一种甘蔗单糖转运蛋白ShHXT2基因及其应用的制作方法

本发明生物
技术领域：
，涉及一种甘蔗单糖转运蛋白shhxt2基因及其应用。
背景技术：
：甘蔗(saccharumofficinaruml.)属于禾本科甘蔗属，甘蔗属又分为9个种，起源于印度及南太平洋岛屿。甘蔗作为热带作物之一，温度限制其分布范围，主要包括：北纬34°-南纬31°，分布在世界上的80多个国家地区。每年甘蔗的种植面积在世界范围内达到1500多万公顷，世界范围内种植甘蔗面积最大、产量最高的国家分别为印度和巴西。在中国也有十几个省市种植甘蔗，主要集中分布在广州、云南、广西、海南及福建等地区。甘蔗的生长周期一般为10-16个月，光饱和点高，碳固定能力强，同时光合速率较高，光照强度大，含糖量非常丰富，是世界上主要的糖料作物，同时也是蔗糖的主要原料，蔗糖占全国食糖的93％(王俊刚，2008)。甘蔗作为主要的制糖作物，其茎秆中要有充足的糖分来满足制糖的生产需求，同时对茎秆中的纤维含量要求较高，相应的非糖物质的含量要低。甘蔗茎秆中的蔗糖等糖分随生长周期的延长而正向增加，成熟时达到最高，随后慢慢下降，收获后甘蔗要尽快送去加工，不易储存。甘蔗是最高产的大田作物之一，同时也是吸收、转化以及储存太阳能效率最高的农作物之一。甘蔗是茎用植物，含有大量的纤维。甘蔗茎秆中含糖量丰富，水分充足，浆汁叫甜，使用后可以为人体提供大量的能量。甘蔗茎秆中的糖分主要有蔗糖、果糖、葡萄糖等，这些食糖很容易被人体消化利用，因此具有较高的营养价值。此外，甘蔗中还发现含有大量的钙、铁、磷、锌等人体必须的微量元素，甘蔗同时还具有清热解毒、暖胃治呕等作用。近年来，甘蔗作为一种新型生物能源(陈子云，2003)，受到人们的广泛关注，尤其是世界石油资源日益枯竭的当下。巴西是首个将甘蔗生产成乙醇并与汽油一定比例混合为汽车燃料的国家。随后在一些生产甘蔗的国家也开始研究，现已达到较高的规模化水平。与其他作物相比较，利用甘蔗生产燃料成本较低。用甘蔗生产出的乙醇不含硫，所以在大气中，二氧化硫的排放量大大减少，同时碳氢化合物的排放量也大大减少，即温室气体的排放量减少，净化空气。迄今为止，在甘蔗的种植技术与栽培管理上存在诸多的问题，这就需要科研工作者在今后的科研实验上努力改善。同时，我国的甘蔗品种较为单一，然而近几年来甘蔗中的一些优良品种的品质逐渐下降、受病虫害影响产量也随之降低，所以培育优质、高产、稳产的新品种迫在眉睫。但是由于甘蔗本身染色体数量较多、遗传复杂，较难在传统常规育种上取得较大改善。基因工程方法也只是改变了碳物质的分配，并没有整体上提高甘蔗糖含量，因此还远不能满足生产生活的需要(赵婷婷，2012)。研究甘蔗体内糖积累和分配机制，找出糖分积累过程中的关键控制点，然后加以改良是实现甘蔗高产、高糖一条重要的途径。将为提高甘蔗品质，实现甘蔗高产、高糖、和高抗的育种目标提供科学参考。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种甘蔗单糖转运蛋白shhxt2及其编码基因和该基因的应用。本发明的另一个目的是提供甘蔗单糖转运蛋白shhxt2基因的克隆方法以及所用到的引物对。本发明的第一个方面是提供一种甘蔗单糖转运蛋白shhxt2基因，其核苷酸序列如seqidno:1所示。本发明的第二个方面是提供一种甘蔗单糖转运蛋白shhxt2，其为本发明第一个方面所述的甘蔗单糖转运蛋白shhxt2基因编码的蛋白质，其核苷酸序列如seqidno:12所示。本发明的第三个方面是提供一种本发明第一个方面所述的甘蔗单糖转运蛋白shhxt2基因的克隆方法，包括以下步骤：(1)从成熟甘蔗的根、茎和/或叶中提取总rna；(2)以总rna为模板进行反转录获得cdna；(3)设计shhxt2基因全长序列扩增引物对，进行pcr扩增，回收pcr产物，其中，shhxt2基因全长序列扩增引物对的核苷酸序列如seqidno:2和seqidno:3所示；(4)pcr产物连接载体，转化，测序，获得shhxt2基因基因片段。本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的甘蔗单糖转运蛋白shhxt2基因在细胞内定位中的应用。本发明的第五个方面是提供如本发明第一个方面所述的甘蔗单糖转运蛋白shhxt2基因在提高植物抗冷胁迫中的应用。本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的甘蔗单糖转运蛋白shhxt2基因在培育高糖高产高抗转基因甘蔗中的应用。本发明的第七个方面是提供一种表达载体，其含有本发明第一个方面所述的甘蔗单糖转运蛋白shhxt2基因。本发明的第八个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如seqidno:2和seqidno:3所示。该引物对可用于shhxt2基因全长序列扩增。本发明的第九个方面是提供另一种引物对，其核苷酸序列如seqidno:4和seqidno:5所示。本发明的第十个方面是提供又一种引物对，其核苷酸序列如seqidno:6和seqidno:7所示。本发明的第十一个方面是提供又一种引物对，其核苷酸序列如seqidno:8和seqidno:9所示。本发明首次从甘蔗中克隆得到shhxt2基因，该基因具有糖转运蛋白的转运功能，能定位于细胞的细胞膜中，能提高植物抗冷胁迫能力，有利于甘蔗等植物在逆条件下生长，为揭示蔗糖转运机制对植物生长发育和品质改良的调节功能，为提高作物产量与改良品质的基因工程研究提供遗传学依据。附图说明图1为甘蔗不同部位的总rna提取电泳图。图2为shhxt2基因cdna全长扩增的电泳图。图3为shhxt2基因全长cdna的orf分析结果。图4为shhxt2氨基酸跨膜区预测结果。图5为sweet1氨基酸亚细胞定位预测结果。图6为shhxt2-gfp酶切电泳图。图7为shhxt2基因在洋葱内表皮中的亚细胞定位，其中，a/e：gfp荧光(488nm蓝光激发)；b/f：白光观察：e/f：转有pshhxt2-gfp载体表皮细胞；a/b：转有pcambia1302空载体表皮细胞。