一种绿盲蝽细胞核激素受体E75、其编码序列、载体和菌株的制作方法

本发明涉及农业科学技术领域，具体涉及一种绿盲蝽细胞核激素受体e75、其编码序列、载体和菌株。

背景技术：

绿盲蝽apolyguslucorum(hemiptera:miridae)属半翅目盲蝽科，是棉花、蔬菜、果树、牧草等多种农作物上的重要害虫。近年来，由于转bt基因棉的大面积种植和农业产业结构的调整等原因，绿盲蝽种群数量急剧上升，加之长期依赖化学农药防治，致使绿盲蝽的抗药性日渐增强，目前农业生产上的绿盲蝽防控面临严峻挑战，急待开拓减少化学农药使用的新型无公害防控手段。

类固醇激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone，20e)是昆虫蜕皮激素的主要活性形式，在昆虫的变态发育过程中起着重要的调控作用。细胞核激素受体e75是蜕皮激素的作用靶标，是昆虫体内重要的调控蛋白，目前已成为新型杀虫剂的重要靶标之一。e75隶属于昆虫核受体，一般含有4个模块结构域：a/b域、c域、d域和e域。其中c域及d域相对保守，c域含有2个锌脂结构，e域存在一个配体结合袋。研究绿盲蝽ale75基因结构及获得其重组蛋白，可望为以蜕皮激素受体为靶标的新型杀虫剂提供前期的理论基础。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了用于编码绿盲蝽细胞核激素受体e75的dna序列，如seqidno：1所示。

本发明还要解决的技术问题是提供了绿盲蝽细胞核激素受体e75，其氨基酸序列如seqidno：2所示。

本发明还要解决的技术问题是提供用于含有用于编码绿盲蝽细胞核激素受体e75的dna序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产绿盲蝽细胞核激素受体e75中的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了绿盲蝽细胞核激素受体e75重组蛋白的制备方法。

技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供一种用于编码绿盲蝽细胞核激素受体e75的dna序列，其碱基序列如seqidno：1所示。

本发明内容还包括一种绿盲蝽细胞核激素受体e75，其氨基酸序列如seqidno：2所示。

本发明内容还包括含有用于编码绿盲蝽细胞核激素受体e75的dna序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

其中，上述的重组表达载体，还包括将上述的dna序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达绿盲蝽细胞核激素受体e75的重组表达载体。

其中，上述大肠杆菌表达载体为pczn1。

其中，上述重组菌是将上述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。

其中，上述的大肠杆菌为arcticexpress。

本发明内容还包括将上述的dna序列、重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产绿盲蝽细胞核激素受体e75中的应用。

本发明内容还包括一种绿盲蝽细胞核激素受体e75的制备方法，是培养上述的转基因重组菌得到的绿盲蝽细胞核激素受体e75。

本发明的内容还包括一种绿盲蝽细胞核激素受体e75的制备方法，包括以下步骤：

1)、用于编码绿盲蝽细胞核激素受体e75基因的扩增，所述e75基因序列如seqidno：1所示；

2)、绿盲蝽细胞核激素受体e75基因的原核表达载体构建；

3)、绿盲蝽细胞核激素受体e75的变性和复性；

4)、绿盲蝽细胞核激素受体e75的纯化。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：本发明首次获得了绿盲蝽细胞核激素受体e75基因序列，并构建其pczn1原核表达载体，并在大肠杆菌arcticexpress中经iptg诱导后能产生所述蛋白的包涵体，再经变性、复性可形成所述的蛋白，并加以纯化制得。制得的蛋白分子量约为75kd，蛋白浓度为0.4mg/ml。纯化出的细胞核激素受体e75可为以蜕皮激素受体为靶标的新型杀虫剂提供前期的研究基础。

附图说明

图1绿盲蝽细胞核激素受体e75基因5'和3'端pcr扩增电泳图；泳道1：绿盲蝽细胞核激素受体e75基因5'(a)和3'端(b)pcr片段，泳道2：2000bp的dnamaker；

