一种CRISPR/nCas9介导的定点碱基替换在植物中的应用的制作方法

文档序号：11540234阅读：626来源：国知局

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种crispr/ncas9介导的定点碱基替换在植物中的应用。

背景技术：

crispr/cas9介导的基因组编辑技术已经成为分子生物学中最强大的工具之一。首次在细菌中发现，由sgrna和cas9两部分组成(jineketal.,2012)。crispr/cas9是通过自身的核酸内切酶活性引起靶位点dna序列双链断裂(double-strandbreaks，dsbs)，然后通过非同源末端连接(non-homologousendjoining，nhej)或同源重组介导的修复(homology-directedrepair，hdr)两种方式引入突变。nhej途径诱导产生的突变大部分为核苷酸的插入或缺失，造成移码突变，而hdr则由同源供体dna介导片段插入或核苷酸修正(jineketal.,2012)。crispr/cas9系统对靶位点的识别依赖于核酸之间碱基互补配对，可对任何紧随pam(ngg)的20bp的靶点序列进行编辑，且其靶点在基因组中的分布频率很高，因此对于需要定点编辑的靶基因，更容易找到合适的靶位点。另外crispr/cas9系统可同时对同一基因的不同位点或多个基因的位点进行定向编辑，使其运用更加灵活。此外，crispr/cas9系统操作简单快捷，每次打靶只需替换原有载体上20-30bp的核苷酸序列，更适宜规模化，高通量操作(congetal.,2013；fengetal.,2014；gaoandzhao,2014；zhouetal.,2014；lawrensonetal.,2015；liuetal.,2015；maetal.,2015；wangetal.,2015；xieetal.,2015；pauliiiandqi,2016)。随着crispr/cas9技术在人类与动物细胞系中建立并应用，经过改造的crispr/cas9系统也迅速地被应用到拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中，并且获得较高的诱导突变率和可稳定遗传的基因组编辑植株(shanetal.,2013；puchtaandfauser,2014；voytasandgao,2014；lietal.,2015；maetal.,2015；svitashevetal.,2015；endoetal.,2016；gaoetal.,2016；sunetal.,2016)。

尽管crispr/cas9作为一种新的靶向基因修饰技术，展现了广阔的发展潜力和应用前景，并在农作物改良中得到广泛应用，但目前主要局限于基因随机突变和敲除。农作物中含有大量农艺性状是由单碱基的突变导致，传统crispr/cas9技术引入dsb后，与非同源末端连接的随机过程相比，hdr总是以相当低的频率发生，只有少数报道表明crispr/cas9介导的hdr在作物中可行(lietal.,2015；svitashevetal.,2015；endoetal.,2016；shietal.,2016；sunetal.,2016)，使得大量农艺性状无法得到快速的改良。

nishidaetal.(2016)将dcas9或nicked-cas9(ncas9,d10a)与来自七鳃鳗(sealamprey)免疫系统的激活诱导性胞苷脱氨(activation-inducedcytidinedeaminase，aid)融合在一起。在正常情况下，这种aid酶在免疫球蛋白和抗体基因中产生突变从而让免疫系统具有多样性。aid作用在单链dna上，将胞嘧啶(c)替换为尿嘧啶(u)，随后在一轮dna复制中，这种尿嘧啶(u)被转化为胸腺嘧啶(t)。研究结果表明当在向导rna(grna)的引导下，这种蛋白复合物靶向作用于can1基因，而且相对于非靶向的选择性标志物，can1基因发生突变的频率增加了1000倍。利用全基因组测序，研究人员发现很少的脱靶突变，只比背景突变率略有增加。komoretal.(2016)将ncas9(d10a)与胞苷脱氨酶融合，在grna的指导下，ncas9(d10a)到达指定位点，可作为“单碱基编辑器”将在非目标链的第4-8位目标胞嘧啶定点替换。通过dna复制或修复后，尿嘧啶被转化成胸腺嘧啶，最终由c突变成t，或者g突变成a。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供如下(1)-(7)中任一种所述的应用：

(1)crispr/cas9系统、脱氨酶和植物基因表达启动子在定点编辑植物或农作物基因中的应用；

所述植物基因表达启动子启动crispr/cas9系统中cas9核酸酶和脱氨酶的表达；

(2)crispr/cas9系统和脱氨酶在定点编辑植物或农作物基因中的应用；

(3)由cas9核酸酶和脱氨酶组成的融合蛋白、待编辑基因的sgrna和植物基因表达启动子在定点编辑植物或农作物基因中的应用；

所述植物基因表达启动子驱动由所述cas9核酸酶和所述脱氨酶组成的融合蛋白基因的表达；

(4)crispr/cas9系统、脱氨酶、尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白和植物基因表达启动子在定点编辑植物或农作物基因中的应用；

所述植物基因表达启动子启动crispr/cas9系统中cas9核酸酶、脱氨酶和尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白的表达；

(5)crispr/cas9系统、脱氨酶和尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白在定点编辑植物或农作物基因中的应用；

(6)由cas9核酸酶、脱氨酶和尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白组成的融合蛋白、待编辑基因的sgrna和植物基因表达启动子在定点编辑植物或农作物基因中的应用；

所述植物基因表达启动子驱动由所述cas9核酸酶、所述脱氨酶和所述尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白组成的融合蛋白的编码基因的表达；

(7)由cas9核酸酶、脱氨酶、连接所述cas9核酸酶与所述脱氨酶的连接肽和尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白组成的融合蛋白、待编辑基因的sgrna和植物基因表达启动子在定点编辑植物或农作物基因中的应用；

所述植物基因表达启动子驱动由所述cas9核酸酶、所述脱氨酶、所述连接肽和所述尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白组成的融合蛋白的编码基因的表达。

上述应用中，所述脱氨酶为apobec1，其编码基因序列为序列1第4838-5524位；

所述尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白为uracildnaglycosylaseinhibitor，其编码基因序列为序列1第392-688位；

所述cas9核酸酶为ncas9(d10a)，其编码基因序列为序列1第689-4789位；

所述连接肽的编码基因序列为序列1第4790-4837位；

所述植物基因表达启动子的核苷酸序列为序列1第5545-7535位；

所述融合蛋白的编码基因序列为序列1第392-5524位；

所述待编辑基因为ossbeiib和ospds；

所述sgrna的核苷酸序列为序列1第7785-8268位或序列2第7785-8268位或序列3第7785-8268位。

本发明的另一个目的是提供一种定点编辑植物或农作物基因的方法。

本发明提供的方法为如下(1)或(2)：

(1)所述方法包括如下步骤：将cas9核酸酶编码基因、脱氨酶编码基因、待编辑基因的sgrna的编码基因和植物基因启动子导入出发植物，实现出发植物中靶基因的定点编辑；