图8为p413-phxt7-shhxt2酶切电泳图。图9为p413-phxt7-shhxt2酶切电泳图。图10为酵母突变体eby.vw果糖吸收功能互补实验结果。图11为甘蔗不同组织shhxt2基因相对表达量。图12为冷胁迫下shhxt2基因相对表达量。图13为甘蔗不同病叶中shhxt2基因的相对表达量转基因烟草shhxt2基因的pcr检测结果。图14为pcbi-shhxt2酶切电泳图。图15为抗性植株shhxt2的pcr检测结果。图16为冷胁迫处理转基因烟草下shhxt2基因相对表达量。图17为转化幼苗的ppt筛选及炼苗。图18为shhxt2转化植株bar基因检测pcr结果。图19为shhxt2转化植株bar基因试纸条检测结果。图20为shhxt2过表达抗性植株pcr检测结果。具体实施方式下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆(molecularcloning:alaboratorymanual,3rded.)或酵母遗传法实验指南(methodsinyeastgenetics:acoldspringharborlaboratorycoursemanual，adamsaetal编，coldspringharborlaboratory,1998出版)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。1实验材料1.1植物材料实验中所有用到的甘蔗植物的材料为roc22的甘蔗品种，种植于中国热科院生物所海口区和中国热科院生物所临高试验基地。本实验所用到的甘蔗roc22组培苗和烟草苗都由本实验室提供。1.2菌株和载体escherichiacoil.dh5α购买于广州富能公司。pmd19t-simple、pmd19-t购买于takara公司；pcambia3300-gus植物表达载体、pcambia1302gfp载体、eha105根瘤农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)都保存在本实验室。1.3药品试剂试剂公司实时荧光定量试剂盒takara反转录试剂盒takarala-taq酶、限制性内切酶takarat-4连接酶fermentas胶纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒axgen植物rna提取试剂盒omega1.4主要仪器设备仪器型号pcr扩增仪biometra常温离心机hettichd-78532恒温摇床、恒温水浴锅n.jg-27ekiso实时荧光定量pcr仪stratagenemx3005p凝胶成像系统bio-rad电泳仪labneteq27051.5培养基的配制lb培养基(500ml)：酵母2.5g，氯化钠5g，胰蛋白胨5g，ph约7.0，agar琼脂粉6g，121℃，23min，高压灭菌。yep培养基(500ml)：酵母5g，氯化钠2.5g，胰蛋白胨5g，，在固体培养基100ml中加1.4g琼脂粉，121℃，23min，高压灭菌。mr用于甘蔗遗传转化的液体培养基(500ml)：ms其他成分，1/10ms大量元素，2,4-d0.5mg，葡萄糖5mmol/l，蔗糖15g，ph5.7。甘蔗诱导愈伤培养基m1(500ml)：ms，蔗糖15g，2.4-d0.5mg，agar琼脂粉4g,，ph5.7。甘蔗分化培养基m2(500ml)：ms，6-ba0.5mg，蔗糖15g，kt0.25mg，agar琼脂粉4.2g，ph5.7。甘蔗生根诱导培养基(500ml)：ms，蔗糖12.5g，naa1mg，agar琼脂粉4.2g，活性炭0.1g。2实验方法和实验结果2.1甘蔗shhxt2基因的克隆2.1.1甘蔗根、茎、叶总rna的提取按invitrogenreagent试剂盒说明书的方法进行：(1)取甘蔗不同组织其中包括根、茎、叶各约0.1g左右，剪小块，立即加入液氮，研磨成粉。(2)将上述磨好的样品放入新的1.5ml无酶离心管中，加入800ultrizol溶液，迅速晃动十几下，做好标记。(3)常温条件下静置4-6min，加入280μl氯仿。反复颠倒离心管，重复十几次，静置12min，4℃低温，离心15-18min，12000g。(4)吸出500ul左右的上清，置于新无酶的1.5ml离心管中。加入500μl提前预冷的异丙醇，混匀，-20℃静止8-10min，4℃低温，离心15-20min，12000g。(5)弃上清。加入75％乙醇800ul，温和晃动几下离心管。(6)4℃低温，离心12min，8000g，弃上清，吸出离心管内的液体，吹干，加入45μlrnase-freeh2o，在56-65℃条件下温浴15min。(7)冰上放置，混合放人dnasei5μl，dnaseibuffer5μl，水浴：37℃，28min。(8)55mmedta，10μl，65℃，水浴18min。2.1.2rna完整性及纯度检测在提取出的rna中吸3μl，经1％琼脂糖凝胶电泳跑胶并检测其完整性，结果如图1所示，提取的不同组织的rna条带的完整性高，可适用于cdna的合成。再吸取2μlrna，经核酸蛋白分析仪分析，测定其纯度，剩余rna保存在超低温冰箱备用。2.1.3反转录合成cdna链将以下组分依次加入到无酶离心管中:rna9.5μlprimeroligo(dt)2.5μlddh2o7.0μl65℃，静置5min，立即至冰上1-3min。cdna链合成的反应液：10×buffer2.0μlrnaseinhibitor1.5μl0.01mdntp2.0μlrevertaidm-mulv1.0μtotalvolume20.0μl在上述cdna链反应液中加入上述提取的rna以及引物，混合均匀，温育1h，42℃。65℃，10min，静止。反转录合成的cdna保存备用。