生高滴度的病毒颗粒。再将病毒作用于宿主细胞，可以使得目的基因进入宿主细胞，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达目的蛋白。再经过相应抗生素筛选即可获得稳定表达目的蛋白的细胞株，与传统质粒转染方法相比，实验周期短，阳性率高，细胞株稳定性好。

技术实现要素：

本发明的目的是解决上述现有技术的不足，提供一种分泌表达蛋白的稳定细胞株构建方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种分泌表达蛋白的稳定细胞株构建方法，包括以下步骤：

(1)以重组慢病毒载体pcdh-s-his为骨架，将目的蛋白基因构建到重组慢病毒载体pcdh-s-his上获得重组质粒pcdh-s-p-his；

(2)利用pei转染方法将上述重组质粒与辅助质粒pspax2和pmd2.g共转染293t细胞获得重组慢病毒；

(3)将收获的慢病毒转导293t细胞，经嘌呤霉素筛选获得多个单克隆细胞株，经elisa方法检测各细胞上清中目标蛋白含量，确定高表达细胞株。

优选地，步骤(2)所述重组慢病毒的获得包括以下步骤：

(21)将重组质粒pcdh-s-p-his、pspax2和pmd2.g混合后加到pbs中，轻轻混匀，同时将pei加到另一份同样体积的pbs中，涡旋混匀，再将pei混合液加到重组质粒中，轻轻混匀后室温放置10～30min；

(22)将混合液加到贴壁培养的293t细胞中；

(23)过夜或12h后换液，继续培养48h后收获上清，并补齐培养基继续培养24h收获上清，两次上清经过离心去除杂质后0.45μm滤器过滤即可获得重组慢病毒。

优选地，步骤(21)所述重组质粒pcdh-s-p-his、pspax2和pmd2.g的混合比例为质量比4：3：1，混合质粒的质量体积比浓度为16mg/l，所述pei混合液的质量体积比浓度为40mg/l。

优选地，步骤(3)所述高表达细胞株的获得包括以下步骤：

(31)将重组慢病毒加到dmem完全培养基中，同时加入基因转染增强剂polybrene；

(32)弃去293t细胞上清，加入步骤(31)的混合液，过夜培养；

(33)第二天弃去病毒液，补加dmem完全培养基，继续培养24h，荧光显微镜观察细胞绿色荧光情况(肉眼观察荧光细胞比例达到20％以上)；

(34)换液48h后，弃去细胞上清，换成含不同浓度嘌呤霉素(1ug/ml-20ug/ml)的dmem完全培养基；

(35)待细胞死亡基本稳定后消化细胞进行有限稀释，接种在96孔板中，细胞数量为每孔0.5个细胞；

(36)7天后荧光显微镜观察，找到只有单细胞集落且有绿色荧光的细胞孔做好标记；

(37)待细胞密度达90％后，elisa检测阳性细胞孔上清中目标蛋白的表达量；

(38)选择高表达量的细胞株进行扩大培养，冻存。

优选地，步骤(31)所述重组慢病毒和dmem完全培养基的体积比为1:8，基因转染增强剂polybrene的终浓度为8μg/ml。

优选地，所述目的蛋白基因为人色素上皮衍生因子(pedf)基因、人胎盘生长因子(plgf)基因或成纤维生长因子受体基因(fgfr1-1α)。

优选地，所述人色素上皮衍生因子基因两端带有ecori和noti酶切位点，引物序列如seqidno.1、2所示。

优选地，所述人胎盘生长因子基因两端带有ecori和noti酶切位点，引物序列如seqidno.3、4所示。

优选地，所述成纤维生长因子受体基因两端带有bamhi和noti酶切位点，引物序列如seqidno.5、6所示。

本发明的有益效果在于：

利用本实验改造的慢病毒载体pcdh-s-his为骨架可以实现目标蛋白的分泌表达，与现有的质粒转染真核细胞获得目标蛋白相比有以下优势：包装慢病毒选择pei转染方法，试剂费用远远低于脂质体，且包装的病毒再次感染细胞效率高。经嘌呤霉素筛选出稳定表达株后可以进行大规模无血清培养，成本低，产量高，杂蛋白少，利于后期大规模纯化。本专利选取了三个基因来进行验证，均能实现目标蛋白的分泌表达，所以本专利构建分泌表达蛋白稳定株的方法具有广谱性，可以实现多数蛋白的分泌表达。但本方法表达的蛋白局限于能在293t细胞中瞬时表达的蛋白，不能解决一些在哺乳动物细胞中不表达的蛋白。本专利提供了一种分泌表达蛋白的稳定细胞株构建方法，为实现蛋白的大规模分泌表达提供可靠依据。

