真菌基因定点插入突变的近原位回补方法与流程

本发明属于微生物基因工程领域中用于真菌基因敲除及互补的分子工具及实验体系，尤其涉及一种真菌基因定点插入突变的近原位回补方法。

背景技术：

基因失活技术是通过改变生物的遗传基因，令特定的基因序列发生改变，导致基因失活并丧失功能，进而推测出该基因生物学功能的一种遗传工程技术。基因互补是在基因缺失突变体中人工导入所缺失的基因从而实现恢复该基因功能的技术。基因失活和基因互补广泛应用于基因功能的研究。

根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)是一种革兰氏阴性土壤杆菌，在自然条件下，它能够在植物的受伤部位侵染植物细胞，将其染色体外遗传物质ti质粒段dna(t-dna)大多以单拷贝形式随机整合进植物的基因组中。许多研究表明根癌农杆菌不仅可以转化植物而且可以转化细菌、动物和真菌。因此，通过这一原理，利用农杆菌介导将外源dna片段转化至靶细胞中已成为研究植物、真菌甚至动物功能基因的一种常用反向遗传学技术。

crispr/cas是一种基因定点编辑技术，在该系统中通过形成具有引导作用的sgrna(singleguiderna)引导核酸酶cas9蛋白在靶位点切割双链dna，再通过非同源末端连接进行dna双链断裂修复，在此修复过程中可进行序列编辑或小片段缺失而造成基因序列的改变从而起到对基因的编辑或敲除。

迄今为止，在许多病原真菌中尚无法通过转化原生质体的方法进行有效的遗传操作，只能依赖农杆菌介导的转化导入外源dna片段，而农杆菌介导的外源dna片段转化具有随机性，无法对特定位点进行精确插入。且在基因敲除后的基因互补验证中，有的物种由于缺乏相应的基因互补技术而无法进行基因互补验证；目前在病原真菌中均采取随机插入互补基因片段的方法进行基因互补，若基因互补时互补片段随机插入在另一功能基因的dna编码区时则会影响其他基因功能而无法达到准确恢复所敲除的基因功能来研究基因功能的目的。因此，有必要开发一套高效的定点插入基因互补技术，为研究病原真菌的基因功能及其致病机制提供便利。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种真菌基因定点插入突变的近原位回补方法，以实现互补基因dna片段在设定的基因组位点的准确插入，使目标基因功能恢复，从而为研究病原真菌功能基因组学提供重要工具。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

真菌基因定点插入突变的近原位回补方法，是将靶标位点经过碱基更改但氨基酸序列不变的互补基因片段和u6启动子驱动携带抗性基因特异识别序列的sgrna表达盒与根癌农杆菌t-质粒整合，构建以诺尔丝菌素为抗性筛选标记的根癌农杆菌介导的病原真菌基因定点互补载体；用该互补载体转化病原真菌基因插入失活突变体的孢子，依赖突变体内所携带的cas9对靶标位点进行切割，从而实现将互补基因片段准确插入突变体的抗性基因靶标位点。

上述真菌基因定点插入突变的近原位回补方法，互补基因片段经in-fusion技术重组至带有携带抗性基因特异识别序列的sgrna表达盒及gapd基因启动子驱动的诺尔丝菌素抗性基因的双元载体中，再由携带该双元载体的根癌农杆菌介导转化携带cas9基因的插入失活突变体的孢子，从而达到对真菌基因组的定点互补。

突变体所携带的抗性基因为潮霉素抗性基因，以及所有来源于敲除突变体所携带的作为选择标记的抗性基因。

病原真菌为甘蔗鞭黑穗菌。

互补基因片段为mfa2、prf或g827基因，以及其他所有基因敲除突变株的互补基因。

病原真菌基因插入失活突变体的孢子按以下方法制备：使用甘蔗鞭黑穗菌内源snrna启动子驱动sgrna表达盒，将crispr-cas9系统与根癌农杆菌t-质粒整合，构建以潮霉素为抗性筛选标记的根癌农杆菌介导的甘蔗鞭黑穗菌基因定点插入载体失活系统；将目标基因的特异识别序列克隆入sgrna表达盒，用于转化甘蔗鞭黑穗菌担孢子，从而将载体系统的可跳动dna片段准确插入甘蔗鞭黑穗菌目标基因靶标序列；目标基因为甘蔗鞭黑穗菌jg35野生型菌株的mfa2、prf或g827基因。

病原真菌基因插入失活突变体的孢子按以下方法制备：通过将甘蔗鞭黑穗菌内源u6基因启动子(sspu6，seq.id.no.17的碱基序列；ssu6rna，seq.id.no.18的碱基序列)与所插入位点靶标序列以及sgrna序列经overlappingpcr融合后，经in-fusion技术重组至带有由甘蔗鞭黑穗菌内源gapd基因启动子驱动的cas9基因及潮霉素抗性基因的双元载体中；再由携带该双元载体的根癌农杆菌介导转化甘蔗鞭黑穗菌从而达到对甘蔗鞭黑穗菌基因组的定点插入；甘蔗鞭黑穗菌u6基因启动子具有序列表seq.id.no.17的碱基序列。

发明人研究了crispr-cas9介导的基因插入失活及基因互补技术，计划依靠靶向序列引导及农杆菌介导，在病原真菌基因组中定点插入外源片段高效地进行基因敲除，构建目标基因的敲除突变株；并在所获得的敲除突变株中，计划依靠靶向序列引导及农杆菌介导定点互补所敲除基因在靶标位点处经过碱基更改但氨基酸序列不变的dna片段，构建目标基因的互补突变株。