(2)所述方法包括如下步骤：将cas9核酸酶编码基因、脱氨酶编码基因、连接所述cas9核酸酶与所述脱氨酶的连接肽的编码基因、尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白的编码基因、待编辑基因的sgrna的编码基因和植物基因启动子导入出发植物，实现出发植物中靶基因的定点编辑。

上述方法中，

(1)中，所述cas9核酸酶编码基因、所述脱氨酶编码基因、所述待编辑基因的sgrna的编码基因和所述植物基因启动子通过重组质粒导入出发植物中；

所述重组质粒包括由cas9核酸酶和脱氨酶组成融合蛋白的编码基因、所述待编辑基因的sgrna的编码基因和植物基因启动子；

所述植物基因启动子驱动由所述cas9核酸酶和所述脱氨酶组成的融合蛋白基因的表达；

(2)中，所述cas9核酸酶编码基因、所述脱氨酶编码基因、所述连接所述cas9核酸酶与所述脱氨酶的连接肽的编码基因、所述尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白基因、所述待编辑基因的sgrna的编码基因和所述植物基因启动子通过重组质粒导入出发植物中；

所述重组质粒包括由cas9核酸酶、脱氨酶、连接所述cas9核酸酶与所述脱氨酶的连接肽和尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白组成的融合蛋白的编码基因、所述待编辑基因的sgrna的编码基因和植物基因启动子；

所述植物基因启动子驱动由所述cas9核酸酶、所述脱氨酶、所述连接所述cas9核酸酶与所述脱氨酶的连接肽和所述尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白组成的融合蛋白的编码基因的表达。

上述方法中，所述脱氨酶为apobec1，其编码基因序列为序列1第4838-5524位；

所述尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白为uracildnaglycosylaseinhibitor，其编码基因序列为序列1第392-688位；

所述cas9核酸酶为ncas9(d10a)，其编码基因序列为序列1第689-4789位；

所述连接肽的编码基因序列为序列1第4790-4837位；

所述植物基因表达启动子的核苷酸序列为序列1第5545-7535位；

所述融合蛋白的编码基因序列为序列1第392-5524位；

所述待编辑基因为ossbeiib和ospds；

所述sgrna的核苷酸序列为序列1第7785-8268位或序列2第7785-8268位或序列3第7785-8268位。

上述方法中，所述重组质粒的核苷酸序列为序列1、序列2或序列3。

上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻；所述水稻品种具体为kitaake(oryzasatival.subsp.japonica)。

上述重组质粒也属于本发明的保护范围。

本发明还有一个目的是提供一种定点编辑植物基因组的系统。

本发明提供的定点编辑植物基因组的系统包括上述重组质粒。

本发明的最后一个目的是提供上述重组质粒或上述系统的新用途。

本发明提供了上述重组质粒或上述系统在定点编辑植物或农作物基因中的应用。

上述应用或方法中，所述定点编辑为定点碱基替换。

上述应用或方法中，所述crispr/cas9系统为crispr/ncas9系统，所述crispr/ncas9系统具体为crispr/ncas9(d10a)系统。

本发明提供了一种定点编辑植物基因组的系统，该系统包括be3植物表达载体，be3植物表达载体表达由ncas9(d10a)、脱氨酶(apobec1)和尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白(ugi)组成的融合蛋白，并以水稻ospds和ossbeiib为靶基因对该系统进行验证。结果表明，在所选的3个靶点中，均获得预期定点突变植株，既在靶点序列的4-8位置的c突变成t(或g突变成a)，在水稻中实现了碱基的精确的点突变，且效率最高达到20％左右，而且该方法操作简单、可行，与构建crispr/cas9并无明显差别，为农作物育种提供了一种可行的有效的碱基替换方法，在农业育种方面具有强大的应用潜力，为快速改良农作物重要农艺性状提供了基础。

附图说明

图1为pcxun-be3载体框架图。

图2为转基因植株的鉴定。注：a为载体t-dna结构图及引物所在位置。b，c和d分别为p2，s3和s5转基因植株的cas9(d10a)，grna及hptii基因的检测。

图3为ossbeiib基因s5靶点的转基因植株及序列的鉴定。注：a为be3定点突变系统原理图。b为ossbeiib基因结构图及s5靶点所在位置，pcr产物酶切鉴定图。“+”表示pcr产物经过酶切，“-”表示pcr产物没经过酶切。c为所有植株pcr产物的克隆测序结果。d为s5-17和s5-26两个株系基因型测序峰图。pam由蓝色表示，预期突变成的碱基由红色表示，非预期的突变碱基由绿色表示。

图4为ossbeiib基因s3靶点的转基因植株及序列的鉴定。注：a为ossbeiib基因结构图及s3靶点所在位置，pcr产物电泳图。b为所有植株pcr产物的克隆测序结果。c为s3-1和s3-18两个株系基因型测序峰图。pam由蓝色表示，预期突变成的碱基由红色表示，非预期的突变碱基由绿色表示。

图5为ossbeiib基因p2靶点的转基因植株及序列的鉴定。注：a为ossbeiib基因结构图及p2靶点所在位置，pcr产物酶切鉴定图。“+”表示pcr产物经过酶切，“-”表示pcr产物没经过酶切。c为所有植株pcr产物的克隆测序结果。d为p2-21和p2-79两个株系基因型测序峰图。pam由蓝色表示，预期突变成的碱基由红色表示，非预期的突变碱基由绿色表示。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的用于水稻转化的水稻材料为kitaake(oryzasatival.subsp.japonica)，由中国农业科学院作物科学研究所获得。

下述实施例中的pcmv-be3载体在文献“komorac,kimyb,packerms,zurisja,liudr.2016.programmableeditingofatargetbaseingenomicdnawithoutdouble-strandeddnacleavage.nature.”中公开过，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

下述实施例中所用的内切酶、试剂盒和pcr酶均购自试剂公司，其他试剂均为国产分析纯。

下述实施例中的引物和dna合成及测序均在华大公司完成。

下述实施例中的aam培养基(ph5.2)是将mssalts&vitamins盐、蔗糖、mes、葡萄糖、酪蛋白氨基酸、乙酰丁香酮和100ml10xaaaminoacids混匀得到的培养基，其中各溶质在aam培养基中的浓度分别为4.3g/lmssalts&vitamins盐、68.5g/l蔗糖、0.5g/lmes、36g/l葡萄糖、500mg/l酪蛋白氨基酸、40mg/l乙酰丁香酮。上述10xaaaminoacids溶液为将l-谷氨酰胺、l-天(门)冬氨酸、l-精氨酸、甘氨酸和水混匀得到的溶液，其中各溶质在10xaaaminoacids溶液中的浓度为：8.76g/ll-谷氨酰胺、2.66g/ll-天(门)冬氨酸、1.74g/ll-精氨酸和75mg/l甘氨酸。