2.1.4shhxt2基因的克隆通过ncbi公布的同源物种设计特异性引物克隆出甘蔗单糖转运蛋白基因shhxt2，设计引物如下：pcr扩增体系如下：扩增程序：94℃5min；94℃90s，63℃90s，72℃90s，33个循环；72℃12min。2.1.5pcr扩增产物凝胶电泳将扩增得到的pcr产物，吸出2μl，并加上10×loadingbuffer约1μl，混匀后经1％琼脂糖凝胶电泳检测。135v，电泳，18min，若条带单一，变进行纯化。电压95v，电泳35min，然后在凝胶成像系统中拍照记录，并切下疑似目的条带的凝胶。凝胶电泳结果如图2所示，得到一条1900bp左右的条带，与预测条带大小一致，将其回收，连接转化，并送公司测序后得到1969bp长度的序列。2.1.6扩增片段凝胶回收目的条带的回收参照凝胶回收试剂盒说明书进行。2.1.7目的条带与t载体连接反应目的条带与pmd19-t载体连接体系如下：16℃，2-4h。(8)连接载体转化及测序(1)连接产物轻轻放入70μl大肠感受态细胞(escherichiacoli.dh5α)中，慢慢混匀，冰浴25-30min。(2)42℃，热激70-90s，再冰上放置90-180s。(3)加入800μllb液体培养基，混匀，恒温培养箱37℃，200rpm，震荡60min。(4)11000rpm，离心15s，倒出多余上清，约留200ul，枪头吹打沉淀，混匀，在lb(100μg/mlamp)培养基上均匀涂板，在恒温培养箱里，37℃，倒置培养12～16h，直至形成单菌落。(5)待长板后，挑取多个单菌落，放在含有amp抗性的lb液体培养基的离心管中，在恒温培养箱中，37℃，振荡培养2-5h。(6)将摇起后的菌液分装保存。(7)从上述菌液中吸出1μl，当作模板，pcr扩增，若pcr产物大小一致，便送去公司测序。测序结果表明：克隆获得片段大小为954bp。2.2甘蔗shhxt2基因生物信息学分析通过ncbi上对shhxt2的氨基酸序列进行blastp搜索，比对发现，它与hxt基因家族同源。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html对shhxt2基因cdna的序列开放阅读框orf的分析发现，具有完整orf，长度为1623bp，从44位起始密码子atg到1666位gta终止密码子止，编码540个氨基酸，如图3。利用protparam软件进行在线预测，其编码的蛋白质的相对分子量为56.64kda，理论等电点pi为9.16，不稳定系数是37.33，说明是稳定蛋白。总平均疏水指数为0.583，表明该蛋白为疏水性蛋白。tmhmmserverv.2.0在线软件将shhxt2的氨基酸序列进行跨膜结构的预测，发现，如图4，shhxt2蛋白具有12个跨膜区,跨膜区分别位于98-120，140-162，171-189，194-216，228-250，255-277，339-361，376-396，403-425，440-459,471-493，497-519。这与之前报道真核生物的单糖转运蛋白的跨膜结构一致。根据softberrry亚细胞定位软件分析发现shhxt2可能位于质膜上，如图5，推测其可能是一种质膜蛋白。2.3shhxt2基因在洋葱内表皮中的亚细胞定位(1)gfp融合载体的构建a.对shhxt2基因序列分析，找到完整orf并在其两端设计带酶切位点的引物，下游引物去掉终止密码子，如下所示：sh2gf：5′ggccatggatgcgctgatacgctgtaacg3′ncoish2gr：5′ggactagcctttctgctacagttcgttca3′speib.以shhxt2-pmd19-t质粒为模板，引物(sh2gf，sh2gr)进行pcr扩增，扩增体系及程序如下：反应程序为：94℃5min，94℃70s，62℃90s，72℃3min，33个循环，72℃12min。将pcr扩增的产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，其大小与目的条带一致，纯化连接到pmd19t-simple载体，转到大肠杆菌，在含有氨苄青霉素抗性的lb固体培养基过夜培养，挑取单菌落，分别以同样的引物进行菌落pcr扩增验证，挑取阳性单克隆，送测序公司测序。c.提取测序正确shhxt1-pmd19t-simple和shhxt2-pmd19t-simple的单克隆质粒，以及含pcambia1302载体的菌株的质粒。参照试剂盒上的说明书提取质粒。d.用限制性内切酶spei，ncoi对质粒shhxt2-pmd19t-simple和pcambia1302进行双酶切，酶切体系如下：e.然后1％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示回收shhxt2-pmd19t小片段和pcambia1302大片段，用t4dnaligase连接，转化进入感受态dh5α，重组质粒经酶切验证，送公司测序验证，结果正确，获得shhxt2-gfp融合载体。酶切体系如下：(2)农杆菌感受态的制备a.取出保存在-80℃超低温冰箱的eha105农杆菌菌株，放置在冰上解冻后，用接种环在含有二抗(10mg/mlstr+20mg/mlrif)的yep固体培养基上用接种环划线，28℃，2d，倒置培养。b.长出单克隆后，挑取单菌落，接种于含有三抗(10mg/mlstr+20mg/mlrif+10mg/mlkan)yep液体培养基中，28℃，振荡培养，约12～25h，直菌液变浑浊。c.取上述菌液接种到含二抗的yep液体培养基中，28℃，210rmp/h，培养5～8h，od值达0.5～0.55。d.摇到想要的浓度后放置在打离心管中，冰上静置25-30min。e.4℃，4500xg，低温离心3-5min，收集菌体。f.弃上清，取提前预的冷50mmol/lcacl2，20ml，重悬菌体。g.重复e。h.弃上清，吸取50mmcacl21ml，重悬菌液，然后分装到1.5ml离心管中，液氮迅速冷冻，超低温冰箱保存，待用。