为此，发明人建立了一套基因定点插入突变方法和基因定点互补方法，其中，基因定点插入突变方法为根癌农杆菌和crispr-cas9介导的基因定点插入突变方法，该法使用u6基因启动子驱动sgrna表达盒，将crispr-cas9系统与根癌农杆菌t-质粒整合，构建以潮霉素为抗性筛选标记的根癌农杆菌介导的病原真菌基因定点插入突变载体系统；将目标基因的特异识别序列克隆入sgrna表达盒，将该表达盒连接至基因定点插入突变载体后，将该载体转化真菌孢子，从而将载体系统的可跳动dna片段准确插入目标基因靶标位点，达到破坏基因功能使目标基因突变失活的目的。基因定点互补方法为真菌基因定点插入突变的近原位回补方法，在对目标基因进行插入突变失活的过程中，cas9基因和潮霉素抗性基因随t-dna一同插入到目标基因中，因此在对目标基因进行互补时，可使用携带潮霉素抗性基因特异识别序列的sgrna表达盒与根癌农杆菌t-质粒整合构建以诺尔丝菌素为抗性筛选标记的基因互补载体系统；将在靶标位点处经过碱基更改但氨基酸序列不变目标互补片段导入该定点互补载体中，用于转化已携带cas9基因的敲除突变体的孢子，cas9基因在新导入的携带潮霉素抗性基因特异识别序列的sgrna的引导下对潮霉素抗性基因靶标序列进行切割，从而将互补dna片段精确插入潮霉素抗性基因中实现基因定点互补的目的。通过将不同的靶标序列克隆至sgrna表达盒即可将互补dna序列定点互补至特定位点中。

通过在甘蔗鞭黑穗菌基因组中进行实验，发明人发现了具有功能的甘蔗鞭黑穗菌u6基因启动子，其可在甘蔗鞭黑穗菌中转录出载体上位于u6启动子下游sgrna序列，用于在上述基因定点插入失活方法中执行基本的转录功能。

通过在甘蔗鞭黑穗菌jg35野生型菌株中分别对mfa2(mfa2cds，seq.id.no.21；mfa2，seq.id.no.22)、prf和g827等3个基因进行基因失活，分别构建三个基因的敲除突变株。在敲除mfa2基因时，对随机挑选的具有潮霉素抗性的46个转化子进行pcr鉴定，其中发生外源片段定点插入的转化子为18个，外源片段定点插入率为39％，即靶基因失活率为39％。在敲除prf基因时，对随机挑选的具有潮霉素抗性的23个转化子进行pcr鉴定，其中发生外源片段定点插入的转化子为5个，外源片段定点插入率为21.7％，即靶基因失活率为21.7％。在敲除g827基因时，对随机挑选的具有潮霉素抗性的23个转化子进行pcr鉴定，其中发生外源片段定点插入的转化子为3个，外源片段定点插入率为13％，即靶基因失活率为13％。实验表明，通过根癌农杆菌介导的crispr-cas9定点插入技术可在病原真菌中对目标基因进行定点插入而达到基因失活的目的，进而对基因功能进行研究；而且基因失活效率显著高于目前常用的同源双交换基因打靶的效率。由农杆菌t-dna/crispr/cas9组合介导的定点插入的这一现象在其他物种中尚无报道。上述高效基因失活系统的建立，为研究病原真菌的功能基因组学提供了重要工具，该系统具有高效性和准确性，方便在病原真菌中进行基因功能的研究。

以甘蔗鞭黑穗菌编码信息素基因mfa2为例，发明人利用农杆菌介导的crispr-cas9定点插入技术在mfa2基因中定点插入整合有crispr-cas9的t-dna序列，破坏了mfa2基因，从而导致该基因功能的缺失(图4)。甘蔗鞭黑穗菌mfa2基因编码信息素，信息素在单倍体菌株配合过程中具有重要的作用。正负交配型的野生型甘蔗鞭黑穗菌jg35和jg36未配合是呈酵母状(图6b)，两者可以通过配合在平板上形成白色绒毛状菌落(图6c)，而被外源片段插入后的mfa2基因功能丧失从而导致转化子无法与野生型jg36菌株配对形成白色绒毛状菌落(图6a)。发明人通过设计引物对转化子进行筛选鉴定(图5)，可明确外源片段插入的方向(图7)，由于甘蔗鞭黑穗菌无法通过原生质体转化的方法导入外源基因片段，且传统的由农杆菌介导的转化均是随机插入。因此，发明人通过整合农杆菌t-dna/crispr/cas9能够实现在病原真菌中定点插入外源dna片段使目标基因失活，为研究病原真菌功能基因组学提供了重要工具。

以上述研究成果为基础，发明人通过在甘蔗鞭黑穗菌δmfa2突变株中对mfa2基因进行基因互补，构建δmfa2的基因互补株，建立了一种基因定点互补方法。以甘蔗鞭黑穗菌编码信息素基因mfa2为例，本发明利用农杆菌介导的crispr-cas9定点互补技术在hph基因中定点插入整合有在靶标位点处经过碱基更改但氨基酸序列不改变的mfa2基因序列及其内源启动子的t-dna序列，破坏了hph基因的同时插入mfa2及其内源启动子，从而导致hph基因功能的缺失和mfa2基因的功能修复(图10)。在互补mfa2基因及其内源启动子时，对随机挑选的具有诺尔丝菌素抗性的190个回补转化子进行潮霉素及pcr鉴定，其中hph基因被互补片段定点插入失活的转化子为160个，即靶基因失活率为84.2％。在这190个具有诺尔丝菌素抗性的互补转化子中，170个转化子能恢复mating功能，互补效率为89.5％，其中外源片段定点插入至潮霉素靶标位点且恢复mating功能的互补的转化子为148个，定点互补率为77.9％。在δmfa2菌株中由于mfa2基因序列回补后mfa2基因功能得到修复从而导致转化子恢复与野生型jg36菌株配对形成白色绒毛状菌落(图13)。本发明通过潮霉素和诺尔丝菌素对互补转化子进行抗性筛选，并通过设计引物对互补转化子进行筛选鉴定(图10)，可明确回补片段插入的方向，而传统的基因互补是通过互补片段随机插入实现，但在随机插入的同时具有破坏基因导致其他基因失活的可能。因此，本发明通过整合农杆菌t-dna和目标互补dna片段能够实现在携带cas9基因的基因插入失活突变体中定点互补dna片段，使目标基因功能恢复，为研究病原真菌功能基因组学提供了重要工具。