下述实施例中的r1培养基(ph5.8)是将ms&vitamins盐、蔗糖、mes、酪蛋白氨基酸、l-脯氨酸、2，4-d、植物凝胶和水混匀得到的培养基，其中各溶质在r1培养基中的浓度分别为：4.3g/lms&vitamins盐、30g/l蔗糖、0.5g/lmes、300mg/l酪蛋白氨基酸、2.8g/ll-脯氨酸、2mg/l2，4-d、4g/l植物凝胶。

下述实施例中的r2培养基(ph5.2)是将ms&vitamins盐、蔗糖、mes、酪蛋白氨基酸、2，4-d、植物凝胶、乙酰丁香酮和水混匀得到的培养基，其中各溶质在r2培养基中的浓度分别为：4.3g/lms&vitamins盐、30g/l蔗糖、0.5g/lmes、300mg/l酪蛋白氨基酸、2mg/l2，4-d、4g/l植物凝胶、20mg/ml乙酰丁香酮。

下述实施例中的r1筛选培养基(ph5.8)是将ms&vitamins盐、蔗糖、mes、酪蛋白氨基酸、l-脯氨酸、2，4-d、植物凝胶和水混匀得到的培养基，其中各溶质在r1筛选培养基中的浓度为：4.3g/lms&vitamins盐、30g/l蔗糖、0.5g/lmes、300mg/l酪蛋白氨基酸、2.8g/ll-脯氨酸、2mg/l2，4-d、4g/l植物凝胶。

下述实施例中的r4分化培养基(ph5.8)是将ms&vitamins盐、蔗糖、mes、酪蛋白氨基酸、山梨醇、激动素、naa、植物凝胶和水混匀得到的培养基，其中各溶质在r4分化培养基中的浓度分别为：4.3g/lms&vitamins盐、30g/l蔗糖、0.5g/lmes、2g/l酪蛋白氨基酸、30g/l山梨醇、2mg/l激动素、1mg/lnaa、4g/l植物凝胶。

下述实施例中的r5培养基(ph5.8)是将ms&vitamins盐、蔗糖、mes、植物凝胶和水混匀得到的培养基，其中各溶质在r5培养基中的浓度分别为：2.15g/lms&vitamins盐、15g/l蔗糖、0.5g/lmes、2g/l植物凝胶。

下述实施例中所用的引物如表1所示：

表1、引物序列

下述实施例中靶点位置及序列如表2所示。

表2、靶点位置及序列

注：pam位点由波浪线表示，脱氨酶靶点由加粗黑体表示，g#和c#，#代表碱基所在位置，远离pam位点的起始位点为第一个碱基。酶切位点由下划线表示。

实施例1、一种crispr/ncas9介导的定点碱基替换在植物中的应用

一、表达载体的构建

1、pcxun-be3载体的构建

(1)用限制性内切酶bamhi酶切pcxun-cas9载体，得到线性化的载体；

(2)以be-f/r为引物，pcmv-be3载体为模板进行pcr扩增，得到pcr产物，该pcr产物的5’和3’最末端的序列分别和线性化载体两末端序列完全一致；

(3)采用全式金公司的peasy-uniseamlesscloningandassemblykit将步骤(1)获得的线性化的载体、步骤(2)获得的pcr产物通过同源重组进行连接，获得载体pcxun-be3(图1)，从图中可以看出：pcxun-be3载体包括表达盒甲，该表达盒甲依次包括玉米ubiquitin启动子、脱氨酶(apobec1)的编码基因、连接ncas9(d10a)核酸酶和脱氨酶的连接肽(xtenlinker)、ncas9(d10a)核酸酶的编码基因、植物表达启动子ubi、尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白(ugi)的编码基因。

2、利用重叠pcr方法构建p2、s3及s5的grna表达盒pcxun-be3-p2、pcxun-be3-s3和pcxun-be3-s5载体

(1)s5的grna表达盒pcxun-be3-s5的构建

a、用限制性内切酶pmei酶切pcxun-be3载体，得到线性化的载体；

b、以posu3-sgrna质粒为模板，分别利用引物s5-f/hrpme-u3r和hrpme-u3f/s5-r进行pcr扩增，并将扩增产物1:1混合后做为模板，用引物hrpme-u3f/hrpme-u3r进行扩增，回收pcr产物；

c、采用全式金公司的peasy-uniseamlesscloningandassemblykit将步骤a获得的线性化的载体、步骤b获得的pcr产物通过同源重组进行连接，鉴定阳性克隆并测序验证，得到s5的grna表达盒pcxun-be3-s5。

经过测序验证：s5的grna表达盒pcxun-be3-s5的核苷酸序列为序列1，其中序列1的第392-5524位为由ncas9(d10a)核酸酶、脱氨酶(apobec1)、连接ncas9(d10a)核酸酶和脱氨酶的连接肽(xtenlinker)、尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白(ugi)组成的融合蛋白be3的编码基因序列、第5545-7535位为植物基因表达启动子ubi的核苷酸序列，第7785-8268位为sgrna序列。

(2)s3的grna表达盒pcxun-be3-s3的构建

a、用限制性内切酶pmei酶切pcxun-be3载体，得到线性化的载体；

b、以posu3-sgrna质粒为模板，分别利用引物s3-f/hrpme-u3r和hrpme-u3f/s3-r进行pcr扩增，并将扩增产物1:1混合后做为模板，用引物hrpme-u3f/hrpme-u3r进行扩增，回收pcr产物；

c、采用全式金公司的peasy-uniseamlesscloningandassemblykit将步骤a获得的线性化的载体、步骤b获得的pcr产物通过同源重组进行连接，鉴定阳性克隆并测序验证，得到s3的grna表达盒pcxun-be3-s3。

经过测序验证：s3的grna表达盒pcxun-be3-s3的核苷酸序列为序列2，其中序列2的第392-5524位为由ncas9(d10a)核酸酶、脱氨酶(apobec1)、连接ncas9(d10a)核酸酶和脱氨酶的连接肽(xtenlinker)、尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白(ugi)组成的融合蛋白be3的编码基因序列、第5545-7535位为植物基因表达启动子ubi的核苷酸序列，第7785-8268位为sgrna序列。

(3)p2的grna表达盒pcxun-be3-p2的构建

a、用限制性内切酶pmei酶切pcxun-be3载体，得到线性化的载体；

b、以posu3-sgrna质粒为模板，分别利用引物p2-f/hrpme-u3r和hrpme-u3f/p2-r进行pcr扩增，并将扩增产物1:1混合后做为模板，用引物hrpme-u3f/hrpme-u3r进行扩增，回收pcr产物；

c、采用全式金公司的peasy-uniseamlesscloningandassemblykit将步骤a获得的线性化的载体、步骤b获得的pcr产物通过同源重组进行连接，鉴定阳性克隆并测序验证，得到p2的grna表达盒pcxun-be3-p2。