附图说明

图1是pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro的图谱；

图2是pcdh-s-his重组慢病毒载体的构建流程示意图；

图3是实施例2pcdh-s-pedf-his重组质粒构建示意图；

图4是实施例3pcdh-s-plgf-his重组质粒构建示意图；

图5是实施例4pcdh-s-fgfr1-1α-his重组质粒构建示意图；

图6是实施例5重组慢病毒构建流程示意图。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。

实施例1pcdh-s-his重组慢病毒载体的构建

将质粒pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro(图1)进行xbai和ecori双酶切，回收载体骨架部分。如图2所示，

设计并合成2条寡核苷酸链，序列如下：

正向：(5’→3’)带有xbai粘性末端

ctagaatggagacagacacactcctgctgtgggtgctgctgctctgggtcccaggctccactggcgacggg(seqidno.7)；

反向：(5’→3’)带有ecori粘性末端

aattcccgtcgccagtggagcctgggacccagagcagcagcacccacagcaggagtgtgtctgtctccata(seqidno.8)。

将上述两条寡核苷酸链退火，与载体骨架部分用连接酶进行16℃连接，1h后转化大肠杆菌过夜培养，隔天挑取单克隆菌落过夜培养，提取质粒并测序验证，最终获得重组载体pcdh-s。

重组载体pcdh-s用noti和psti双酶切，回收载体大片段部分。

根据重组载体pcdh-s序列设计引物，以重组载体pcdh-s的noti酶切位点处设计上游长引物，并包含6×his标签，并添加终止密码子，以psti酶切位点处设计下游引物，引物序列如下：

上游引物：

5’-tccgcggccgctcatcatcaccatcaccattgagaaggatctgcgatcgct-3’(seqidno.9)；

下游引物：

5’-ttctgcaggatgctggggtggat-3’(seqidno.10)。

以重组载体pcdh-s为模板，通过pcr反应获得pcr产物。扩增程序为预变性95℃4分钟，变性95℃30秒，退火55℃30秒，延伸72℃1分钟，循环数35个，最后延伸72℃10分钟。

将pcr产物纯化后用，经noti和psti双酶切，跑胶回收，再与酶切回收的pcdh-s载体大片段用连接酶进行连接转化，挑取单克隆菌落培养后提取质粒并测序验证，最终获得改造后的重组慢病毒载体pcdh-s-his。

实施例2pcdh-s-pedf-his重组质粒的构建

如图3所示，

以重组慢病毒载体pcdh-s-his为骨架，经ecori和noti双酶切回收骨架部分。

设计引物扩增pedf基因，引物序列如下：

上游引物：

5’-tttgaattctatgcaggccctggtgcta-3’(seqidno.1)；

下游引物：

5’-tttgcggccgcggggcccctggggtccagaa-3’(seqidno.2)；

以人cdna为模板，通过pcr反应获得pedf基因。扩增程序为预变性95℃4分钟，变性95℃30秒，退火55℃30秒，延伸72℃1分钟20秒，循环数35个，最后延伸72℃10分钟。

将pcr产物纯化后用ecori和noti双酶切，跑胶回收，再与酶切回收的pcdh-s-his载体骨架部分用连接酶进行连接，再转化大肠杆菌，挑取单克隆菌落培养后提取质粒并测序验证。最终获得重组质粒pcdh-s-pedf-his。