(3)表达载体的转化取出保存在超低温冰箱中的农杆菌感受态细胞，立即放在冰上，待溶解；溶解后，加入少量质粒，均匀混合，冰浴18min，液氮放置3-5min；37℃，解冻5min，加入yep液体培养基(不含抗生素)800μl，28℃，230rmp，2-3h；8000rmp离心30s，倒出多余培养基，将剩余的150μl的菌液均匀放在含有三抗的yep固体培养基平板上，28℃，36-48h，倒置培养；挑取单菌落，放在yep含有三抗的液体培养基上，28℃，230rmp，36～48h；菌液pcr鉴定，提取质粒，酶切验证。(4)农杆菌介导转染洋葱表皮细胞挑取固体培养基平板上的重组质粒shhxt2-gfp及空载质粒pcambia1302的阳性单克隆，放在含有三抗的液体培养基上，28℃，200rmp，12-16h。吸取上述菌液中的4ml，放到新的含有三抗的yep液体培养基中，培养2-3h。8000rmp，10min，离心，收集菌体，吸取50ml农杆菌侵染液悬浮菌体，重复重悬2次，最后用调od600至0.01。在注射前将洋葱放置在28℃条件下，暗培养2天。注射：用小注射器吸取200ul菌液注入洋葱表皮下，形成一个1cm2的小泡，28℃暗培养72h。用镊子轻轻撕下洋葱内表皮，轻压成片，在荧光显微镜下观察，拍照。使用荧光显微镜，并在紫外光下观察农杆菌侵染的洋葱表皮细胞，观察细胞中gfp情况，如图7，结果显示：a为空载pcambia1302，在细胞的细胞质、细胞核等各个部位都能观察到gfp绿色荧光现象，而e中是转化的shhxt2-gfp融合载体的洋葱细胞，发现在膜上有明显的gfp绿色荧光现象，定位明显，因此推测shhxt2基因编码的蛋白是一种膜蛋白。2.4shhxt2单糖吸收功能鉴定2.4.1酵母表达载体构建(1)分析shhxt2基因序列，找到其完整开放阅读框orf，在orf两端设计引物，加入酶切位点和加保护碱基，如下所示：sh2pf：5′ggggatccatgcgctgatacgctgtaacg3′bamhish2pr：5′gggtcgacctttctgctacagttcgttca3′sali(2)以构建的shhxt2-pmd19-t质粒为模板，进行pcr扩增，扩增体系及程序如下：反应程序为：94℃5min，94℃70s，62℃90s，72℃3min，33个循环，72℃12min。将pcr扩增的产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，其大小与目的条带一致，纯化连接到pmd19t-simple载体，转到大肠杆菌，在含有氨苄青霉素抗性的lb固体培养基过夜培养，挑取单菌落，分别以同样的引物进行菌落pcr扩增验证，挑取阳性单克隆，送测序公司测序。(3)提取测序正确shhxt2-pmd19t-simple的单克隆质粒，以及含p413-phxt7载体的菌株的质粒。参照试剂盒上的说明书提取质粒。(4)用限制性内切酶bamhi、sali对质粒shhxt2-pmd19t-simple和p413-phxt7进行双酶切，酶切体系如下：(6)回收酶切产物中的shhxt2-pmd19t小片段和p413-phxt7大片段，t4连接酶连接转化到大肠杆菌dh5α，重组质粒经酶切验证，如图8所示。送公司测序验证，结果正确，获得p413-phxt7-shhxt1/shhxt2融合载体。酶切鉴定体系如下：2.4.2酵母突变菌株eby.vw4000感受态的制备及转化(1)复苏酵母突变菌株eby.vw4000：取10μl用甘油保存菌液加入5mlypd培养基中，30℃，250rpm，摇过夜。(2)将复苏菌液在ypd固体平板上划线，30℃，培养24h。(3)挑取一个单克隆接种于5mlypd液体培养基中，30℃，250rpm，摇16～18h。(4)转移3ml至含有50mlypd液体培养基的锥形瓶中，30℃，230rpm，培养2～4h。(5)将菌液转入50ml离心管，室温5000rpm，离心5min。弃上清，倒置于灭菌滤纸上流出残留培养液。(6)加8ml灭菌水，充分重悬沉淀，转入15ml离心管中，7000rpm离心5min，弃上清。(7)加250μl1×te/liac,充分重悬沉淀，得到酵母感受态细胞。(8)分别在两个1.5ml离心管中加入0.5～1μgp413-shhxt2质粒和p413空质粒，再加入5μl(100mg/ml)鲑鱼精dna，混匀，加入50μl酵母感受态细胞，吹打混匀。(9)加入300μl40％peg4000/liac/te，充分混匀，30℃,200rpm，培养0.5h。(10)42℃，热激15min，置于冰上；12000rpm离心15s。(11)弃上清，加入1mlypd液体培养基重悬沉淀；30℃,200rpm，培养1.5h。(12)取150μl菌液涂布于sd/ura3固体选择培养基上，30℃，倒置培养。2.2.4.3转化酵母质粒酶切验证分别挑取p413-phxt7-shhxt2-eby.vw4000以及p413-phxt7-eby.vw4000酵母单克隆，用sc-his(含有麦芽糖)液体培养基摇菌，进行小量酵母质粒提取，所提质粒转化dh5α，再提取大肠杆菌质粒，酶切验证pcr阳性酵母阳性克隆是否包含正确目的质粒，小量酵母质粒提取方法参照tiangen酵母小提质粒试剂盒说明书进行。结果如图9所示，p413-phxt7-shhxt2已转入酵母中。2.4.4shhxt2酵母单糖吸收功能互补实验分别挑p413-phxt7-shhxt2-eby.vw4000以及p413-phxt7-eby.vw4000酵母单克隆，放入含有2％麦芽糖的sc-his液体培养基中，30℃，250rpm，培养24h。测定od600＝1.0，并用无菌水分别稀释10、100倍，充分混匀。吸取4μl接种在含有不同单糖为唯一碳源的选择培养基上，30℃培养2-4d，观测生长状况，以转化的空载体p413-phxt7为阴性对照。