经过测序验证：p2的grna表达盒pcxun-be3-p2的核苷酸序列为序列3，其中序列3的第392-5524位为由ncas9(d10a)核酸酶、脱氨酶(apobec1)、连接ncas9(d10a)核酸酶和脱氨酶的连接肽(xtenlinker)、尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白(ugi)组成的融合蛋白be3的编码基因序列、第5545-7535位为植物基因表达启动子ubi的核苷酸序列，第7785-8268位为sgrna序列。

二、重组菌的构建

分别将步骤一获得的重组质粒pcxun-be3-s5、pcxun-be3-s3和pcxun-be3-p2导入农杆菌eha105，分别得到重组农杆菌pcxun-be3-s5/eha105、pcxun-be3-s3/eha105和pcxun-be3-p2/eha105。

三、转基因水稻的获得

1、分别将重组农杆菌pcxun-be3-s5/eha105、pcxun-be3-s3/eha105及pcxun-be3-p2/eha105在lb培养基上培养两天后，收集农杆菌，并用aam培养基重悬，od600调到0.3-0.5，分别得到od600为0.3-0.5的菌液。

2、选取饱满的kitaake水稻种子，剥去种皮，灭菌洗涤后，均匀的点入r1培养基中，28℃持续光照2-3周诱导愈伤组织的形成。将形成的愈伤组织转移到新的r1培养基上培养3-5天，然后分别转移到上述od600为0.3-0.5的菌液中侵染5分钟，侵染后用滤纸吸干表面菌液并转移到r2培养基上在25℃下培养三天，再转移至含有浓度为50mg/l潮霉素的r1筛选培养基上，在28℃条件下持续光照2周后转移至新的含有浓度为50mg/l潮霉素的r1筛选培养基，在28℃条件下持续光照2周。选取生长良好呈嫩黄色的阳性愈伤组织，用无菌镊子移至含有浓度为50mg/l潮霉素的r4分化培养基中，在28℃条件下持续光照培养。待分化出来的幼苗长至2-5mm时，将幼苗转入不含激素和抗生素的r5培养基中，在28℃条件下持续光照培养2-3周，之后移入土中置于温室中生长(培养条件为：温度28-30℃，光照为16h光照/8h黑暗)，分别得到t0代转p2水稻植株、t0代转s3水稻植株和t0代转s5水稻植株。

3、转基因水稻植株的鉴定

根据载体序列分别设计检测be3，grna和hptii基因引物be3-f/r，u3-f/r和hptii-f/r(表2)，对获得的所有t0代转s5水稻植株、t0代转s3水稻植株和t0代转p2水稻植株进行pcr鉴定并统计结果。

转基因水稻植株的pcr鉴定结果如图2所示。结果表明：共获得52颗阳性t0代转s5水稻植株、38颗阳性t0代转s3水稻植株及88颗阳性t0代转p2水稻植株。

四、定点编辑的检测

1、定点编辑ossbeiib的s5靶点的基因型鉴定

利用引物s5testf/r对步骤三获得的52颗阳性t0代转s5水稻植株的基因组dna进行扩增，得到pcr产物，用bstni酶切pcr产物，如果转s5水稻植株中的靶点序列发生所期待的突变，则该转s5水稻植株对应的pcr产物将无法被相对应的限制性内切酶bstni酶切。

酶切鉴定结果表明：52颗阳性t0代转s5水稻植株中共有23颗阳性t0代转s5水稻植株的pcr产物完全不能或者部分不能被bstni切开，说明在该酶切位点处发生突变，将上述23颗植株记作定点突变的植株，并对其进行测序。

测序结果如图3所示。根据测序结果可以将23颗定点突变的植株分成如下三类：第一类共有10颗植株，为第五位和第六位碱基由g突变成a(g5突变成a5和g6突变成a6)，其中，3颗植株为纯合类型(两条同源染色体的第五位和第六位碱基均由g突变成a，s5-17、s5-36、和s5-46)、6颗为杂合类型(s5-1、s5-8、s5-21、s5-33、s5-42和s5-43)，1颗为双等位突变类型(s5-34)，第一类(期待突变类型)占所有突变类型的43％(10/23)，相对于所有转基因植株而言，效率达到20％(10/52)；第二类共有8颗植株，为同时包含第五位和/或第六位碱基由g突变成a及g突变成c或者t，其中，一颗为纯合类型(s5-26)，另外7颗为杂合类型(s5-10、s5-25、s5-44、s5-45、s5-48、s5-50和s5-52)；第三类共有5颗植株，这一类型突变均为非期待类型，主要是位点的插入和缺失，3颗为双等位突变(s5-18、s5-31和s4-47)，2颗为杂合类型(s5-16和s5-23)。在s5靶点内同样含有其他的g，但都没有发生相应的突变。

2、定点编辑ossbeiib的s3靶点的基因型鉴定

利用引物s3testf/r对步骤三获得的38颗阳性t0代转s3水稻植株的基因组dna进行扩增，得到pcr产物，并对pcr扩增产物直接测序。

测序结果如图4所示。测序结果表明，38颗阳性t0代转s3水稻植株中共有11颗定点突变的植株，根据测序结果可以将11颗定点突变的植株分成如下三类：第一类共包含4颗植株，为只含有所期待的突变类型(c突变成t)，分别为s3-1，s3-4，s3-26和s3-29，其中，s3-1，s3-4和s3-29为纯合植株，s3-26为杂合型植株，杂合型植株s3-26的一条同源染色体上的三个靶位点均发生突变(第一，第二和第七位碱基均由c突变为t)，另外一条同源染色体的三个靶位点均为野生型；第二类只有一颗植株，为s3-6，s3-6的一条同源染色体的第七位碱基由c突变为t，另外一条同源染色体的第七位碱基由c突变为g；第三类共有6颗植株，均为非期待的类型，其中，4颗为纯合类型，为第七位碱基均由c突变为g，另外2颗植株为一条链在第一位碱基和第七位碱基均由c突变成g，另外一条链仅第七位碱基由c突变成g。

3、定点编辑ospds的p2靶点的基因型鉴定

利用引物p2testf/r对获得88颗阳性t0代转p2水稻植株的基因组dna进行扩增，得到pcr产物，用ecori酶切pcr产物，如果转p2水稻植株中的靶点序列发生所期待的突变，则该转p2水稻植株对应的pcr产物将无法被相对应的限制性内切酶bstni酶切。

利用ecori酶切t0代转p2水稻植株的pcr产物，结果表明有2颗t0代转p2水稻植株(p2-21和p2-79)的pcr产物为部分切开，说明在该酶切位点处发生突变，将上述2颗植株记作定点突变的植株，并对其进行测序。