图2ndel和xbal双酶切t载体电泳图；m：maker；泳道1：酶切前质粒；泳道2：酶切后质粒；

图3pczn1-e75诱导表达的sds-page分析电泳图；m:蛋白质maker；泳道1：未经iptg诱导样本；泳道2：常温诱导样本；泳道3：11℃下iptg诱导上清液；泳道4：11℃下iptg诱导悬浮液；

图4纯化的pczn1-e75蛋白sds-page检测电泳图；泳道1：未纯化的包涵体；泳道2：未与ni柱结合的杂蛋白；泳道3：与ni柱结合的目的蛋白；m：蛋白分子量标准物。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1：绿盲蝽细胞核激素受体e75基因(ale75基因)的获得

采用trizol法提取绿盲蝽总rna，选择电泳图谱良好并且od260/od280值在1.8～2.0之间的总rna样品合并进行mrna的纯化，反转录合成第一链cdna，pcr反应体系为：10μl总rna，4.0μl5x反应缓冲液(sigma公司)，2μl10mmoldntp，1μl核糖核苷酸抑制剂(sigma公司)，2μl反转录酶(sigma公司)，加ddh2o至反应体积为20μl。pcr反应参数为：42℃温浴60min，72℃温浴10min。根据已知其他昆虫的(如papilioxuthus，glossinamorsitans，aedesaegypti)细胞核激素受体e75保守序列设计适用于pcr扩增引物ale75-f(5’-cattatggwgtytayagytgtg-3’)及ale75-r(5’-aghagttcattccavcctgctc-3’)，上述引物为简并引物，获得绿盲蝽细胞核激素受体e75保守序列，该保守序列参见序列表中的seqidno:3，pcr反应体系为：12.5μl2×gcbufferi(sigma公司)，0.5μlale75-f，0.5μlale75-r，4μldntp，6.3μlddh2o，1μlcdna，0.5μltaq酶(sigma公司)；pcr反应参数为：95℃预变性4min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，72℃修复延伸7min，总循环40次；在根据获得的ale75基因的保守序列设计适用于race方法的5′和3′端的扩增引物，5′-e75a-f(5′-gcttgacggttcctcg-3′)，5′-e75a-r(5′-gggcaagtggagctcgac-3′)，3′-e75a-f(5′-atcgtcaacaacactcccagtcctg-3′)，3′-e75a-r(5′-caatccaactctccctgcccctcct-3′)扩增方法具体参见宝生物大连有限公司的cdna末端的快速扩增(race)试剂盒的方法进行扩增，pcr反应参数为：95℃180s变性，94℃30s，60℃12s，72℃600s，72℃继续延伸10min。电泳结果显示pcr扩增分别得到与预期大小2241bp相符的条带。将pcr产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收纯化目的dna，与pgem-teasy载体进行连接，转入大肠杆菌dh5α，挑选单菌落培养，经菌落pcr鉴定为阳性的菌液及序列测定正确的进行下一步载体构建。

结论：绿盲蝽细胞核激素受体e755'和3'端分别得到约400bp(图1a)和800bp(图1b)大小的片段。经回收、测序和拼接，获得绿盲蝽绿盲蝽细胞核激素受体e75的全长序列(图2)。