选择培养基成分：结果如图10所示，己糖吸收功能缺陷型酵母转入shhxt1和shhxt2基因后可以在以果糖为唯一碳源的培养基上正常生长，而仅转入p413-phxt7空载的酵母却不能在以果糖为唯一碳源的培养基上生长，在以葡萄糖、半乳糖和甘露糖各为唯一碳源的培养基上都不能正常生长。对照组中，在以麦芽糖为唯一碳源的培养基上，这几种酵母转化体可以能正常生长。结果表明，甘蔗的单糖转运蛋白shhxt2在酵母突变体中可以正确表达，并且所表达的蛋白具有果糖跨膜转运活性，从而恢复了酵母突变体对果糖的吸收能力。2.5shhxt2基因的表达量分析2.5.1样品的采集(1)甘蔗不同组织样品的采集待到甘蔗伸长期时，在中国热带农业科学院热带生物技术研究所临高甘蔗试验基地中取样。秤取新鲜的甘蔗组织，包括：根、未成熟叶、未成熟茎、成熟叶、成熟茎。秤取样品时，选取同一时期、生长相似的健壮甘蔗植株9株，每3株为一个重复，混合取样。分别收集未成熟叶、成熟叶、未成熟茎、成熟茎。未成熟叶为甘蔗未抽出心叶；成熟叶为甘蔗植株由上及下完全展开且可见肥厚带的+3叶。未成熟茎为植株上部茎顶端生长点以下第二节；成熟茎为甘蔗植株由下及上第3或4节。根为挖取植株后成熟根。(2)甘蔗组培苗冷胁迫处理将实验所需要的甘蔗组培苗植株接种在ms培养基中，28℃，16h/8h(光照/黑暗)，3000lx，预培养20d，选取叶龄相同且长势一致的甘蔗组培苗转入ms液体培养基，28℃，16h/8h(光照/黑暗)，3000lx，培养48h。低温4℃，16h/8h(光照/黑暗)，3000lx，胁迫处理。冷胁迫0h，6h，12h，24h，36h，48h，72h后进行取样，每次取样9株植株，3株为一个重复混合取样，3次重复。每次取样完成后立即放入液氮中保存。(3)甘蔗病叶的采集采集的样品种植在中国热带农业科学院热带生物技术研究所临高甘蔗试验基地。在甘蔗大田中观察甘蔗发病情况，采集感染甘蔗褐条病、甘蔗赤腐病和甘蔗黑穗病的，且处于发病中期的甘蔗植株叶片，分别采集甘蔗褐条病病叶、甘蔗赤腐病病叶、甘蔗黑穗病病叶；采样时每种病害分别选取典型且单一发病的发病中期植株，每个植株选取一片发病叶片，共选取9片，每3片一个重复，3次重复。以未发病的甘蔗健康植株叶片为对照。采集完叶片，立即放入液氮中保存。2.5.2rt-qpcr扩增及数据分析参照reagent说明书提取rna的方法提取甘蔗的不同组织、冷处理不同时间、不同病叶的甘蔗幼苗rna后，反转录成cdna，模板浓度均一化。在实时荧光定量pcr仪(mx3000p)上，进行荧光定量pcr，检测shhxt2在不同组织及不同处理下的相对表达量的变化。引物：sh2f1:5′-tcgttaagaagatgatac-3′sh2r1:5′-tagtttcatgtagtttg-3′甘蔗的内参引物(gapdh)(引自iskandaretal.,2004)：gf：5′cacggccactggaagca3′gr：5′tcctcagggttcctgatgcc3′pcr扩增体系：pcr反应体系：94℃2min30s；94℃17s，58℃90s，72℃20s，34个循环。每个模板重复3次，减少实验误差。2.5.3检测结果荧光定量real-timepcr检测甘蔗不同组织shshxt2表达量变化，如图11。结果表明：shshxt2在甘蔗的不同组织中表达量存在差异，shshxt2在不同组织中都表达，表达量也相对高。在叶中的表达量高于茎中，未成熟组织中表达量远远高于成熟组织中。在未成熟叶，表达量达到最高。shshxt2在不同组织里面的相对表达量为：未成熟叶>成熟叶>未成熟茎>成熟茎>根。由此说明shshxt2在未成熟组织中表达量高。荧光定量real-timepcr检测甘蔗幼苗冷胁迫诱导后，shhxt2基因的表达量变化，如图12。在0-72h内，shhxt2表达量随处理时间的增加而增高。6h时，shhxt2被诱导，之后的72h内表达量稳步增加。这表明，甘蔗在受到冷胁迫时，shhxt2基因上调来抵抗冷胁迫。分析该类基因可能参与输送糖类物质，调节体内渗透压，维持甘蔗各组织在非生物胁迫下的正常生长。荧光定量real-timepcr检测到甘蔗不同的病叶中shhxt2基因的表达量的变化，如图13。shhxt2基因在甘蔗赤腐病、甘蔗褐条病及甘蔗黑穗病的病叶中相对表达量都高于健康叶，在甘蔗褐条病病叶中的相对表达量最高，相当于健康叶片的5.5.倍；甘蔗褐条病次之，相当于健康叶片的3.5倍，在甘蔗黑穗病中表达量最低。这表明，当病原菌侵入叶片时，可能激活和诱导shhxt2基因在叶肉细胞膜上表达，输送更多的糖分泌到叶肉细胞间隙，为病原微生物的侵入和繁殖提供一个良好的环境。2.6shhxt2基因遗传转化烟草2.6.1构建shhxt2的植物表达载体(1)分析shhxt2基因序列，找到其完整开放阅读框orf，并在orf两端设计引物，加上酶切位点和加保护碱基，如下所示：sh2f2：5′ggggatcgatacatcgctcgctgtaacg3′bamhish2r2：5′gggagctctcactgctttaacacgttcccgt3′saci(2)构建的shhxt2-pmd19-t质粒为模板，进行pcr扩增，扩增体系及程序如下：(3)反应程序为：94℃4min30d，94℃90s，62℃1min30s，72℃1min30s，36个循环，72℃12min。pcr扩增的产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，大小与目的条带一致，纯化连接到pmd19t-simple载体，转到大肠杆菌，在含有氨苄青霉素抗性的lb固体培养基过夜培养，挑取单菌落，分别以同样的引物进行菌落pcr扩增验证，挑取阳性单克隆，送测序公司测序。载体正确命名为pcbi-shhxt2。(4)提取测序正确的pcbi-shhxt2的单克隆和含pcambia3300-gus载体的菌株质粒。(5)用限制性内切酶bamhi，saci对质粒pmd-shhxt2和pcambia3300-gus进行双酶切，酶切体系如下：(6)回收酶切产物中shhxt2-19t小片段和pcambia3300-gus大片段，t4连接酶转化到dh5α，重组质粒酶切验证，结果如图14所示。