测序结果如图5所示。结果表明，p2-21和p2-79均为杂合类型，p2-21的一条同源染色体在靶点序列的第八位和第十位碱基均由g突变成a，另外一条同源染色体为野生型。p2-79的一条同源染色体在靶点序列的第八位碱基由g突变成c，第十位碱基没有发生变化，另外一条同源染色体为野生型。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种crispr/ncas9介导的定点碱基替换在植物中的应用

<160>3

<210>1

<211>16981bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gaattcgagctcggtacccctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggt60

aacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcccgatcta120

gtaacatagatgacaccgcgcgcgataatttatcctagtttgcgcgctatattttgtttt180

ctatcgcgtattaaatgtataattgcgggactctaatcataaaaacccatctcataaata240

acgtcatgcattacatgttaattattacatgcttaacgtaattcaacagaaattatatga300

taatcatcgcaagaccggcaacaggattcaatcttaagaaactttattgccaaatgtttg360

aacgatcggggaaattcggatccccaatactttagactttcctcttcttcttgggagaac420

caccagagagcatcttaatcttgttctcaccgttgctatcctgtatgaccagagcccaag480

gcttgtattcaggggcgtcgctagtcagaagcatgacattctcgtcggtgctctcgtcgt540

aggcggtgtgcacgagtatatcgctttccggcttgttcccaatgacttcttccacctcct600

ctgggagcatgaggatggattcctggataaccagttgcttaccggtctccttttcaataa660

tatctgacagattagtagaaccaccagagtcacccccaagctgtgacaaatctatccgag720

tttcatataatcccgtgatggattggtgaatcagtgtcgcgtctagcacctccttggtag780

aagtgtatcgtttgcgatctatcgttgtgtcaaaatacttgaatgcggctggagcgccga840

ggttggtaagagtaaacaaatggataatattttccgcctgctcacgtatgggtttatccc900

tgtgcttgttgtatgcgcttaatactttgtccagattggcatcagctaggatgactctct960

tactgaattccgaaatttgctctatgatttcgtcgagataatgtttgtgctgctcaacaa1020

aaagttgcttctgttcgttatcttcaggtgaacctttcaacttctcgtaatgggacgcta1080

aatacaggaaattcacgtatttagacggtagtgcgagttcgttccccttttgaagctctc1140

cggcgctagccaacatccgttttcggccattttctaactcaaacagactatactttggta1200

gtttaattatgagatccttttttacttccttgtaacctttcgcctcaaggaagtcgatgg1260

ggttcttttcaaaagacgagcgctccataatcgttatccccaataattctttgactgact1320

tcagtttcttggattttcccttctcaacttttgccactactaggacagaataggcaactg1380

tagggctatcgaagccaccgtactttttcgggtcccagtcctttttacgagcgatgagct1440

tatcactattcctttttggaagaatcgattcctttgaaaaccctccggtctgcacctcag1500

ttttctttactatgttgacttggggcatggacaaaacttttctcaccgtcgcgaagtccc1560

ggcccttatcccatacgatttcacctgtctccccattggtttcaattaaaggtcgtttgc1620

gtatctctccgtttgccagagtgatttccgtcttaaagaaattcataatgttagaataaa1680

agaagtatttggctgtagccttgcctatctcctgttcgcttttcgcgatcatcttacgga1740

cgtcataaactttgtaatcaccatacacaaactcactttctagcttcgggtatttcttaa1800

tgagtgcggtccctacgacggcattaagataagcgtcgtgcgcatggtggtagttattta1860

tctccctaactttatagaattgaaaatcctttctgaagtccgacaccaattttgacttta1920

aagtgattactttgacttcccgaatcagcttatcgttctcgtcgtatttcgtattcattc1980

gggaatctagtatctgtgcaacatgctttgtgatttggcgggtttccacgagctgacgtt2040

taataaatccggccttgtcaagttcagacaagccacccctctcagctttagttaagttat2100

cgaactttctttgcgttatcagtttcgcatttaggagctgccgccaatagttcttcattt2160

tctttacgacttcctcgcttggaacattgtcacttttccctcggttcttatccgagcgtg2220

taagcactttattgtcgattgaatcgtccttcaaaaaggattggggtacaatgtgatcga2280

cgtcgtaatcagataaacggtttatgtccagttcctgatcaacatacatgtcccttccat2340

tttgtaggtaatagaggtaaagtttctcgttctgcaattgggtattttccacaggatgct2400

cctttaagatctggctgcccagttctttaataccctcttctattctcttcatccgctctc2460

gactgtttttttgccccttctgagtcgtttgattttcgcgtgccatctcgattacaatgt2520

tttccggtttgtgacgtcccatgaccttaactagctcatccactactttgactgtctgga2580

gtatgccctttttgatggctggcgaaccagcaagattcgcaatatgttcgtgcaatgagt2640

ccccttgtccggaaacctgtgccttttgtatatcctctttgaaggttaaagagtcatcat2700

ggatcagctgcataaagttcctattggcgaagccgtcgctctttagaaaatcgagaatag2760

ttttaccactttgcttgtctcttatcccgttgataagtttccgcgacaatcgtccccagc2820

ccgtatagcgacgcctctttaactgtttcataaccttatcgtcgaacaggtgagcgtatg2880

tttttagtctttcctcaatcatttcccgatcttcaaagagggtaagagtcaacactatat2940

cttctaagatatcttcattctcttcgttatccaggaagtccttatctttaattatcttta3000

ggaggtcatgatacgtaccaagtgacgcattaaatcgatcttctaccccggagatctcga3060

cagaatcgaagcattcaattttcttaaagtagtcctctttcaattgcttaactgtcactt3120

tgcggttggtcttgaataacagatctactattgctttcttctgttctccgcttagaaagg3180

cgggtttacgcatgccctcagtgacatacttaactttcgtgagttcattgtacactgtga3240

aatactcgtaaagtaaactgtgcttaggcaatactttttcgttcggtaaattcttgtcaa3300

agttggtcatcctctcgatgaacgattgagctgacgcacctttatcgacaacttcctcaa3360

aattccatggagtaatcgtttcttcggactttcttgtcatccatgcgaaccgagagttcc3420

ctcgggccaggggtcccacatagtaaggtatgcgaaaggttaggattttctcaatctttt3480

cacgattgtctttgaggaacggataaaaatcctcctgccttctaagtatagcatgcaatt3540

cgcctaagtggatttgatgtggaatgctaccgttgtcgaaagtccgctgctttcgcagta3600

gatcttcgcgattgagttttacaagcaactcttccgtcccatccatcttctctaatatgg3660

gtttgataaacttgtagaattcctcttgactcgctccgccgtcaatataacctgcgtacc3720