附图说明

图1是pls-hcas9质粒图谱。

图2是psgrna-ssu6质粒图谱。

图3是psgrna-ssu6质粒和pls-hcas-mfa2质粒的电泳图，图中：a)psgrna-ssu6质粒构建，m：generuler1kbplus；1：线性psgrnavector；2：sspu6；3：psgrna-ssu6；b)pls-hcas-mfa2质粒构建，m：generuler1kbplus；1：线性pls-hcas9vector；2：sspu6-mfa2-sgrna；3：pls-hcas9-mfa2。

图4是pls-hcas9-mfa2定点插入甘蔗鞭黑穗菌mfa2基因的示意图。

图5是定点插入的pcr鉴定方法示意图。

图6是农杆菌介导的crispr-cas9定点插入失活甘蔗鞭黑穗菌mfa2基因结果图。

图7是转化子的pcr验证图，图中：a)以转化子基因组dna为模板，m：generuler1kbplus；1-17：转化子；b)以转化子基因组dna为模板，m：generuler1kbplus；1-17：转化子。

图8是δmfa2、δprf及δg827转化子pcr测序比对图。

图9是pngr-com质粒图谱。

图10是pngr-com-mfa2定点互补目标片段及pcr鉴定的示意图。

图11是互补转化子的pcr验证图，图中：a)分别以δmfa2和转化子基因组dna为模板，以引物hphf和hph1-r扩增，m：generuler1kbplus；b)分别以δmfa2和转化子基因组dna为模板，以引物cmfa2f和cmfa2r扩增，m：generuler1kbplus；c)分别以δmfa2和转化子基因组dna为模板，以引物对gpdf/cmfa2r和natr01/hph1-r扩增，m：generuler1kbplus；。d)分别以δmfa2和转化子基因组dna为模板，以引物对gpdf/natr01和cmfa2r/hph1-r扩增，m：generuler1kbplus。

图12是互补mfa2转化子pcr测序比对图。

图13是农杆菌介导的crispr-cas9定点互补mfa2基因结果图。

具体实施方式

本发明真菌基因定点插入突变的近原位回补方法，是将在靶标位点处经过碱基更改但氨基酸序列不变的互补基因片段和u6启动子驱动携带抗性基因特异识别序列的sgrna表达盒与根癌农杆菌t-质粒整合，构建以诺尔丝菌素为抗性筛选标记的根癌农杆菌介导的病原真菌基因定点互补载体；用该互补载体转化病原真菌基因插入失活突变体的孢子，依赖基因插入失活突变体内所携带的cas9对靶标位点进行切割，从而实现将互补基因片段准确插入突变体的抗性基因靶标序列。其中，将在靶标位点处经过碱基更改但氨基酸序列不变的互补基因片段经in-fusion技术重组至带有携带抗性基因特异识别序列的sgrna表达盒及gapd基因启动子驱动的诺尔丝菌素抗性基因的双元载体中，再由携带该双元载体的根癌农杆菌介导转化携带cas9基因的插入失活突变体的孢子，从而达到对真菌基因组的定点互补。

为进一步阐明上述发明构思，以甘蔗鞭黑穗菌信息素基因mfa2为例进行说明。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用实验材料和试剂，如无特别说明，均可通过商业途径获得。实施例中的甘蔗鞭黑穗菌野生型菌株和农杆菌菌株agl1从广西大学获得。

一、具体试验操作步骤

1.u6启动子驱动的携带目标基因靶标的sgrna的获得

以psgrna-ssu6(seq.id.no.19)质粒为模板，在一个反应中使用4种引物：u-f(5’-ctccgttttacctgtggaatcg-3’，seq.id.no.1)和gr-r(5’-cggaggaaaattccatccac-3’，seq.id.no.2)各0.2μm，ssu6tmfa2-(5’-ggacggaggcagcaacagtcgagggtaaaatctgattgtatg-3’，seq.id.no.3)和grtmfa2+(5’-actgttgctgcctccgtccgttttagagctagaaat-3’，seq.id.no.4)各0.1μm。30个循环：94℃10s，58℃15s，68℃20s。

2.将上步pcr产物稀释10倍后取2微升为模板，使用引物对：u-fsbamhiin(5’-ctatgttactagaggatcccggaatgatctacaaagcgttcttc-3’，seq.id.no.5)和gr-rhindiiiin(5’-taaccatggtaccaagcttattccatccactccaagctcttg-3’，seq.id.no.6)，用高保真dna聚合酶进行pcr扩增，pcr扩增程序：98℃预变性2min，98℃变性10sec，60℃退火15sec，72℃延伸20sec，进行30个循环；最后72℃延伸5min。电泳检测：取5μl扩增产物，加入1μl的6×loadingbuffer混匀，点样于0.8％的琼脂糖凝胶(含0.05μl/mlgoldview)上样孔中，用0.5×tbe缓冲液在3-5v/em电压条件下电泳30min，于凝胶成像系统下观察分析。pcr反应液组成(50μl体系)如下：

3.采用胶回收试剂盒对第2步pcr产物进行胶回收纯化。

4.采用限制性内切酶bamhi和hindiii酶切双元载体pls-hcas9(seq.id.no.20)，采用片段纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收。酶切反应液组成(100μl体系)如下：