实施例3pcdh-s-plgf-his重组质粒的构建

如图4所示，

以重组慢病毒载体pcdh-s-his为骨架，经ecori和noti双酶切回收骨架部分。

设计引物扩增plgf基因，引物序列如下：

上游引物：

5’-tttgaattccctgcctgctgtgccccccca-3’(seqidno.3)；

下游引物：

5’-tttgcggccgcgcctccggggaacagcat-3’(seqidno.4)；

以人cdna为模板，通过pcr反应获得plgf基因。扩增程序为预变性95℃4分钟，变性95℃30秒，退火55℃30秒，延伸72℃1分钟20秒，循环数35个，最后延伸72℃10分钟。

将pcr产物纯化后用ecori和noti双酶切，跑胶回收，再与酶切回收的pcdh-s-his载体骨架部分用连接酶进行连接，再转化大肠杆菌，挑取单克隆菌落培养后提取质粒并测序验证。最终获得重组质粒pcdh-s-plgf-his。

实施例4pcdh-s-fgfr1-1α-his重组质粒的构建

如图5所示，

以重组慢病毒载体pcdh-s-his为骨架，经bamhi和noti双酶切回收骨架部分。

设计引物扩增fgfr1-1α基因，引物序列如下：

上游引物：

5’-cgggatcctgaggccgtccccgaccttgcctgaac-3’(seqidno.5)；

下游引物：

5’-ataagaatgcggccgccgaggtcatcactgccggcctc-3’(seqidno.6)；

以人cdna为模板，通过pcr反应获得fgfr1-1α基因。扩增程序为预变性95℃4分钟，变性95℃30秒,退火55℃30秒，延伸72℃1分钟20秒，循环数35个,最后延伸72℃10分钟；

将pcr产物纯化后分别用bamhi和noti双酶切，跑胶回收，再与酶切回收的pcdh-s-his载体骨架部分用连接酶进行连接，再转化大肠杆菌，挑取单克隆菌落培养后提取质粒并测序验证。最终获得重组质粒pcdh-s-fgfr1-1α-his。

实施例5病毒包装

以pedf为例，如图6所示，

质粒大提：将重组质粒pcdh-s-pedf-his，两个辅助质粒pspax2和pmd2.g进行大提获得高浓度高纯度无内毒素的质粒。

细胞培养：以常规方法培养293t细胞，稳定传代后接种细胞至60mm培养皿，细胞数量以培养24小时达85％汇合度为依据；

将质粒pcdh-s-pedf-his、pspax2和pmd2.g按照4：3：1比例共8μg质粒加到500μlpbs中，轻轻混匀，同时将20μgpei加到500μlpbs中，涡旋混匀。再将pei混合液加到质粒中，轻轻混匀后室温放置20min；

先吸走293t细胞的培养基1ml，再将混合液加到细胞中；

过夜培养或待12h后换液，继续培养48h后收获上清，同时再补加新鲜培养基继续培养24h后收获上清。期间在荧光显微镜下观察细胞绿色荧光情况，确保转染过程正常，转染效率正常；

将两次上清混合后4℃10000g离心10min，收集上清；

将上清用0.45μm滤器过滤，分装病毒液并低温冻存。

实施例6病毒转导293t细胞筛选稳定细胞株

细胞接种：以常规方法培养293t细胞，并接种一个60mm培养皿；

将500μl重组慢病毒加到4mldmem完全培养基中，同时加入polybrene(终浓度为8μg/ml)；

弃去60mm培养皿细胞上清，加上上述混合液，过夜培养；

换液后继续培养24h，荧光显微镜观察细胞绿色荧光比例；

再次换液，培养基中添加嘌呤霉素；

待细胞死亡基本稳定，胰酶消化细胞进行有限稀释，接种4块96孔板，细胞数量为每孔0.5个细胞；

7天后荧光显微镜观察，找到只有单细胞集落且有绿色荧光的细胞孔做好标记；

待细胞长满后收集细胞上清，elisa检测阳性细胞孔上清中目标蛋白的表达量，elisa结果见表1。其中pedf蛋白的b6和b11号细胞，plgf蛋白的f6和f11号细胞，fgfr1-1α蛋白的e10和h11号细胞为高表达量稳定细胞株，分别进行扩大培养，冻存。

表1稳定株上清目标蛋白elisa检测

以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

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