cgtttttcgactgatcaaagaatatttccttatatttctcaggcagttgctgacggacta3780

gggccttgagaagtgtcaagtcttggtgatgttcatcgtaccttttgatcattgaagcgg3840

ataacggcgccttggtaatctcagtattaactctcagtatgtcagataggaggattgcat3900

cgctaaggtttttggcagccaaaaataagtccgcatactgatctccaatttgtgccagta3960

gattgtcgagatcgtcatcgtacgtgtccttactaagctgcaatttggcatcttcagcta4020

agtcgaagttcgacttaaaatttggtgtcaggcctagtgagagcgctataaggttaccga4080

acaacccatttttcttctctccgggtaattgtgcgatcaggttttctagccgtcgggatt4140

tagagaggcgggcgctaagaatagccttcgcatccacgccacttgcatttatagggttct4200

cttcaaacaactgattataggtttgtactaactggatgaacagtttgtcgacatccgagt4260

tgtccggatttagatcaccctcaatgagaaagtgcccacggaactttatcatatgggcaa4320

gagccaagtagattaacctcaggtccgctttatcagttgagtcaactagcttttttctga4380

ggtgataaatcgttgggtacttttcatgatatgccacctcatctactatgtttccaaaga4440

tggggtgccgttcatgtttcttgtcctcttcgacaaggaaggactcttccaaacggtgaa4500

agaaagaatcgtcaactttggccatctcattgctaaaaatttcttgtaagtaacatattc4560

ggttcttgcgacgtgtataccttctccgagcggttcgtttcaggcgagtcgcctctgccg4620

tttcgccactatcgaataggagggcaccgataagattctttttaatcgaatgacggtctg4680

tgttccccaacaccttaaatttctttgaaggtactttgtattcatcggttatgacagccc4740

atccaacggaattagtgccgatggctaaaccaatagaatactttttatcactttcgggtg4800

tggcggactctgaggtcccgggagtctcgctgccgcttttcaacccggtggcccagagaa4860

tgtgtgggggcagtcgctggtaatgacaagactgaagagcgatggtaaagaatgtcagct4920

gtggctgcttccttctcagaatgttgagacaaggaggcaggcccagtatgatgcagtaca4980

gttcaagaacgtacagtcgtacccacagatggggatacctaggccagtgggcttcattac5040

tcgggctataattcacaaagtttctccagcagtatcctgactcctgctcagtcataattt5100

ggatagtcacacctgaagagatcaaatcccgcaggccttgtcgattgcgggggtcagcgt5160

ggtggtacagccttgcgatgtaaataaacagagtgacgtggggataccttgacaggaatt5220

cagtgatggccctactacattcgccgcatgggctccagctgagaaaccaggtaatgctgc5280

accttgtgttcggacagaaatatctttctgtcgtgaacttctcgatgaagttgacttcga5340

cgtgcttgttagtgttctgtgatgtatgtcgccaaatggagtgccggcccccccaattaa5400

tttcgtaaagcaggcaggtctccttgcggagctctctcggatcgaagaatacctcaaact5460

catggggctcgatccgccgtctcaatgtggggtccacagccactgggccagtctctgagc5520

tcatagtattggggatcccccgggctgcagaagtaacaccaaacaacagggtgagcatcg5580

acaaaagaaacagtaccaagcaaataaatagcgtatgaaggcagggctaaaaaaatccac5640

atatagctgctgcatatgccatcatccaagtatatcaagatcaaaataattataaaacat5700

acttgtttattataatagataggtactcaaggttagagcatatgaatagatgctgcatat5760

gccatcatgtatatgcatcagtaaaacccacatcaacatgtatacctatcctagatcgat5820

atttccatccatcttaaactcgtaactatgaagatgtatgacacacacatacagttccaa5880

aattaataaatacaccaggtagtttgaaacagtattctactccgatctagaacgaatgaa5940

cgaccgcccaaccacaccacatcatcacaaccaagcgaacaaaaagcatctctgtatatg6000

catcagtaaaacccgcatcaacatgtatacctatcctagatcgatatttccatccatcat6060

cttcaattcgtaactatgaatatgtatggcacacacatacagatccaaaattaataaatc6120

caccaggtagtttgaaacagaattctactccgatctagaacgaccgcccaaccagaccac6180

atcatcacaaccaagacaaaaaaaagcatgaaaagatgacccgacaaacaagtgcacggc6240

atatattgaaataaaggaaaagggcaaaccaaaccctatgcaacgaaacaaaaaaaatca6300

tgaaatcgatcccgtctgcggaacggctagagccatcccaggattccccaaagagaaaca6360

ctggcaagttagcaatcagaacgtgtctgacgtacaggtcgcatccgtgtacgaacgcta6420

gcagcacggatctaacacaaacacggatctaacacaaacatgaacagaagtagaactacc6480

gggccctaaccatggaccggaacgccgatctagagaaggtagagagggggggggggggag6540

gacgagcggcgtaccttgaagcggaggtgccgacgggtggatttgggggagatctggttg6600

tgtgtgtgtgcgctccgaacaacacgaggttggggaaagagggtgtggagggggtgtcta6660

tttattacggcgggcgaggaagggaaagcgaaggagcggtgggaaaggaatcccccgtag6720

ctgccgtgccgtgagaggaggaggaggccgcctgccgtgccggctcacgtctgccgctcc6780

gccacgcatttctggatgccgacagcggagcaagtccaacggtggagcggaactctcgag6840

aggggtccagaggcagcgacagagatgccgtgccgtctgcttcgcttggcccgacgcgac6900

gctgctggttcgctggttggtgtccgttagactcgtcgacggcgtttaacaggctggcat6960

tatctactcgaaacaagaaaaatgtttccttagtttttttaatttcttaaagggtatttg7020

tttaatttttagtcactttattttattctattttatatctaaattattaaataaaaaaac7080

taaaatagagttttagttttcttaatttagaggctaaaatagaataaaatagatgtacta7140

aaaaaattagtctataaaaaccattaaccctaaaccctaaatggatgtactaataaaatg7200

gatgaagtattatataggtgaagctatttgcaaaaaaaaaggagaacacatgcacactaa7260

aaagataaaactgtagagtcctgttgtcaaaatactcaattgtcctttagaccatgtcta7320

actgttcatttatatgattctctaaaacactgatattattgtagtactatagattatatt7380

attcgtagagtaaagtttaaatatatgtataaagatagataaactgcacttcaaacaagt7440

gtgacaaaaaaaatatgtggtaattttttataacttagacatgcaatgctcattatctct7500

agagaggggcacgaccgggtcacgctgcactgcaggaattcgatatcaagcttggcactg7560

gccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgcctt7620

gcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgccct7680

tcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgctagagcagcttgagcttggatcagatt7740