该全长序列如下：

ccttcatcccttgtgtacatcaatacaccactataaaccacacaccaccttcaccacaaaccaccagaaaaaccggtgatcaccgccaaccccgaaactgccttcaaccgcgaaaactcgattttcacttcagtttcgccgtcgacgaaaattcaccagttttccgccgttgaacgtttcattttgttgccgctgaacgattttgtgcttttttggattttacatcggattgccgtgccgcgaatgtgatgtctccggatggaggtgatttccgggtaccgcaggcgccgccgctggtgtcgagctccacttgcccgccgcccccggcgccgcagatgctcccgcccccgccgccaccgccgcccccacagcacaagcaccggacacagcacgaggaaccgtcaagctccatgcctgatctcgaattcgacgggacgaccgtcctctgcagggtttgtggtgacaaggcctctggattccactatggcgtgcactcctgcgaaggatgcaagggtttcttccggcggagcatccagcagaagatccagtaccgcccgtgcaccaagaaccagcagtgctccatcctgcgaatcaacaggaaccgctgccagtactgcagactcaaaaaatgcatcgcagttggaatgtcccgagacgcggtgagattcggtcgcgttcccaaaagggaaaaggcgaggattttggctgccatgcagcaaagtaccaactcgcggtgccaagaaaaggcgctggcggcagagctcgaagatgatcagaggctgctgcgcacagtcatcagagcgcatctggacacgtgcgattttactcgcgacaaagtcgagcctatgatcatcagagcccgagaacacccttccttcaccgcctcacctcctaccttggcttgcccgctcaatcccaatcctcaaccactgacgggtcagcaagaactccttcaggacttttccaagagattctcccccgccatccgcggcgtcgtcgaattcgccaagcgaatccccggattcagcctcctctcccaagacgaccaggtcaccctcctcaaagccggcgtgttcgaggttctactcgtccgcctcgcttgcatgttcgacacgcaaaacaacagcatgatttgcctcaatggtcaagtcctcaagagggagtccatccacagcggatccaatgccaggtttctcatggactccatgttcgacttcgccgagcgcctcaactccctgaggctcactgacgcagaaatcggcctcttcagctcgatagtcgtcattgcacctgatcggcctggactgagaaacacagagctcattgaaatgatgcagaataaactgagagacggcctccacctcatgattgcccaaaaccaccacaaccaaccgggtttggcgcaagaactgatgaagaagatacccgacctgagaacgttgaacacgctgcatagcgagaaattgcttgcattcaaaatgactgagcagcagcatctgcaagagcaaaaccaccaggcgagcttgggaatgtggagcagtatggttggtgaagacgagagcaaaagccccagtggcacgtcctggtcatccagctccgatgtcgcgatggaagaagttaaaagtccgctgggatcagtctcgagcacggagtccatgtgctcgggcgaagttgagtaccacagcaaccacgccgcttctgcacctcttctggcggccacactagctggaggctgccccatgcgacaccgccagaacatgtgtgatgacagtaaagacatcaaacccatcatcatccacagacatgaaaggacttttaggaagttggattctcccagtgattcggggattgagtctggaacggaaaaacatgaaaagttgacgtgtagtgctccaacgtctgtttgctccagtccgaggtcttcagttgaggataaggatgatagtcaccatatcgaagatatgcccgttttgaaacgagtgctccaagcgccgccattgtacgacacaaattcactgatggatgaagcgtacaaacctcacaagaaattcagagcgttgaggaaagaatgcggagactcggaaagcgacaacacaacaacgacgacatccagcgcctgctcgtctccactcctgtcgtcgtccttgtcgtcgacgcactccaccctcgccaagtccctcatggagagcccgaggatgacgcccgagcagatgaagcgaacggacatcatccacagctacatcatgcgaggggaaggttgctggcagcagcagtccgtcatcacgacgtcctcggcgtctcggggcaacgcctacgtcatcgtcaacaacactcccagtcctggaccatccctctacgtccaatccaactctccctgcccctcctccacctccttcgtcgagctccaagtcggcactcaacccctcaatttgtccaagaaaacgccgcctccttcccccaggccgaaagtcctttcactcgaagcctaacctacaaactaacataataaaccctaaaaatattatgtttaagtacaaactcaacaactgaggcaatgtggtacaaaataaacttgctcttgtgatctctccctcctctgtaaatatatccacctttatctatttgtgtatatagaacctttcttcttctgtagtaactttttttcgtgtattttatcgttaaaaacgaactattctaatggtgccaccctttttgaaccctatattataattgaaaataccaaataatttattataaatccgattttttaattaaaatttgaacaaataagtgtggcgaagaaaaacgcagaagtttcattttttggtaaacttgttactaagtgttttaaaagtcgtaggaccttagcagtgttgtggtgtatcctatctattcttgagaaaaaatattttcatcttacgaatgcgagtcatggccttttgtcagacctcaatccaatttctcgtgttccagttatttttttcgcatctacgtttctcaaaaaaacttatatatctatatttgttctagatatatttgaagaaaaaattatgaatgtgataattcgatatagtggggcttgcattttaaaagaaaacatttttgtgtgtgtacattttagtctcatataaatcaataatgtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