5.采用in-fusion方法对回收的sgrna表达盒片段与纯化的线性双元载体pls-hcas9进行连接，反应体系如下：

5×in-fusion1μl

回收sgrna表达盒片段3μl

纯化的线性pls-hcas9载体1μl

50℃反应30分钟，立即置于冰上。

6.反应产物转化dh5α感受态细胞：在超净台内将第5步所得连接产物加入感受态细胞中，冰上放置30min后，于42℃热击45秒后立即置于冰上冷却2分钟。在超净台内向ep管中加入1ml无菌soc液体培养基，将ep管置于37℃摇床，200rpm摇动1小时后，将菌体涂布到含壮观霉素终浓度为100μg/ml的la平板中，置于37℃倒置培养过夜。

7.通过菌落pcr对转化子进行筛选。采用引物对l1f(5’-gcatgacgttatttatgaggtggg-3’，seq.id.no.7)和l1r(5’-gttatctagctggcgaaagggg-3’，seq.id.no.8)，以转化子为模板进行菌落pcr扩增后，取1μl产物进行电泳检测，扩增出716bp大小的转化子为阳性转化子。对pcr产物进行电泳检测后将阳性转化子进行测序确保无碱基突变。pcr反应液组成(20μl体系)：

8.提取序列完全正确的转化子质粒dna。

9.农杆菌感受态的制备：配制10％(w/v)的甘油，常规灭菌后置于4℃冰箱保存待用。在含利福平50μg/ml的lb培养基平板上划线活化根癌农杆菌菌株agl1，置于28℃培养，2天后长出单菌落，用无菌接种环将单菌落接种至含有5mllb液体培养基(利福平终浓度为50μg/ml)的50ml离心管中，28℃、200rpm振荡培养2天。按1％的比例转接至无菌三角瓶中，置于28℃、200rpm振荡培养4-6h至od6000.4-0.5左右，冰上冷却10min使细胞停止生长后，于4℃、4000rpm离心收集菌体，用预冷的10％甘油轻轻地重新悬浮菌体，冰上放置5min后，4℃、4000rpm再次离心，弃上清，重复甘油悬浮、离心一次，最后用1-2ml预冷的10％甘油轻轻地重新悬浮菌体沉淀，分装至无菌1.5mlep管中，每管50μl，置于-80℃保存备用。

10.电脉冲法转化根癌农杆菌：将上述甘油法制得的根癌农杆菌感受态细胞在冰上融化后，加入1-2μl质粒dna，将加好dna的农杆菌用微量移液器的吸头轻混匀后加入到无菌脉冲杯中，将脉冲杯置于电脉冲仪上，电脉冲仪设定为2.5kv，电击5ms后迅速将1ml的soc培养基加入脉冲杯中，混匀，转入2ml的无菌离心管中，置于28℃、200rpm摇床培养1小时后，涂布到含有75μg/ml壮观霉素和50μg/ml利福平的lb选择性培养基平板上，置于28℃恒温培养箱倒置培养2天。

11.阳性农杆菌转化子的筛选：采用引物对l1f(5’-gcatgacgttatttatgaggtggg-3’)和l1r(5’-gttatctagctggcgaaagggg-3’)，以农杆菌转化子为模板进行pcr扩增后，取3μl产物进行电泳检测，扩增出716bp大小的转化子为阳性转化子。pcr反应液组成与第7步相同。

12.农杆菌的诱导培养

基本培养基(minimalmedia，mm)：2.05gk2hp04，1.45gkh2p04，0.5gnh4n03，0.01gcacl2，2gglucose，0.3g(nh4)s04，0.001gfes04，5mlz-buffer(每种成分各0.01％znso4·7h2o，cuso4·5h2o，h3bo3，mnso4·h2o和na2moo4·2h2o)，加双蒸水定容至1000ml，ph6.7-7.0。

诱导培养基(inducemedia，im)：7.808gmes(2-(n-吗啡啉)乙磺酸)，1gglucose，1.45gkh2po4，0.5gnh4no3，0.01gcacl2，0.6gmgso4·7h2o，0.3gnacl，0.5g(nh4)so4，5mlz-buffer，调ph值到5.6，双蒸水定容至1000ml。固体im培养基则加入2％的琼脂。高温灭菌后备用。

将活化后的携带双元载体pls-hcas9-mfa2的根瘤农杆菌agl1接种到含有75μg/ml壮观霉素和50μg/ml利福平的mm培养基中，28℃、200rpm培养至od600为0.8-1.2。用im培养基将培养物稀释至od600为0.15，加入200μm的as，于28℃、200rpm且避光的条件下继续培养至od600为0.5左右即可用于共培养。

13.甘蔗鞭黑粉菌的准备

yeps培养基：酵母提取物10g，蛋白胨20g，蔗糖20g，双蒸水定容至1000ml，固体yeps培养基则加入2％的琼脂，高温灭菌后备用。将甘蔗鞭黑粉菌野生型单倍体菌株从-80℃冰箱中取出，在yeps平板上划线活化，挑取菌体至yeps液体培养基中28℃、200rpm培养过夜，用yeps将培养物稀释至od600为0.15后继续培养10-12h至od600为1.0左右即可用于共培养。

14.根癌农杆菌与甘蔗鞭黑粉菌的共培养

将于im诱导培养至od600为0.5的携带双元载体pls-hcas9-mfa2的agl1菌液与等体积的od600为1.0的甘蔗鞭黑粉菌野生型单倍体菌株培养液混合，将混合好的菌液均匀涂布在预先铺好混合纤维素微孔滤膜(孔径为0.45μm)的im培养基平板(含有200μm的as)上，在28℃下避光共培养48-72h后，将滤膜转移至含300μg/ml头孢噻肟钠和200μg/ml潮霉素的yeps选择性平板上，于28℃倒置培养8-12天以获得转化子。

15.甘蔗鞭黑穗菌阳性转化子的筛选：将滤膜上的转化子转接至含300μg/ml头孢噻肟钠和200μg/ml潮霉素的yeps选择性平板上，于28℃倒置培养1-2天后，挑取能正常生长的转化子进行菌落pcr预处理。