gtcgtttcccgccttcagttttgcatgcctgcaggtcgacgattaaggaatctttaaaca7800

tacgaacagatcacttaaagttcttctgaagcaacttaaagttatcaggcatgcatggat7860

cttggaggaatcagatgtgcagtcagggaccatagcacaagacaggcgtcttctactggt7920

gctaccagcaaatgctggaagccgggaacactgggtacgttggaaaccacgtgatgtgaa7980

gaagtaagataaactgtaggagaaaagcatttcgtagtgggccatgaagcctttcaggac8040

atgtattgcagtatgggccggcccattacgcaattggacgacaacaaagactagtattag8100

taccacctcggctatccacatagatcaaagctgatttaaaagagttgtgcagatgatccg8160

tggcaggcacctggacacgagacgcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggc8220

tagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttccacataatctc8280

tagaggatccaaactatcagtgtttgacaggatatattggcgggtaaacctaagagaaaa8340

gagcgtttattagaataacggatatttaaaagggcgtgaaaaggtttatccgttcgtcca8400

tttgtatgtgcatgccaaccacagggttcccctcgggatcaaagtactttgatccaaccc8460

ctccgctgctatagtgcagtcggcttctgacgttcagtgcagccgtcttctgaaaacgac8520

atgtcgcacaagtcctaagttacgcgacaggctgccgccctgcccttttcctggcgtttt8580

cttgtcgcgtgttttagtcgcataaagtagaatacttgcgactagaaccggagacattac8640

gccatgaacaagagcgccgccgctggcctgctgggctatgcccgcgtcagcaccgacgac8700

caggacttgaccaaccaacgggccgaactgcacgcggccggctgcaccaagctgttttcc8760

gagaagatcaccggcaccaggcgcgaccgcccggagctggccaggatgcttgaccaccta8820

gccctggcgacgttgtgacagtgaccaggctagaccgcctggcccgcagcacccgcgacc8880

tactggacattgccgagcgcatccaggaggccggcgcgggcctgcgtagcctggcagagc8940

cgtgggccgacaccaccacgccggccggccgcatggtgttgaccgtgttcgccggcattg9000

ccgagttcgagcgttccctaatcatcgaccgcacccggagcgggcgcgaggccgccaagg9060

cccgaggcgtgaagtttggcccccgccctaccctcaccccggcacagatcgcgcacgccc9120

gcgagctgatcgaccaggaaggccgcaccgtgaaagaggcggctgcactgcttggcgtgc9180

atcgctcgaccctgtaccgcgcacttgagcgcagcgaggaagtgacgcccaccgaggcca9240

ggcggcgcggtgccttccgtgaggacgcattgaccgaggccgacgccctggcggccgccg9300

agaatgaacgccaagaggaacaagcatgaaaccgcaccaggacggccaggacgaaccgtt9360

tttcattaccgaagagatcgaggcggagatgatcgcggccgggtacgtgttcgagccgcc9420

cgcgcacgtctcaaccgtgcggctgcatgaaatcctggccggtttgtctgatgccaagct9480

ggcggcctggccggccagcttggccgctgaagaaaccgagcgccgccgtctaaaaaggtg9540

atgtgtatttgagtaaaacagcttgcgtcatgcggtcgctgcgtatatgatgcgatgagt9600

aaataaacaaatacgcaaggggaacgcatgaaggttatcgctgtacttaaccagaaaggc9660

gggtcaggcaagacgaccatcgcaacccatctagcccgcgccctgcaactcgccggggcc9720

gatgttctgttagtcgattccgatccccagggcagtgcccgcgattgggcggccgtgcgg9780

gaagatcaaccgctaaccgttgtcggcatcgaccgcccgacgattgaccgcgacgtgaag9840

gccatcggccggcgcgacttcgtagtgatcgacggagcgccccaggcggcggacttggct9900

gtgtccgcgatcaaggcagccgacttcgtgctgattccggtgcagccaagcccttacgac9960

atatgggcaaccgccgacctggtggagctggttaagcagcgcattgaggtcacggatgga10020

aggctacaagcggcctttgtcgtgtcgcgggcgatcaaaggcacgcgcatcggcggtgag10080

gttgccgaggcgctggccgggtacgagctgcccattcttgagtcccgtatcacgcagcgc10140

gtgagctacccaggcactgccgccgccggcacaaccgttcttgaatcagaacccgagggc10200

gacgctgcccgcgaggtccaggcgctggccgctgaaattaaatcaaaactcatttgagtt10260

aatgaggtaaagagaaaatgagcaaaagcacaaacacgctaagtgccggccgtccgagcg10320

cacgcagcagcaaggctgcaacgttggccagcctggcagacacgccagccatgaagcggg10380

tcaactttcagttgccggcggaggatcacaccaagctgaagatgtacgcggtacgccaag10440

gcaagaccattaccgagctgctatctgaatacatcgcgcagctaccagagtaaatgagca10500

aatgaataaatgagtagatgaattttagcggctaaaggaggcggcatggaaaatcaagaa10560

caaccaggcaccgacgccgtggaatgccccatgtgtggaggaacgggcggttggccaggc10620

gtaagcggctgggttgtctgccggccctgcaatggcactggaacccccaagcccgaggaa10680

tcggcgtgacggtcgcaaaccatccggcccggtacaaatcggcgcggcgctgggtgatga10740

cctggtggagaagttgaaggccgcgcaggccgcccagcggcaacgcatcgaggcagaagc10800

acgccccggtgaatcgtggcaagcggccgctgatcgaatccgcaaagaatcccggcaacc10860

gccggcagccggtgcgccgtcgattaggaagccgcccaagggcgacgagcaaccagattt10920

tttcgttccgatgctctatgacgtgggcacccgcgatagtcgcagcatcatggacgtggc10980

cgttttccgtctgtcgaagcgtgaccgacgagctggcgaggtgatccgctacgagcttcc11040

agacgggcacgtagaggtttccgcagggccggccggcatggccagtgtgtgggattacga11100

cctggtactgatggcggtttcccatctaaccgaatccatgaaccgataccgggaagggaa11160

gggagacaagcccggccgcgtgttccgtccacacgttgcggacgtactcaagttctgccg11220

gcgagccgatggcggaaagcagaaagacgacctggtagaaacctgcattcggttaaacac11280

cacgcacgttgccatgcagcgtacgaagaaggccaagaacggccgcctggtgacggtatc11340

cgagggtgaagccttgattagccgctacaagatcgtaaagagcgaaaccgggcggccgga11400

gtacatcgagatcgagctagctgattggatgtaccgcgagatcacagaaggcaagaaccc11460

ggacgtgctgacggttcaccccgattactttttgatcgatcccggcatcggccgttttct11520

ctaccgcctggcacgccgcgccgcaggcaaggcagaagccagatggttgttcaagacgat11580

ctacgaacgcagtggcagcgccggagagttcaagaagttctgtttcaccgtgcgcaagct11640

gatcgggtcaaatgacctgccggagtacgatttgaaggaggaggcggggcaggctggccc11700

gatcctagtcatgcgctaccgcaacctgatcgagggcgaagcatccgccggttcctaatg11760

tacggagcagatgctagggcaaattgccctagcaggggaaaaaggtcgaaaaggtctctt11820

tcctgtggatagcacgtacattgggaacccaaagccgtacattgggaaccggaacccgta11880

cattgggaacccaaagccgtacattgggaaccggtcacacatgtaagtgactgatataaa11940

agagaaaaaaggcgatttttccgcctaaaactctttaaaacttattaaaactcttaaaac12000

ccgcctggcctgtgcataactgtctggccagcgcacagccgaagagctgcaaaaagcgcc12060

tacccttcggtcgctgcgctccctacgccccgccgcttcgcgtcggcctatcgcggccgc12120

tggccgctcaaaaatggctggcctacggccaggcaatctaccagggcgcggacaagccgc12180

gccgtcgccactcgaccgccggcgcccacatcaaggcaccctgcctcgcgcgtttcggtg12240

atgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaag12300

cggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggg12360

gcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggc12420

atcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgt12480

aaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctc12540

ggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccac12600

agaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaa12660

ccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatca12720

caaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggc12780

gtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggata12840

cctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggta12900

tctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttca12960

gcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacga13020

cttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcgg13080

tgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttgg13140

tatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccgg13200

caaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcag13260

aaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaa13320

cgaaaactcacgttaagggattttggtcatgcattctaggtactaaaacaattcatccag13380

taaaatataatattttattttctcccaatcaggcttgatccccagtaagtcaaaaaatag13440

ctcgacatactgttcttccccgatatcctccctgatcgaccggacgcagaaggcaatgtc13500

ataccacttgtccgccctgccgcttctcccaagatcaataaagccacttactttgccatc13560

tttcacaaagatgttgctgtctcccaggtcgccgtgggaaaagacaagttcctcttcggg13620

cttttccgtctttaaaaaatcatacagctcgcgcggatctttaaatggagtgtcttcttc13680

ccagttttcgcaatccacatcggccagatcgttattcagtaagtaatccaattcggctaa13740

gcggctgtctaagctattcgtatagggacaatccgatatgtcgatggagtgaaagagcct13800

gatgcactccgcatacagctcgataatcttttcagggctttgttcatcttcatactcttc13860

cgagcaaaggacgccatcggcctcactcatgagcagattgctccagccatcatgccgttc13920

aaagtgcaggacctttggaacaggcagctttccttccagccatagcatcatgtccttttc13980

ccgttcaacatcataggtggtccctttataccggctgtccgtcatttttaaatataggtt14040

ttcattttctcccaccagcttatataccttagcaggagacattccttccgtatcttttac14100

gcagcggtatttttcgatcagttttttcaattccggtgatattctcattttagccattta14160

ttatttccttcctcttttctacagtatttaaagataccccaagaagctaattataacaag14220

acgaactccaattcactgttccttgcattctaaaaccttaaataccagaaaacagctttt14280

tcaaagttgttttcaaagttggcgtataacatagtatcgacggagccgattttgaaaccg14340

cggtgatcacaggcagcaacgctctgtcatcgttacaatcaacatgctaccctccgcgag14400

atcatccgtgtttcaaacccggcagcttagttgccgttcttccgaatagcatcggtaaca14460

tgagcaaagtctgccgccttacaacggctctcccgctgacgccgtcccggactgatgggc14520

tgcctgtatcgagtggtgattttgtgccgagctgccggtcggggagctgttggctggctg14580

gtggcaggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaataacacattgc14640

ggacgtttttaatgtactgaattaacgccgaattaattcgggggatctggattttagtac14700

tggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttacaaatacaaata14760

catactaagggtttcttatatgctcaacacatgagcgaaaccctataggaaccctaattc14820

ccttatctgggaactactcacacattattatggagaaactcgagcttgtcgatcgacaga14880

tccggtcggcatctactctatttctttgccctcggacgagtgctggggcgtcggtttcca14940

ctatcggcgagtacttctacacagccatcggtccagacggccgcgcttctgcgggcgatt15000

tgtgtacgcccgacagtcccggctccggatcggacgattgcgtcgcatcgaccctgcgcc15060

caagctgcatcatcgaaattgccgtcaaccaagctctgatagagttggtcaagaccaatg15120

cggagcatatacgcccggagtcgtggcgatcctgcaagctccggatgcctccgctcgaag15180

tagcgcgtctgctgctccatacaagccaaccacggcctccagaagaagatgttggcgacc15240

tcgtattgggaatccccgaacatcgcctcgctccagtcaatgaccgctgttatgcggcca15300

ttgtccgtcaggacattgttggagccgaaatccgcgtgcacgaggtgccggacttcgggg15360

cagtcctcggcccaaagcatcagctcatcgagagcctgcgcgacggacgcactgacggtg15420

tcgtccatcacagtttgccagtgatacacatggggatcagcaatcgcgcatatgaaatca15480

cgccatgtagtgtattgaccgattccttgcggtccgaatgggccgaacccgctcgtctgg15540

ctaagatcggccgcagcgatcgcatccatagcctccgcgaccggttgtagaacagcgggc15600

agttcggtttcaggcaggtcttgcaacgtgacaccctgtgcacggcgggagatgcaatag15660

gtcaggctctcgctaaactccccaatgtcaagcacttccggaatcgggagcgcggccgat15720

gcaaagtgccgataaacataacgatctttgtagaaaccatcggcgcagctatttacccgc15780

aggacatatccacgccctcctacatcgaagctgaaagcacgagattcttcgccctccgag15840

agctgcatcaggtcggagacgctgtcgaacttttcgatcagaaacttctcgacagacgtc15900

gcggtgagttcaggctttttcatatctcattgccccccggatctgcgaaagctcgagaga15960

gatagatttgtagagagagactggtgatttcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaactt16020

ccttatatagaggaaggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatcccttacgtcag16080

tggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttttcca16140

cgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcatcttgaa16200

cgatagcctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggtgccaccttccttttctactg16260

tccttttgatgaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttcccgatatta16320

ccctttgttgaaaagtctcaatagccctttggtcttctgagactgtatctttgatattct16380

tggagtagacgagagtgtcgtgctccaccatgttatcacatcaatccacttgctttgaag16440

acgtggttggaacgtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgg16500

gaccactgtcggcagaggcatcttgaacgatagcctttcctttatcgcaatgatggcatt16560

tgtaggtgccaccttccttttctactgtccttttgatgaagtgacagatagctgggcaat16620

ggaatccgaggaggtttcccgatattaccctttgttgaaaagtctcaatagccctttggt16680

cttctgagactgtatctttgatattcttggagtagacgagagtgtcgtgctccaccatgt16740

tggcaagctgctctagccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcatta16800

atgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaa16860

tgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtat16920

gttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgatta16980

c16981

<210>2

<211>16981bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2