该基因orf框包含2241bp的核苷酸，编码746个氨基酸。

编码的氨基酸序列如下：

mspdggdfrvpqapplvssstcppppapqmlpppppppppqhkhrtqheepsssmpdlefdgttvlcrvcgdkasgfhygvhscegckgffrrsiqqkiqyrpctknqqcsilrinrnrcqycrlkkciavgmsrdavrfgrvpkrekarilaamqqstnsrcqekalaaeleddqrllrtvirahldtcdftrdkvepmiirarehpsftaspptlacplnpnpqpltgqqellqdfskrfspairgvvefakripgfsllsqddqvtllkagvfevllvrlacmfdtqnnsmiclngqvlkresihsgsnarflmdsmfdfaerlnslrltdaeiglfssivviapdrpglrnteliemmqnklrdglhlmiaqnhhnqpglaqelmkkipdlrtlntlhsekllafkmteqqhlqeqnhqaslgmwssmvgedeskspsgtswssssdvameevksplgsvsstesmcsgeveyhsnhaasapllaatlaggcpmrhrqnmcddskdikpiiihrhertfrkldspsdsgiesgtekhekltcsaptsvcssprssvedkddshhiedmpvlkrvlqapplydtnslmdeaykphkkfralrkecgdsesdntttttssacsspllssslssthstlakslmesprmtpeqmkrtdiihsyimrgegcwqqqsvittssasrgnayvivnntpspgpslyvqsnspcpsstsfvelqvgtqplnlskktpppsprpkvlslea*

