一种基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体及其应用的制作方法

文档序号：11540242阅读：816来源：国知局

一种基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体及其应用的制造方法与工艺

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于crisprcas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体及其应用。

背景技术：

成簇的、规律间隔的短回文重复序列crispr/cas(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/crispr-associatedsystems)，是目前最高效的基因组编辑系统。crispr/cas系统总共有五大类，typeⅱcrispr-cas系统在细胞和生物水平上的基因编辑方面已被广泛高效地运用，它由cas9核蛋白和一条具有crrna和tracrrna功能的向导rna构成。其中cas9蛋白含有两个起切割目的序列作用的保守区域，分别为hnh和ruvc结构域；而在向导rna的3’端存在着crrna:tracrrna的支架，可巩固向导rna和cas9蛋白的相互作用。crispr/cas9系统主要是通过识别特定基因序列后进行切割达到基因编辑的作用，故需要一条长度约为20个核苷酸的向导序列和一条含有pam(protospaceradjacentmotif)dna序列，不同菌种来源的cas9蛋白识别的pam不尽相同，对于streptococcuspyogenescas9(spcas9)蛋白则是5’-ngg-3’。当具备上述所需结构，crispr/cas9系统则可精确地进行基因编辑，首先cas9蛋白与向导rna形成复合物，然后通过识别特定基因的dna序列的pam，解旋dna序列，接着向导rna与单链dna形成rna-dna复合结构，紧接着cas9蛋白的hnh和ruvc结构域各自切割特定dna序列的一条链，形成带有平末端的dna双链断裂，之后通过修复途径达到基因编辑的效果。(jiang,w.,bikard,d.,cox,d.,zhang,f.andmarraffini,l.a.(2013)rna-guidededitingofbacterialgenomesusingcrispr-cassystems.nat.biotechnol.,31,233–239.)在此之后，科学家发现通过点突变可hnh和ruvc结构域的活性沉默后并不会影响cas9蛋白识别特定的dna序列的功能，此时cas9蛋白被称为nuclease-deadcas9(dcas9)蛋白，起到了靶向特定dna序列的作用，研究人员利用这一特性实现了基因表达水平调控、染色质成像等功能。(chen,b.etal.(2016)expandingthecrisprimagingtoolsetwithstaphylococcusaureuscas9forsimultaneousimagingofmultiplegenomicloci.nucleicacidsres,44,1-13.)

若在dcas9蛋白尾部串连一个荧光蛋白，同时表达任意一个具有重复序列或非重复序列的特定dna序列的向导rna，通过crispr/cas9系统的功能则可达到标记特定dna序列的效果，此功能被称为crispr成像。crispr成像技术可以使得人们观察到活细胞中特定基因的动态变化，例如端粒的长度随着时间推移是如何改变的，特定基因的拷贝数在间期和分裂期是如何变化的。另外，了解一些基因组元件在活细胞中的精确定位对于认识染色体动力学至关重要，这是因为基因是根据它们在三维空间中的位置来控制我们的生物学和健康。一个基因要转录和表达，在染色体上它必须是可接近的。dna在拥挤细胞核中的定位对从胚胎发育到癌症一切的事物均起重要的作用。然而，当前的一些技术最多只能在活细胞中一次追踪三个基因组位点。标记更多的位点要求通过用甲醛来浸泡细胞固定它们，因此这会杀死细胞，使得无法观察染色体结构响应刺激或随时间推移发生的改变。但crispr成像技术则可以在不杀死细胞的情况下达到三个及三个以上基因组位点，目前，最新研究表明可以同时标记七个基因位点。(ma,h.etal.(2016)multiplexedlabelingofgenomiclociwithdcas9andengineeredsgrnasusingcrisprainbow.nat.biotechnol.,34,528-531.)

在crispr成像系统中的荧光蛋白多为sfgfp，它可以在重复序列较多的dna序列情况下达到很好的标记效果，但荧光强度相对较弱，若用普通的荧光显微镜捕捉其标记基因的荧光信号，特别是捕捉sfgfp荧光蛋白标记重复序列很少的情况下难度系数比较大，只能通过串联数个荧光蛋白来增强起荧光信号，但这个方法却会使得基因标记的效率下降且噪音升高，并不能彻底解决荧光信号弱的问题。目前，尚未有荧光信号特别强的荧光蛋白应用于crispr成像系统中，若找到一种荧光强度较强的荧光蛋白应用于此系统中，相信可以更清晰明确的观测到特定基因各个时期的变化且可以探查细胞周期进程中、表观遗传调节过程中或响应细胞刺激过程中，染色体内和染色体间结构域动态相互作用。理论上，研究人员若应用这种方法，可绘制出每个人类染色体特有重复序列在染色体内的位置。原则上，这种方法也可用于分析核纤层相关的结构域和染色体捕获为基础的拓扑关联结构域，并允许科学家对活细胞中诸如易位和癌症相关染色体破碎、重排这种事件进行可视化研究。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种基于crisprcas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体。