16.向pcr管中加入20μlmithyprepfordna，用无菌枪头挑取适量菌体加入裂解液中并混匀，95℃处理10分钟后，12000rpm离心3分钟。

17.取上步上清2μl作为pcr模板。分别用3对引物进行扩增：

1)mfa2c1f(5’-tgcctgaattgctccgcttgtc-3’，seq.id.no.9)和mfa2c1r(5’-tggctctgtttctcacgagatcacg-3’，seq.id.no.10)，

2)hygr01(5’-tgtatggagcagcagacgcgctac-3’，seq.id.no.11)和mfa2c1r(5’-tggctctgtttctcacgagatcacg-3’)，

3)hygr01和mfa2c1f(5’-tgcctgaattgctccgcttgtc-3’)。

对pcr产物进行电泳检测。筛选第一轮无法扩增同时第二轮扩增出大小约为1000bp的转化子，或第一轮无法扩增同时第3轮扩增出大小约为100bp的转化子。

pcr反应液组成(20μl体系)：

18.将扩增出的1000bp的片段进行测序鉴定后则确定目标基因敲除成功。

19.u6启动子驱动的携带hph基因靶标的sgrna的获得：以psgrna-ssu6(seq.id.no.19)质粒为模板，在一个反应中使用4种引物：u-f(5’-ctccgttttacctgtggaatcg-3’，seq.id.no.1)和gr-r(5’-cggaggaaaattccatccac-3’，seq.id.no.2)各0.2μm，ssu6thph-(5’-tccgagagctgcatcaggtcgagggtaaaatctgattgtatg-3’，seq.id.no.35)和grthph+(5’-acctgatgcagctctcggagttttagagctagaaatag-3’，seq.id.no.36)各0.1μm。用高保真dna聚合酶扩增，扩增程序与第1步相同。

20.将上步pcr产物稀释10倍后取2微升为模板，使用引物对：ngu-fsbamhiin(5’-cgactctagaggatcccttaagcggaatgatctacaaagcgttcttc-3’，seq.id.no.37)和nggr-rbamhiin(5’-aatcactaggggatccattccatccactccaagctcttg-3’，seq.id.no.38)，用高保真dna聚合酶进行pcr扩增，pcr扩增程序与pcr反应液组成与第2步相同。

21.采用胶回收试剂盒对第20步pcr产物进行胶回收纯化。

22.采用限制性内切酶bamhi酶切双元载体pngr，采用片段纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收。酶切反应液组成(100μl体系)如下：

23.采用in-fusion方法对回收的hph-sgrna表达盒片段与纯化的线性双元载体pngr进行连接，反应体系如下：

5×in-fusion1μl

回收hph-sgrna表达盒片段3μl

纯化的线性pngr载体1μl

50℃反应30分钟，立即置于冰上。

24.反应产物转化dh5α感受态细胞：具体实验步骤与第6步相同。

25.通过菌落pcr对转化子进行筛选。采用引物对n1f(5’-cacatacaaatggacgaacgg-3’，seq.id.no.39)和n1r(5’-ctagatctcgctgtttcttcggtc-3’，seq.id.no.40)，以转化子为模板进行菌落pcr扩增后，取1μl产物进行电泳检测，扩增出974bp大小的转化子为阳性转化子。对pcr产物进行电泳检测后将阳性转化子进行测序确保无碱基突变。pcr反应液组成第7步相同

26.提取序列完全正确的转化子质粒dna即为真菌基因定点插入突变的近原位互补载体pngr-com(seq.id.no.33)。

27.互补片段的获得：以甘蔗鞭黑穗菌野生型菌株jg35基因组为模板，分别以两对引物cmfa2f(5’-gctagcccattgggcacaccag-3’)和newmfa2r(5’-ttgcacacaggcagcaacagtttcgaagatgaacatggtgaattggtaaag-3’，seq.id.no.41)，newmfa2f(5’-gaaactgttgctgcctgtgtgcaagccattgtttctgttaacgagc-3’，seq.id.no.42)和cmfa2r(5’-ttaggccacggtgcagtagactg-3’，seq.id.no.28)扩增30个循环：94℃10s，58℃15s，68℃20s。对两个目的片段进行胶回收后，将两个回收片段进行融合pcr反应，扩增15个循环：94℃30s，58℃30s，68℃30s。所得产物中的mfa2基因cds中的13bp至36bp的序列由5’-gagactgttgctgcctccgtccag-3’更换为5’-gaaactgttgctgcctgtgtgcaa-3’，但氨基酸序列并未改变，防止被敲除mfa2基因时插入到基因组中的mfa2靶标序列识别。

28.将上步pcr产物稀释10倍后取2微升为模板，使用引物对：cmfa2pstifin(5’-ctaagcttgcatgcctgcaggctagcccattgggcacaccag-3’，seq.id.no.23)和cmfa2pstirin(5’-cctctagagtcgacctgcagttaggccacggtgcagtagactgc-3’，seq.id.no.24)，用高保真dna聚合酶进行pcr扩增，pcr扩增程序：98℃预变性2min，98℃变性10sec，60℃退火15sec，72℃延伸20sec，进行30个循环；最后72℃延伸5min。电泳检测与第2步相同。pcr反应液组成与第7步相同。

29.采用胶回收试剂盒对第28步pcr产物即互补片段(seq.id.no.34)进行胶回收纯化。

30.采用限制性内切酶psti酶切双元载体pngr-com，采用片段纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收。酶切反应液组成(100μl体系)如下：