送公司测序，结果正确，获得pcbi-shhxt2植物表达载体。酶切验证体系如下：2.6.2烟草外植体培养用90％的酒精浸泡普通烟草(nicotiamtabacum)种子15s，再用提前高温灭菌的镊子将浸泡的种子移至40％次氯酸钠溶液(加一滴tween-20)中，不停的搅动，约20min，用无菌水漂洗，重复几次后放置在灭过菌的滤纸上吹干种子，带吹干后，放置在ms固体的培养基上，每皿大约放15粒种子，28℃，光培养。每隔一周更换一次培养基，直至成到3-5片叶子出来。2.6.3遗传转化烟草(1)蘸取保存在超低温冰箱的eha105菌种，在yep固体培养基(10mg/mlstr+20mg/mlrif+50mg/mlkan)中划线，28℃条件下倒置培养16-24h。挑单克隆，放入三抗的yep液体的培养基中，28℃，12-16h，培养，200rpm。(2)从上述菌液里面吸出5ml再次放到含三抗yep液体的培养基中，od600达到0.4～0.6。将液体倒入50ml大的离心管，4℃，4700rpm，10min离心，弃上清，用枪头吸出残余液，加入mr液体培养基100ml，重悬菌体，220rpm，28℃振荡培养2h，即可获得农杆菌转化侵染液。(3)浸染：选取长势新鲜的烟草嫩叶，将叶子用提前灭菌的打孔器打成直径5mm的叶盘，放到提前配好的侵染液中，每个基因大约50片左右，完成后放在摇床上，摇3min左右，80rpm。然后真空抽10min。再在室温下静置5-l0min后，放到超净台中倒出叶片，在无菌滤纸上吹干。放在ms固体培养基，28℃，暗培养2-3d。(4)黑暗培养后，将其放到ms分化培养基(含1mg/l6-ba)上培养，每四天更换一次培养基，直至分化出幼苗。(5)待长出的分化苗后，将其放置在ms固体培养基，进行培养。(6)培养几周好将苗移至含有筛选标记的(2mg/lppt)ms固体培养基中，每隔几天更换一次培养基，直至筛选出抗性苗。(7)将筛选出来的抗性幼苗从培养箱拿出来，放在室温条件下，炼苗几天，待适应后种到小盆中。2.6.4转基因烟草植株的分子检测(1)分别提取野生型以及转基因烟草叶片的dna：参照张计育等设计的提取烟草总dna的ctab法(张计育等,2011)。(2)转基因植株烟草的pcr检测对转基因烟草和野生型叶片rna的提取和反转录。对所获得转基因烟草进行目的基因的pcr检测，检测以sh2f/sh2r为引物。正对照为连到pcambia3300上质粒，负对照为ddh2o及野生型烟草，以初筛得到9株抗性苗提取的叶片总dna当做模板进行pcr扩增，结果表明：在所得到的转基因抗性苗中，转shhxt2烟草中9株可以得到到与正对照条带大小一致的目的片段，野生型烟草和假阳性苗都未扩增到目的条带(图15)。将扩增到的条带纯化、测序，证明是目的基因的序列，这说明该目的基因整合到烟草基因组中。(3)冷胁迫处理转基因烟草选取叶龄相同且长势一致的转基因烟草的一个株系小苗转入ms固体培养基中28℃，16h/8h(光照/黑暗)，光照强度3000lx，恢复培养两天，然后放入4℃，16h/8h(光照/黑暗)，光照强度为3000lx条件下进行冷胁迫。冷胁迫0d，5d，10d，15d，20d后进行取样，每次取样9株植株，3株为一个重复混合取样，3次重复。每次取样完成后立即放入液氮中保存。结果如图16所示：在0-20d内，shhxt2随处理时间的增加表达量也持续增高，5d时，shhxt2表达量开始增加，到20d时表达量达到最高，这表明，转shhxt2基因的烟草幼苗遇冷胁迫时，诱导shhxt2基因上调来抵抗冷胁迫，由此分析该基因可能参与输送糖分，调节体内渗透压，维持转基因烟草在冷胁迫下的正常生长。2.7shhxt2基因遗传转化甘蔗(1)转基因甘蔗的获得选择生长良好的茎尖生长点分生组织，切小放在m1培养基上，培养25d左右，直至形成疏松的薄片组织，其分裂能力较强，选为受体进行转化。放在含有pcbi-shhxt2表达载体的农杆菌里侵染，然后暗培养几天，移至m2选择培养基上筛选，待到愈伤周围长处小苗。小苗长出1-2cm后，移至含有ppt抗性的培养基上进行初步筛选，期间不断更换培养基，并减掉老苗及变黄的苗，直至获得10株抗性植株。待到筛选出来的抗性植株在培养基中生长良好、根系较多时移至水晶泥中，炼苗几天后移至盆中，如图17。(2)转基因植株bar基因的检测提取的转基因甘蔗叶片dna为模板，植物表达载体pcambia3300-gus上携带的抗除草剂基因(bar)设计引物bf/br，正对照为pcbi-shhxt2质粒，负对照为非转基因甘蔗叶片dna，进行pcr扩增，结果表明：在所筛选出来的转基因抗性苗中，都能扩增到与正对照一致的条带，都约为400bp左右的特异性条带(图18)。扩增得到的条带纯化、测序，证明是bar基因序列，这说明bar基因已整合到甘蔗基因组中。按envirologixquickstixtmkitfor(bar)cotton试剂盒说明书上的步骤进行，检测转基因甘蔗中的bar基因编码的蛋白，结果表明：筛选得到的转shhxt2甘蔗叶片都能够检测到bar基因的表达(图19)，这与bar基因pcr检测结果一致，更进一步说明bar基因已整合到甘蔗基因组中。(3)shhxt2过表达抗性植株pcr检测以ubi启动子序列设计上游引物和基因区设计下游引物分别设计shhxt2过表达抗性植株目的基因检测引物，通过对ppt筛选过的抗性植株进行pcr扩增，结果如图20，表明：在所得到的转基因抗性苗中，转shhxt2甘蔗中有10株可以扩增到与正对照条带一致的目的片段。其中非转基因甘蔗及假阳性植株都未扩增到相应的目的片段。扩增得到的条带纯化、测序，证明是目的基因的序列，这说明shhxt2基因已整合到甘蔗基因组中。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。