本发明的基于crisprcas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体，其特征在于，包括cas9蛋白的突变体dcas9蛋白和与其结合的特定基因的向导rna，在cas9蛋白的突变体dcas9蛋白上具有suntag系统，suntag系统中含有gcn4抗原表位决定簇，将高亮度绿色荧光蛋白mneongreen连接在gcn4抗体上，gcn4抗体与gcn4抗原表位决定簇相结合。

优选，所述的基于crisprcas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体，其为环形载体，其核苷酸序列如seqidno.1或seqidno.2所示。

本发明的第二个目的是提供基于crisprcas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体在对哺乳动物细胞基因组进行活体定位中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的方法，其特征在于，将上述基于crisprcas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体通过脂质体介导转染到哺乳动物细胞中共培养，然后通过荧光显微镜观察。

本发明通过cas9蛋白的突变体dcas9蛋白和特定基因的向导rna结合后，在向导rna引导下定位到特定基因，由于suntag系统中含有24个gcn4抗原表位决定簇，高亮度绿色荧光蛋白m-neongreen连接在gcn4抗体上，即scfv-gcn4，故高亮度绿色荧光蛋白可以和suntag系统结合，且suntag系统是连接在dcas9蛋白后面的多肽，因此基于上述部分组成能够达到在特定基因上发光进而达到定位的效果。

本发明的基于crisprcas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体，其荧光强度较强，能够在活细胞条件下观察特定基因的各个时期的表达情况，可以获得特定基因在整个间期和分裂期的动态变化趋势，并且不会将细胞杀死，而且除此之外，本发明能够同时定位数个基因，观察它们在特定时期是否有相互作用，进而能够记录它们的相互作用的动态过程以阐释基因相互作用的机理。另外，所述特定基因可为重复序列较多的dna序列，也可为重复序列低于20的dna序列。理想状态下，利用本发明能够探查特定基因在细胞周期进程中、表观遗传调节过程中或响应细胞刺激过程中，染色体内和染色体间结构域动态相互作用。上述优点都是fish等需将细胞固定后进行定位的方法所不具备的。

附图说明：

图1是pcag-gfp-addgene质粒图谱图。

图2是phr-scfv-gcn4-sfgfp-gb1-nls-dwpre质粒图谱图。

图3是pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp质粒图谱图。

图4是pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen质粒图谱图。

图5是pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen质粒图谱图。

图6是phrdsv40-nls-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp-dwpre质粒图谱图。

图7是p1u6-sgefrna-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp质粒图谱图。

图8是p1u6-grna-bbsi质粒图谱图。

图9是p1u6-sgefrna质粒图谱图。

图10是p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp质粒图谱图。

图11是p1u6-sgeftelomere质粒图谱图。

图12是sfgfp荧光蛋白定位到端粒的图像。

图13是mneongreen荧光蛋白定位到端粒的图像。

图14是3xmneongreen荧光蛋白定位到端粒的图像。

图15是hek293t活细胞核内各荧光蛋白定位到端粒的数目柱状图。

图16是各组荧光蛋白信噪比的小提琴图。三组实验分别为取35mm共聚焦玻璃皿，每孔接种1.5-2mlhek293t细胞悬液，培养24小时待细胞贴壁后，更换新的dmem培养基，然后利用3000transfectionreagent(l3000001)进行转染，其中第一组为p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp转染量为1250ng，p1u6-sgeftelomere转染量为750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp转染量为500ng，第二组为p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp转染量为1250ng，p1u6-sgeftelomere转染量为750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen转染量为500ng，第三组为p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp转染量为1250ng，p1u6-sgeftelomere转染量为750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen转染量为500ng，3000transfectionreagent(l3000001)用量为说明书指示量，具体为5ulp3000稀释在125ulopti-mem中，5ullipofectamine3000稀释在125ulopti-mem中，将质粒添加到p3000稀释液中，接着将lipofectamine3000稀释液逐滴加到p3000和质粒混合液中，室温静置5min后将混合液逐滴加到培养基中。培养24h换新的dmem培养基，48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察，在观察前利用hoechst试剂对细胞核进行染色，确定荧光蛋白表达在细胞核内。