31.采用in-fusion方法将互补片段与纯化的线性双元载体pngr-com进行连接，构建pngr-com-mfa2反应体系如下：

5×in-fusion1μl

回收互补片段1μl

纯化pngr-com载体3μl

50℃反应30分钟，立即置于冰上。

32.反应产物转化dh5α感受态细胞：具体实验步骤与第6步相同。

33.通过菌落pcr对转化子进行筛选。采用引物对cmfa2pstifin(5’-ctaagcttgcatgcctgcaggctagcccattgggcacaccag-3’)和cmfa2pstirin(5’-cctctagagtcgacctgcagttaggccacggtgcagtagactgc-3’)，以转化子为模板进行pcr扩增后，取1μl产物进行电泳检测，扩增出944bp大小的转化子为阳性转化子。对pcr产物进行电泳检测后将阳性转化子进行测序确保无碱基突变。pcr反应液组成与第7步相同。

34.提取序列完全正确的转化子质粒dna。

35.电脉冲法转化根癌农杆菌：具体实验步骤与第10步相同。

36.阳性农杆菌转化子的筛选：采用引物对cmfa2pstifin(5’-ctaagcttgcatgcctgcaggctagcccattgggcacaccag-3’)和cmfa2pstirin(5’-cctctagagtcgacctgcagttaggccacggtgcagtagactgc-3’)，以农杆菌转化子为模板进行pcr扩增后，取3μl产物进行电泳检测，扩增出944bp大小的转化子为阳性转化子。pcr反应液组成pcr反应液组成与第11步相同。

37.农杆菌的诱导培养：将活化后的携带双元载体pngrs-com-mfa2的根瘤农杆菌agl1接种到含有75μl/ml壮观霉素和50μg/ml利福平的mm培养基中，28℃、200rpm培养至od600为0.8-1.2。用im培养基将培养物稀释至od600为0.15，加入200μm的as，于28℃、200rpm且避光的条件下继续培养至od600为0.5左右即可用于共培养。

38.甘蔗鞭黑粉菌δmfa2的准备：将由根癌农杆菌和crispr-cas9介导的基因定点插入失活方法获得的甘蔗鞭黑穗菌mfa2基因插入突变株甘蔗鞭黑粉菌菌株δmfa2从-80℃冰箱中取出，在yeps平板上划线活化，挑取菌体至yeps液体培养基中28℃、200rpm培养过夜，用yeps将培养物稀释至od600为0.15后继续培养10-12h至od600为1.0左右即可用于共培养。

39.根癌农杆菌与甘蔗鞭黑粉菌的共培养：将于im诱导培养至od600为0.5的携带双元载体pngrs-com-mfa2的agl1菌液与等体积的od600为1.0的δmfa2担孢子培养液混合，将混合好的菌液均匀涂布在预先铺好混合纤维素微孔滤膜(孔径为0.45μm)的im培养基平板(含有200μm的as)上，在28℃下避光共培养48-72h后，将滤膜转移至含300μg/ml头孢噻肟钠和60μg/ml诺尔丝菌素的yeps选择性平板上，于28℃倒置培养8-12天以获得转化子。

40.甘蔗鞭黑穗菌互补阳性转化子的筛选：将滤膜上的转化子同时转接至含300μg/ml头孢噻肟钠和60μg/ml诺尔丝菌素的yeps选择性平板上以及转接至含300μg/ml头孢噻肟钠和200μg/ml潮霉素的yeps选择性平板上，于28℃倒置培养1-2天后，挑取在含诺尔丝菌素的yeps选择性平板上能正常生长而不能在含潮霉素的yeps选择性平板上正常生长的转化子进行菌落pcr预处理。

41.向pcr管中加入20μlmithyprepfordna，用无菌枪头挑取适量菌体加入裂解液中并混匀，95℃处理10分钟后，12000rpm离心3分钟。

42.取上步上清2μl作为pcr模板。pcr反应液体系与第17步相同，分别用6对引物进行扩增，

1)hphf(5’-atgaaaaagcctgaactcaccgcg-3’，seq.id.no.25)和hph1-r

(5’-ggtcaagaccaatgcggagc-3’，seq.id.no.26)，

2)cmfa2f(5’-gctagcccattgggcacaccag-3’，seq.id.no.27)和cmfa2r

(5’-ttaggccacggtgcagtagactg-3’，seq.id.no.28)，

3)gpdf(5’-gattagatcttgctgat-3’，seq.id.no.29)和cmfa2r，

4)natr01(5’-cggactcccggacgttcgtc-3’，seq.id.no.30)和hph1-r

(5’-ggtcaagaccaatgcggagc-3’)，

5)gpdf(5’-gattagatcttgctgat-3’)和natr01(5’-cggactcccggacgttcgtc-3’)，

6)cmfa2rcmfa2r(5’-ttaggccacggtgcagtagactg-3’)和hph1-r

(5’-ggtcaagaccaatgcggagc-3’)：

对pcr产物进行电泳检测。筛选第1对引物无法扩增同时第2对引物扩增出大小为924bp片段且第3、4对引物扩增出大小为1686bp和1676bp片段的转化子，或第1对引物无法扩增同时第2对引物扩增出大小为924bp片段且第5、6对引物扩增出大小为1624bp和1738bp片段的转化子。

二、试验结果

如图1至图11。其中，

图3a为psgrna-ssu6质粒构建，使用引物sspu6fin(5’-atcggcagcaaaggatacgatcgtcccgacgatgctc-3’，seq.id.no.12)和sspu6rin(5’-tcttcagaggtctctcgagggtaaaatctgattgtatgag-3’，seq.id.no.13)扩增sspu6，使用引物psgrna-f(5’-agagacctctgaagataacatac，seq.id.no.14)和psgrna-r(5’-tcctttgctgccgattccacag-3’，seq.id.no.15)扩增psgrnavector。

图3b为pls-hcas-mfa2质粒构建，使用引物u-f(5’-ctccgttttacctgtggaatcg)、gr-r(5’-cggaggaaaattccatccac)、ssu6tmfa2-(5’-ggacggaggcagcaacagtcgagggtaaaatctgattgtatg)和grtmfa2+(5’-actgttgctgcctccgtccgttttagagctagaaat)扩增sspu6-mfa2-sgrna。