sequencelisting<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所<120>一种甘蔗单糖转运蛋白shhxt2基因及其应用<130>123456<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>1969<212>dna<213>artificial<220><223>shhxt2基因<400>1gtgatgtgcgatcgcaggaacagtcgtcaccatcgttaagaagatgatacgctgcgctgt60aacgggcggcgggtgcgtcgcttcgtggagcggcgatcggaggtcgccggcggtcaaccc120ttgcagcgtgcggatgccgacgggcaacggtggtgggtggtgcggtggcctgaggtcgcg180ggcggcggatctcgccggcctcgagatggccagcctgcgcggcgtcgtcggggggctctt240ccgcgcgagcccacgctatgggcgcttgcaagccacggccgcagttgaccctgaagatat300tccattggagaaggttcaagttaaatcctcaggacatgttctgccatatgttggcgttgc360ttgtttgggggctattctgtttggttatcatcttggcgtggtcaatggcgcgcttgaata420tctcgcgaaggatcttgggattgctgaaaatgctgtcttgcagggatgggtggttagcac480atccctggctggtgcaacactaggttcttttaccgggggatctttggcagataaatttgg540gcggacaagaacattcatcctggatgcagtcccacttgctctaggtgcattcttgagcgc600aacagctcaagatatccgcaccatgattattggtcggttgcttgctggaattggtattgg660gatctcatctgctcttgtacccctttacatatctgagacctcaccaactgaaattcgtgg720aacacttggttctgttaatcaactttttatctgcattggaattcttgcggctttgttagc780tggattgcctttggcaggaaatcctgcctggtggaggacaatgtttggaattgctgtagt840tccatccgttttgctggctgtaggaatggccttttcgcctgaaagccctcgttggctatt900ccagcaaggaaaggtcattcaagcagaatcagctgtaaaaagactgtatggaaaagaaat960ggttaccgaaattatgtatgatctgagagctagtggccaaagttcttctgagcccgaagc1020tgtctggtttgatcttttcagcaagcgttactggaaagttgtgagtgtgggggcagcact1080gtttttgttccagcagcttgctggtataaatgccgttgtatattactctacatcggtgtt1140ccgcagtgcaggcattgcatctgatgttgctgctagtgctcttgttggagcagccaatgt1200tttcggcaccatgatcgcatcttctctaatggacaagcaaggaaggaaaagccttctgat1260gacaagcttttctggagtgggtgcttcaatgctactcctagcattgtccttcacctggaa1320agctctggcaccttattctggtactcttgctgttgttggcactgttctgtatgtgctgtc1380ttttgctctaggtgctggtcctgttcctgccctgcttcttcctgaaatatttgcctctag1440aataagggcaaaggctgttgcattatctctaggcatgcactgggtatccaacttctttat1500tggcctgtacttcttgagtgtcgtcaacaagttcgggatcagcaatgtatatttgggatt1560cgcaccagtgtgcgcccttgcagttctttacatagctgggaatgtggtcgagaccaaggg1620gcgatcacttgaagaaattgaacgggaactaagtgtagcagaatgatgtgctgttgctag1680tcatgctgcggcgccgttttggtgattgagaatgcaaccaagcacacagccgagcatcct1740tggagctagagactcttctagtttcatgtagtttcagaaataagcgaacggcaagagtgc1800caatcgtaggtgacctggtgtgtgcagtgaggggttgtgttcgagcagtagtttagctgt1860gcctcccctacccccctgtcatcaatcagaattcagaaacaatgaacccgtcgatgtttc1920tggagataaatttttcgttttttgttctcaaatttcgtcgcttctcgtg1969<210>2<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>2f<400>2cttgacaaattagccatgata21<210>3<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>2r<400>3tgttttgcattgcatacta19<210>4<211>29<212>dna<213>artificial<220><223>sh2gf<400>4ggccatggatgcgctgatacgctgtaacg29<210>5<211>29<212>dna<213>artificial<220><223