由图可知，mneongreen信噪比最好，即p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen这一组信噪比最好，表明mneongreen此荧光蛋白在除去荧光背景且定位到端粒的情况下荧光强度较强。

图17是各组荧光蛋白绝对荧光强度的小提琴图。三组实验分别为取35mm共聚焦玻璃皿，每孔接种1.5-2mlhek293t细胞悬液，培养24h待细胞贴壁后，更换新的dmem培养基，然后利用3000transfectionreagent(l3000001)进行转染，其中第一组为p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp转染量为1250ng，p1u6-sgeftelomere转染量为750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp转染量为500ng，第二组为p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp转染量为1250ng，p1u6-sgeftelomere转染量为750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen转染量为500ng，第三组为p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp转染量为1250ng，p1u6-sgeftelomere转染量为750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen转染量为500ng，3000transfectionreagent(l3000001)用量为说明书指示量，具体为5ulp3000稀释在125ulopti-mem中，5ullipofectamine3000稀释在125ulopti-mem中，将质粒添加到p3000稀释液中，接着将lipofectamine3000稀释液逐滴加到p3000和质粒混合液中，室温静置5min后将混合液逐滴加到培养基中。培养24h换新的dmem培养基，48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察，在观察前利用hoechst试剂对细胞核进行染色，确定荧光蛋白表达在细胞核内。

由图可知，三个荧光蛋白串联组成的3xmneongreen荧光强度最强。即p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen这一组荧光强度最强。

图18是各组荧光蛋白减去背景所得到荧光强度的小提琴图。三组实验分别为取35mm共聚焦玻璃皿，每孔接种1.5-2mlhek293t细胞悬液，培养24h待细胞贴壁后，更换新的dmem培养基，然后利用3000transfectionreagent(l3000001)进行转染，其中第一组为p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp转染量为1250ng，p1u6-sgeftelomere转染量为750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp转染量为500ng，第二组为p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp转染量为1250ng，p1u6-sgeftelomere转染量为750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen转染量为500ng，第三组为p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp转染量为1250ng，p1u6-sgeftelomere转染量为750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen转染量为500ng，3000transfectionreagent(l3000001)用量为说明书指示量，具体为5ulp3000稀释在125ulopti-mem中，5ullipofectamine3000稀释在125ulopti-mem中，将质粒添加到p3000稀释液中，接着将lipofectamine3000稀释液逐滴加到p3000和质粒混合液中，室温静置5min后将混合液逐滴加到培养基中。培养24h换新的dmem培养基，48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察，在观察前利用hoechst试剂对细胞核进行染色，确定荧光蛋白表达在细胞核内。

由图可知，三个荧光蛋白串联组成的3xmneongreen在减去荧光背景后所得的荧光强度最强。即p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen这一组在减去荧光背景后所得的荧光强度最强。

图19是各组荧光蛋白荧光强度和绝对荧光强度的线性拟合图。实验为将图17-图18所得数据进行线性拟合。

由图可知，三者的绝对荧光强度随着荧光强度的增强而增强。即第一组p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp，第二组p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen，第三组p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen这三组的绝对荧光强度随着减去荧光背景后所得的荧光强度的增强而增强。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。除非特别说明，下面实施例中所用的技术均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备和试剂等，均为本领域内的技术人员可以通过公共途径如商购等获得的。

实施例1：

图1是pcag-gfp-addgene质粒图谱图。

图2是phr-scfv-gcn4-sfgfp-gb1-nls-dwpre质粒图谱图。

图3是pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp质粒图谱图。

图4是pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen质粒图谱图。

图5是pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen质粒图谱图。

图6是phrdsv40-nls-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp-dwpre质粒图谱图。

图7是p1u6-sgefrna-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp质粒图谱图。

图8是p1u6-grna-bbsi质粒图谱图。

图9是p1u6-sgefrna质粒图谱图。

图10是p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp质粒图谱图。

图11是p1u6-sgeftelomere质粒图谱图。

具体构建步骤如下：

以购买所得pcag-gfp(addgene:11150)为载体，用ecori和hindiii酶切得到4238bp片段为载体。以购买所得的phr-scfv-gcn4-sfgfp-gb1-nls-dwpre(addgene：60906)为模板，进行pcr扩增，pcr引物序列如下：

ga-scfv-gcn4-sfgfp-f:

gtctcatcattttggcaaagaattcgccaccatgggccccgacat

ga-scfv-gcn4-sfgfp-r:

gaccatgattacgccaagcttttacaccttgcgcttcttcttggg。

由此获得pcr产物scfv-gcn4_v4-sfgfp，利用gibsonassembly试剂盒将pcr产物scfv-gcn4_v4-sfgfp和上述用ecori和hindiii酶切得到的4238bp片段进行连接得到pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp。

以pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp为载体，用hindiii酶切后得到的载体与m-neongreen连接，其中m-neongreen为全基因合成所得，得到pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen(其核苷酸序列如seqidno.1所示)。

以pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen为载体，用agei酶切后得到线性化的pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen。

以线性化的pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen为模板，分别进行两个pcr扩增。

第一个pcr扩增的pcr引物序列如下：

primer1_f:gtacaagggtggaggtcggagcggcgtgtccaagggcgaagagga；

primer1_r:ggacacgctaccatcgatgctacccttgtacagctcgtccatgccc；

由此得到pcr产物primer1。

第二个pcr扩增的pcr引物序列如下：

primeri2_f:agggtagcatcgatggtagcgtgtccaagggcgaagagga；

primer2_r:aagcttgtactcttcaccggatcccttgtacagctcgtccatgccc。

由此得到pcr产物primer2。

利用gibsonassembly试剂盒将pcr产物primer1和pcr产物primer2进行连接得到pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen(其核苷酸序列如seqidno.2所示)。

以购买得到的p1u6-sgefrna-bbsi(addgene：74707)为载体，用bbsi酶切得到3364bp片段为载体。用下述引物合成得到baei序列，

baei-f:caccggaccggtataacgtcagtacctaaca；

baei-r:aaacacttaggtactgacgttataccggtcc；

由此得到baei序列，利用t4ligase试剂盒将baei序列与上述3364bp片段相连后得到p1u6-sgefrna。以p1u6-sgefrna为载体，用mlui和spei酶切得到3329bp片段为载体。以购买所得的phrdsv40-nls-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp-dwpre(addgene：60910)为模板，进行pcr扩增，pcr引物序列如下：

ga-24gcn4-f:ccgagtcggtgctttttttacgcgttctccaagagagtgatcctggc；

ga-24gcn4-r:cggtggcggccgctctagaactagtttaattaagcttgtgcccca；

由此得到pcr产物ga-24gcn4，利用gibsonassembly试剂盒将上述用mlui和spei酶切得到的3329bp片段与pcr产物ga-24gcn4进行连接得到p1u6-sgefrna-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp。

用下述引物合成得到telomere序列，

oligo_f:ttagggttagggttagggttagttta

oligo_r:taaccctaaccctaaccctaacggtg，由此得到telomere序列。

用agei和baei酶切p1u6-sgefrna，回收2934bp片段，利用t4ligase试剂盒将telomere序列与上述2934bp片段相连后得到p1u6-sgeftelomere。

用agei和baei酶切p1u6-sgefrna-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，回收11549bp片段，利用t4ligase试剂盒将telomere序列与上述11549bp片段相连后得到p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp。

取35mm共聚焦玻璃皿，每孔接种1.5-2mlhek293t细胞悬液，培养24h待细胞贴壁后，更换新的dmem培养基，然后利用3000transfectionreagent(l3000001)进行转染，其中p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp转染量为1250ng，p1u6-sgeftelomere转染量为750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp转染量为500ng，或者p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp转染量为1250ng，p1u6-sgeftelomere转染量为750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen转染量为500ng，或者p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp转染量为1250ng，p1u6-sgeftelomere转染量为750ng，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen转染量为500ng，3000transfectionreagent(l3000001)用量为说明书指示量，具体为5ulp3000稀释在125ulopti-mem中，5ullipofectamine3000稀释在125ulopti-mem中，将质粒添加到p3000稀释液中，接着将lipofectamine3000稀释液逐滴加到p3000和质粒混合液中，室温静置5min后将混合液逐滴加到培养基中。培养24h换新的dmem培养基，48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察，在观察前利用hoechst试剂对细胞核进行染色，确定荧光蛋白表达在细胞核内。

具体结果如图12-19所示，

图12是在hek293t活细胞转染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp，转染量分别为1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察得到的结果，从图12可得知绿色的亮点为cripsprcas9系统结合suntag24x系统以及sfgfp荧光蛋白成功定位到端粒telomere的位置。