图4显示，pls-hcas9与基因mfa2(seq.id.no.21)靶标序列的sgrna表达盒连接后构建成pls-hcas9-mfa2双元载体，该双元载体转化甘蔗鞭黑穗菌后，在菌株体内表达cas9核酸酶，并由sgrna引导cas9核酸酶在与靶标序列互补的dna上切割双链dna，双元载体中的t-dna片段则插入该dna缺口，并通过非同源末端连接进行修复。最终导致t-dna片段插入mfa2基因中造成mfa2基因功能的缺失。

图5显示，双元载体中的t-dna片段可以正向或反向两种方式插入基因组中，均可以造成目标基因失活。在转化完成后需对转化子进行鉴定。通过裂解液处理转化子后，离心取上清作为模板可直接进行pcr验证。未发生外源片段插入的转化子和野生型菌株可由mfa2c1f(5’-tgcctgaattgctccgcttgtc-3’，seq.id.no.31)和mfa2c1r(5’-tggctctgtttctcacgagatcacg-3’，seq.id.no.32)为引物扩增出1168bp大小片段，而发生外源片段定点插入的转化子则无法扩增；外源片段正向定点插入的转化子可由引物hygr01(5’-tgtatggagcagcagacgcgctac-3’)和mfa2c1r(5’-tggctctgtttctcacgagatcacg-3’)扩增约1000bp大小片段，可由引物casr01(5’-ggataccgaccttccgcttcttc-3’，seq.id.no.16)和mfa2c1f(5’-tgcctgaattgctccgcttgtc-3’)扩增约1000bp大小片段，而未发生外源片段定点插入的转化子和野生型菌株则无法扩增；外源片段反向定点插入的转化子可由引物hygr01(5’-tgtatggagcagcagacgcgctac-3’)和mfa2c1f(5’-tgcctgaattgctccgcttgtc-3’)扩增约1000bp大小片段，可由引物casr01(5’-ggataccgaccttccgcttcttc-3’)和mfa2c1r(5’-tggctctgtttctcacgagatcacg-3’)扩增约1000bp大小片段，而未发生外源片段定点插入的转化子和野生型菌株则无法扩增。

图6为农杆菌介导的crispr-cas9定点插入失活甘蔗鞭黑穗菌mfa2基因结果图，a)部分转化子丧失与异性菌株g36配合的能力；b)野生型甘蔗鞭黑穗菌jg35菌株呈酵母状；c)野生型甘蔗鞭黑穗菌菌株jg35与jg36在培养基上配合可形成白色绒毛状菌落。由甘蔗鞭黑穗菌mfa2基因编码的信息素与甘蔗鞭黑穗菌的有性配合密切相关，破坏甘蔗鞭黑穗菌mfa2基因后，突变体δmfa2不能与野生型jg36菌株配合，不能形成白色绒毛状菌落。

图7转化子的pcr验证中，a)以转化子基因组dna为模板，引物mfa2c1f(5’-tgcctgaattgctccgcttgtc-3’)和hygro1(5’-tgtatggagcagcagacgcgctac-3’)扩增，外源片段正向插入的转化子扩增出约1kb大小的片段，野生型菌株jg35和外源片段反向插入的转化子则无法扩增出该条带。b)以转化子基因组dna为模板，引物mfa2c1r(5’-tggctctgtttctcacgagatcacg-3’)和hygr01(5’-tgtatggagcagcagacgcgctac-3’)扩增，外源片段反向插入的转化子扩增出约1kb大小的片段，野生型菌株jg35和外源片段正向插入的转化子则无法扩增出该条带。

图8显示，经pcr产物测序比对，a)在δmfa2转化子中，t-dna片段插入到mfa2基因的特异靶标位点。b)在δprf转化子中，t-dna片段插入到prf基因的特异靶标位点。c)在δg827转化子中，t-dna片段插入到g827基因的特异靶标位点。

图10显示，pngr-com与由碱基修改过的mfa2及其启动子序列组成的互补片段连接后构建成pngr-com-mfa2双元载体，该双元载体转化由根癌农杆菌和crispr-cas9介导的基因定点插入失活方法获得的δmfa2后，在菌株体内表达cas9核酸酶，并由sgrna引导cas9核酸酶在与潮霉素靶标序列互补的dna上切割双链dna，互补双元载体中的携带有互补dna片段的t-dna则插入该dna缺口，并通过非同源末端连接进行修复。最终导致互补dna片段插入潮霉素抗性基因hph中造成hph基因功能的缺失以及mfa2基因的互补。

图11显示，互补双元载体中的t-dna片段可以正向或反向两种方式插入缺失突变体基因组中，均可以造成hph基因失活及mfa2基因的互补。在转化完成后需对转化子进行鉴定。通过裂解液处理转化子后，离心取上清作为模板可直接进行pcr验证。δmfa2菌株可由hphf(5’-atgaaaaagcctgaactcaccgcg-3’)和hph1-r(5’-ggtcaagaccaatgcggagc-3’)为引物扩增出817bp大小片段，而发生外源片段定点互补的转化子则无法扩增，表明如h基因被互补片段插入失活；发生外源片段互补的转化子可由引物cmfa2f(5’-gctagcccattgggcacaccag-3’)和cmfa2r(5’-ttaggccacggtgcagtagactg-3’)扩增出924bp大小片段，而δmfa2则无法扩增，表明互补dna片段插入到缺失突变体基因组中；互补dna片段正向定点互补的转化子可由引物gpdf(5’-gattagatcttgctgat-3’)和cmfa2r(5’-ttaggccacggtgcagtagactg-3’)扩增1686bp大小片段，可由引物natr01(5’-cggactcccggacgttcgtc-3’)和hph1-r(5’-ggtcaagaccaatgcggagc-3’)扩增1676bp大小片段，而δmfa2则无法扩增；互补dna片段反向定点插入的转化子可由引物gpdf(5’-gattagatcttgctgat-3’)和natr01(5’-cggactcccggacgttcgtc-3’)扩增1624bp大小片段，可由引物cmfa2r(5’-ttaggccacggtgcagtagactg-3’)和hph1-r(5’-ggtcaagaccaatgcggagc-3’)扩增1738bp大小片段，而δmfa2则无法扩增；