>sh2gr<400>5ggactagcctttctgctacagttcgttca29<210>6<211>29<212>dna<213>artificial<220><223>sh2pf<400>6ggggatccatgcgctgatacgctgtaacg29<210>7<211>29<212>dna<213>artificial<220><223>sh2pr<400>7gggtcgacctttctgctacagttcgttca29<210>8<211>18<212>dna<213>artificial<220><223>sh2f1<400>8tcgttaagaagatgatac18<210>9<211>17<212>dna<213>artificial<220><223>sh2r1<400>9tagtttcatgtagtttg17<210>10<211>28<212>dna<213>artificial<220><223>sh2f2<400>10ggggatcgatacatcgctcgctgtaacg28<210>11<211>31<212>dna<213>artificial<220><223>sh2r2<400>11gggagctctcactgctttaacacgttcccgt31<210>12<211>4821<212>prt<213>artificial<220><223>shhxt2蛋白<400>12metileargcysalavalthrglyglyglycysvalalasertrpser151015glyaspargargserproalavalasnprocysservalargmetpro202530thrglyasnglyglyglytrpcysglyglyleuargserargalaala354045aspleualaglyleuglumetalaserleuargglyvalvalglygly505560leupheargalaserproargtyrglyargleuglnalathralaala65707580valaspprogluaspileproleuglulysvalglnvallysserser859095glyhisvalleuprotyrvalglyvalalacysleuglyalaileleu100105110pheglytyrhisleuglyvalvalasnglyalaleuglutyrleuala115120125lysaspleuglyilealagluasnalavalleuglnglytrpvalval130135140serthrserleualaglyalathrleuglyserphethrglyglyser145150155160leualaasplyspheglyargthrargthrpheileleuaspalaval165170175proleualaleuglyalapheleuseralathralaglnaspilearg180185190thrmetileileglyargleuleualaglyileglyileglyileser195200205seralaleuvalproleutyrilesergluthrserprothrgluile210215220argglythrleuglyservalasnglnleupheilecysileglyile225230235240leualaalaleuleualaglyleuproleualaglyasnproalatrp245250255trpargthrmetpheglyilealavalvalproservalleuleuala260265270valglymetalapheserprogluserproargtrpleupheglngln275280285glylysvalileglnalagluseralavallysargleutyrglylys290295300glumetvalthrgluilemettyraspleuargalaserglyglnser305310315320sersergluproglualavaltrppheaspleupheserlysargtyr325330335trplysvalvalservalglyalaalaleupheleupheglnglnleu340345350alaglyileasnalavalvaltyrtyrserthrservalpheargser355360365alaglyilealaseraspvalalaalaseralaleuvalglyalaala370375380asnvalpheglythrmetilealaserserleumetasplysglngly385390395400arglysserleuleumetthrserpheserglyvalglyalasermet405410415leuleuleualaleuserphethrtrplysalaleualaprotyrser420425430glythrleualavalvalglythrvalleutyrvalleuserpheala435440445leuglyalaglyprovalproalaleuleuleuprogluilepheala450455460serargileargalalysalavalalaleuserleuglymethistrp465470475480valserasnphepheileglyleutyrpheleuservalvalasnlys485490495pheglyileserasnvaltyrleuglyphealaprovalcysalaleu500505510alavalleutyrilealaglyasnvalvalgluthrlysglyargser515520525leuglugluilegluarggluleuservalalaglu530535540当前第1页12