图13是在hek293t活细胞转染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen，转染量分别为1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察得到的结果，从图13可得知绿色的亮点为cripsprcas9系统结合suntag24x系统以及mneongreen荧光蛋白成功定位到端粒telomere的位置。

图14是在hek293t活细胞转染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen，转染量分别为1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察得到的结果，从图14可得知绿色的亮点为cripsprcas9系统结合suntag24x系统以及3xmneongreen荧光蛋白成功定位到端粒telomere的位置。

图15是将图12至图14这三个实验组所得的结果对绿色亮点进行统计得到的结果，从图中可以看出在hek293t活细胞转染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen，转染量分别为1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察这一组实验得到的结果显示cripsprcas9系统定位效率较在hek293t活细胞转染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp，转染量分别为1250ng，750ng，和500ng,48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察和在hek293t活细胞转染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen，转染量分别为1250ng，750ng，和500ng,48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察这两组实验统计得到的cripspr/cas9系统定位效率高。

图16则是将图12至图14这三个实验组所得的结果对绿色亮点进行统计得到的结果，从图中可以看出在hek293t活细胞转染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen，转染量分别为1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察这一组实验显示利用crisprcas9系统定位得到绿色亮点的信噪比较在hek293t活细胞转染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp，转染量分别为1250ng，750ng，和500ng,48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察和在hek293t活细胞转染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen，转染量分别为1250ng，750ng，和500ng,48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察这两组实验统计得到的信噪比高，表明用mneongreen荧光蛋白标记的端粒telomere更容易被观察到。

图17将图12至图14这三个实验组所得的结果对绿色亮点进行统计得到的结果，从图中可以看出在hek293t活细胞转染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen，转染量分别为1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察这一组实验显示利用crisprcas9系统定位得到绿色亮点的绝对荧光强度较在hek293t活细胞转染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp，转染量分别为1250ng，750ng，和500ng,48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察和在hek293t活细胞转染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen，转染量分别为1250ng，750ng，和500ng,48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察这两组实验统计得到的绝对荧光强度强，表明用3xmneongreen荧光蛋白标记的端粒telomere更加明亮。

图18将图12至图14这三个实验组所得的结果对绿色亮点进行统计得到的结果，从图中可以看出在hek293t活细胞转染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen，转染量分别为1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察这一组实验显示利用crisprcas9系统定位得到绿色亮点在减去背景后所得到的荧光强度较在hek293t活细胞转染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp，转染量分别为1250ng，750ng，和500ng,48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察和在hek293t活细胞转染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen，转染量分别为1250ng，750ng，和500ng,48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察这两组实验统计得到的荧光强度强，表明用3xmneongreen荧光蛋白标记的端粒telomere更加明亮。

图19是将图17至图18的数据进行线性拟合所得到结果。从图中可以看出三组实验即在hek293t活细胞转染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-sfgfp，转染量分别为1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察或在hek293t活细胞转染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-mneongreen，转染量分别为1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察或在hek293t活细胞转染了p1u6-sgeftelomere-dcas9-24xgcn4_v4-nls-p2a-bfp，p1u6-sgeftelomere，pcag-scfv-gcn4_v4-3xmneongreen，转染量分别为1250ng，750ng，和500ng，48h后于激光扫描共焦显微镜(zeiss：lsm880)下观察所得到的绝对荧光强度和减去背景所得的荧光强度都呈一定的线性关系，即纵坐标各组的绝对荧光强度随着横坐标减去背景所得的荧光强度增强而增强。

序列表

<110>南方医科大学

<120>一种基于crisprcas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体及其应用

<160>1

<210>1

<211>6776

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctc60

attttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccga120

gatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactc180

caacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcacc240

ctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggag300

cccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaa360

agcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccac420

cacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcg480

caactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagg540

gggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttg600

taaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtaccgg660

gccccccctcgaggcagatctcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaatt720

acggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaat780

ggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgtt840

cccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaa900

actgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtc960

aatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcct1020

acttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgggtcgaggtgagccccac1080

gttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttat1140

tttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcgggg1200

cggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcaga1260

gcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaa1320

agcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcg1380

ccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggc1440

gggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttctt1500

ttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagc1560

ggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggcccgcgctgc1620

ccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcgtgtgcgcga1680

ggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcgggggggctgcgaggggaacaaaggc1740

tgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctg1800

taacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggg1860

gctccgtgcggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtggg1920

ggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcgg1980

ccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaa2040

tcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctggcggagccgaaatctggga2100

ggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcgggcgaagcggtgcggcgccggcaggaagga2160

aatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccatctccagcc2220

tcggggctgccgcagggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggc2280

ttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttcttt2340

ttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaa2400

tttgctagcacgccaccatgggccccgacatcgtgatgacccagagccccagcagcctga2460

gcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgccgcagcagcaccggcgccgtgacca2520

ccagcaactacgccagctgggtgcaggagaagcccggcaagctgttcaagggcctgatcg2580

gcggcaccaacaaccgcgcccccggcgtgcccagccgcttcagcggcagcctgatcggcg2640

acaaggccaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccacctacttctgcg2700

ccctgtggtacagcaaccactgggtgttcggccagggcaccaaggtggagctgaagcgcg2760

gcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcagcggcggcggcagcg2820

aggtgaagctgctggagagcggcggcggcctggtgcagcccggcggcagcctgaagctga2880

gctgcgccgtgagcggcttcagcctgaccgactacggcgtgaactgggtgcgccaggccc2940

ccggccgcggcctggagtggatcggcgtgatctggggcgacggcatcaccgactacaaca3000

gcgccctgaaggaccgcttcatcatcagcaaggacaacggcaagaacaccgtgtacctgc3060

agatgagcaaggtgcgcagcgacgacaccgccctgtactactgcgtgaccggcctgttcg3120

actactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagctacccatacgatgttccagatt3180

acgctggtggaggcggaggttctgggggaggaggtagtggcggtggtggttcaggaggcg3240

gcggaagcttggatccaggtggaggtggaagcggtgtgtccaagggcgaagaggacaaca3300

tggccagcctgcctgccacccacgagctgcacatcttcggcagcatcaacggcgtggact3360

tcgacatggtgggacagggcaccggcaaccccaacgacggctacgaggaactgaacctga3420

agtccacaaagggcgacctgcagttcagcccctggattctggtgccccacatcggctacg3480

gcttccaccagtacctgccctaccccgacggcatgagccctttccaggccgctatggtgg3540

atggcagcggctaccaggtgcaccggaccatgcagtttgaggacggcgccagcctgaccg3600

tgaactacagatacacctacgagggcagccacatcaagggcgaggcccaagtgaagggca3660

caggctttccagccgacggccccgtgatgaccaatagcctgacagccgccgactggtgca3720

gaagcaagaaaacctaccccaatgacaagaccatcatcagcaccttcaagtggtcctaca3780

ccaccggcaatggcaagcggtacagaagcaccgcccggaccacctacaccttcgccaaac3840

ctatggccgccaactacctgaagaaccagcctatgtacgtgttccgcaagaccgagctga3900

agcactccaagacagaactgaacttcaaagagtggcagaaagccttcaccgacgtgatgg3960

gcatggacgagctgtacaagggtggaggtcggaccggtgaagagtacaagcttatcctga4020

acggtaaaaccctgaaaggtgaaaccaccaccgaagctgttgacgctgctaccgcggaaa4080

aagttttcaaacagtacgctaacgacaacggtgttgacggtgaatggacctacgacgacg4140

ctaccaaaaccttcacggtaaccgaaggtggtggtagcggtggtggtactagtcccaaga4200

agaagcgcaaggtgtaagtcgacgcccgggctagagctcgctgatcagcctcgactgtgc4260

cttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaag4320

gtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagta4380

ggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaag4440

acaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaacca4500

gctggggctcgactagagcttgcggaacccttcgatatcactagttctagagcggccgcc4560

accgcggtggagctccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgta4620

atcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacat4680

acgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacatt4740

aattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcatta4800

atgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctc4860

gctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaa4920

ggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaa4980

aggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggct5040

ccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgac5100

aggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttcc5160

gaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttc5220

tcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctg5280

tgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttga5340

gtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattag5400

cagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggcta5460

cactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaag5520

agttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttg5580

caagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctac5640

ggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatc5700

aaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaag5760

tatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctc5820

agcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac5880

gatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctc5940

accggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtgg6000

tcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaag6060

tagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtc6120

acgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttac6180

atgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcag6240

aagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttac6300

tgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctg6360

agaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgc6420

gccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaact6480

ctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactg6540

atcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaa6600

tgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttt6660

tcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatg6720

tatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccac6776

<210>2

<211>8213

<212>dna

<213>人工序列

<400>2