图12显示，经pcr产物测序比对，互补dna片段插入到潮霉素抗性基因的特异靶标位点。

图13为农杆菌介导的crispr-cas9定点互补mfa2基因结果图，互补转化子恢复与异性菌株jg36配合的能力，在培养基上配合可形成白色绒毛状菌落。

sequencelisting

<110>广西大学

<120>真菌基因定点插入突变的近原位回补方法

<130>真菌基因定点插入突变的近原位回补方法

<160>42

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctccgttttacctgtggaatcg22

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cggaggaaaattccatccac20

<210>3

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ggacggaggcagcaacagtcgagggtaaaatctgattgtatg42

<210>4

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

actgttgctgcctccgtccgttttagagctagaaat36

<210>5

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ctatgttactagaggatcccggaatgatctacaaagcgttcttc44

<210>6

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

taaccatggtaccaagcttattccatccactccaagctcttg42

<210>7

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gcatgacgttatttatgaggtggg24

<210>8

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

gttatctagctggcgaaagggg22

<210>9

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

tgcctgaattgctccgcttgtc22

<210>10

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

tggctctgtttctcacgagatcacg25

<210>11

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

tgtatggagcagcagacgcgctac24

<210>12

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

atcggcagcaaaggatacgatcgtcccgacgatgctc37

<210>13

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

tcttcagaggtctctcgagggtaaaatctgattgtatgag40

<210>14

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

agagacctctgaagataacatac23

<210>15

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

tcctttgctgccgattccacag22

<210>16

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

ggataccgaccttccgcttcttc23

<210>17

<211>305

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

cggaatgatctacaaagcgttcttctgcaccgaagtgaggcacttgtttgtggcactgaa60

acaggctgaacagcttacagcttcacaggtcaggtctggaaccggagatttttttggcgc120

gcgtctgtgttaggttgttatacctctcttcaaaaggatggaaaaagatgttgtgccggc180

gaatggccaggttattcacgattagcaagcttggcgaatcggaggccaattttcctcagc240

acccttctaagtcgtacaaggttttagacgcatacgtctactcatacaatcagattttac300

cctcg305

<210>18

<211>130

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

gtcggccccgaaaggggcttgacatatgatctaacaaataaacgatacagagaagattag60

cattgtcctcagaatatggatggcaccgttgatcagaagagctgctctctccggagagca120

aatatgtttt130

<210>19

<211>3849

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

ggatccagcgtgggtctcggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtcc60

gttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttcaagagcttggagtggat120

ggaattttcctccgttttacctgtggaatcggcagcaaaggatacgatcgtcccgacgat180

gctcgagaacgggcgcggaggcgggggtattgggtgttgatgaaagttgtggatggtggt240

tgacaagaaacgtgtggagcggcatgaagcgctgctcgaaggatctaaagtgcttgacgg300

cggatgacctgtgaagaggacgaggcaaagggggaaggagcggggaaggcactgtaccgg360

tttgggaggaacgcttgttgttcttgttccggtagccgagggtgatcttagcggagagcc420

aagttagctgtgctgcgctgcttgcaaggccgggcggttccagagacacaatgaattggc480

agtgcggagaagccgatctagctctttgttgttgctagttcagggcggtcggctttgccg540

tgttagcgagagcgttgtcgtcgtgaaaaaaggcggggtcaactcgcttggtgctgtgct600

gtacagtacagtagagtcgggtcagccttgccgcgtgttggtctttgtgaggaagagaga660

aggaatgcgcgcgcggctgaacgtgaaaacggcctaaccggttccaagcaaatttcattt720

ttctactccgcgcaactcctcaccgggcttcgttggttccggaggccgttgccagttgtc780

ccaaggcagctttgagatggccgacatccttcagatgcatcgtgctagaaacttctcagt840

aacaaggcgatcgtgtaatgctgccggaatgatctacaaagcgttcttctgcaccgaagt900

gaggcacttgtttgtggcactgaaacaggctgaacagcttacagcttcacaggtcaggtc960

tggaaccggagatttttttggcgcgcgtctgtgttaggttgttatacctctcttcaaaag1020

gatggaaaaagatgttgtgccggcgaatggccaggttattcacgattagcaagcttggcg1080

aatcggaggccaattttcctcagcacccttctaagtcgtacaaggttttagacgcatacg1140

tctactcatacaatcagattttaccctcgagagacctctgaagataacatactaagcttg1200

gcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaat1260

cgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgat1320

cgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctc1380

cttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctct1440

gatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgg1500

gcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatg1560

tgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgc1620

ctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcactttt1680

cggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtat1740

ccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatg1800

agtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtt1860

tttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacga1920

gtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaa1980

gaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgt2040

attgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggtt2100

gagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgc2160

agtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcgga2220

ggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgat2280

cgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcct2340

gtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcc2400

cggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcg2460

gcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgc2520

ggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacg2580

acggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctca2640

ctgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgattta2700

aaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgacc2760

aaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa2820

ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaacca2880

ccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggta2940

actggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggc3000

caccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttacca3060

gtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagtta3120

ccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggag3180

cgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgctt3240

cccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgc3300

acgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccac3360

ctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaac3420

gccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttc3480

tttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgat3540

accgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagag3600

cgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcac3660

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