保守序列：

ccgtcgacgaaaattcaccagttttccgccgttgaacgttccattttgttgccgctgaacgattttgtgtttttttggattttacatcggattgccgtgccgcgaatgtgatgcaagtttcgggaggtgatttccgggtaccgcaggcgccgccgctggtgtcgagctccacttgcccgccgcccccggcgccgcagatgctcccgcccccgccgccaccgccgcccccacagcacaagcaccggacacagcacgaggaaccgtcaagctccatgcctgatctcgaattcgacgggacgaccgtcctctgcagggtttgtggtgacaaggcctctggattccactatggcgtgcactcctgcgaaggatgcaagggtttcttccggcggagcatccagcagaagatccagtaccgcccgtgcaccaagaaccagcagtgctccatcctgcgaatcaacaggaaccgctgccagtactgcagactcaaaaaatgcatcgcagttggaatgtcccgagacgcggtgagattcggtcgcgttcccaaaagggaaaaggcgaggattttggctgccatgcagcaaagtaccaactcgcggtgccaagaaaaggcgctggcggcagagctcgaagatgatcagaggctgctgcgcacagtcatcagagcgcatctggacacgtgcgattttactcgcgacaaagtcgagcctatgatcatcagagcccgagaacacccttccttcaccgcctcacctcctaccttggcttgcccgctcaatcccaatcctcaaccactgacgggtcagcaagaactccttcaggacttttccaagagattctcccccgccatccgcggcgtcgtcgaattcgccaagcgaatccccggattcagcctcctctcccaagacgaccaggtcaccctcctcaaagccggcgtgttcgaggttctactcgtccgcctcgcttgcatgttcgacacgcaaaacaacagcatgatttgcctcaatggtcaagtcctcaagagggagtccatccacagcggatccaatgccaggtttctcatggactccatgttcgacttcgccgagcgcctcaactccctgaggctcactgacgcagaaatcggcctcttcagctcgatagtcgtcattgcacctgatcggcctggactgagaaacacagagctcattgaaatgatgcagaataaactgagagacggcctccacctcatgattgcccaaaaccaccacaaccaaccgggtttggcgcaagaactgatgaagaagatacccgacctgagaacgttgaacacgctgcatagcgagaaattgcttgcattcaaaatgactgagcagcagcatctgcaagagcaaaaccaccaggcgagcttgggaatgtggagcagtatggttggtgaagacgagagcaaaagccccagtggcacgtcctggtcatccagctccgatgtcgcgatggaagaagttaaaagtccgctgggatcagtctcgagcacggagtccatgtgctcgggcgaagttgagtaccacagcaaccacgccgcttctgcacctcttctggcggccacactagctggaggctgccccatgcgacaccgccagaacatgtgtgatgacagtaaagacatcaaacccatcatcatccacagacatgaaaggacttttaggaagttggattctcccagtgattcggggattgagtctggaacggaaaaacatgaaaagttgacgtgtagtgctccaacgtctgtttgctccagtccgaggtcttcagttgaggataaggatgatagtcaccatatcgaagatatgcccgttttgaaacgagtgctccaagcgccgccattgtacgacacaaattcactgatggatgaagcgtacaaacctcacaagaaattcagagcgttgaggaaagaatgcggagactcggaaagcgacaacacaacaacgacgacatccagcgcctgctcgtctccactcctgtcgtcgtccttgtcgtcgacgcactccaccctcgccaagtccctcatggagagcccgaggatgacgcccgagcagatgaagcgaacggacatcatccacagctacatcatgcgaggggaaggttgctggcagcagcagtccgtcatcacgacgtcctcggcgtctcggggcaacgcctacgtcatcgtcaacaacactcccagtcctggaccatccctctacgtccaatccaactctccctgcccctcctccacctccttcgtcgagctccaagtcggcactcaacccctcaatttgtccaagaaaacgccgcctccttcccccaggccgaaagtcctttcactcgaagcctaacctacaaac

实施例2：ale75基因原核表达载体的构建

含有ale75基因t载体的原核表达载体构建方法为：将上述测序正确的片段绿盲蝽绿盲蝽细胞核激素受体e75连入pmd18-t载体的目的基因及pczn1载体均用限制性内切酶ndel及xbal双酶切，进行大片段连接(图2)。酶切体系为：2种限制性内切酶(sigma公司)各0.25μl，10×buffer缓冲液1.0μl，带有合适酶切位点的基因片段3μl，用ddh2o补足至10μl，37℃水浴3h。连接体系为：酶切回收后的载体5.0μl，基因片段10.0μl，t4dna连接酶(sigma公司)1.0μl，10×buffer缓冲液2.0μl，用ddh2o补足至20μl，16℃反应12～16h。连接产物转化大肠杆菌top10后采用pcr筛选阳性克隆。将鉴定正确的重组质粒pczn1-ale75转化到大肠杆菌arcticexpress感受态细胞后涂布到含卡那霉素(50μg/ml)的平板上，37℃，220r/min培养过夜；次日在转化后的平板上挑选单克隆到lb培养基(含50μg/ml卡那霉素、10ml)中，37℃，250r/min培养过夜；次日将菌液按1％的比例接种到lb液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)中，37℃摇床中培养2～3h，在菌液的od600达到0.6～0.8之间时，向剩余培养物加入iptg至终浓度为0.5mm，降低培养温度至11℃，220rpm震摇过夜，诱导融合蛋白的表达。离心少量菌体，分别取上清和沉淀，加适量te溶液(ph8.0)，震荡悬浮后加入等体积的2×sds缓冲液，100℃5min，12％sds-page电泳检测重组ale75的表达情况(图3)。

结论：经11℃，0.5mmiptg诱导后ale75基因在pczn1载体中可高效表达，主要以包涵体形式存在。

实施例3：ale75融合蛋白的变性、复性及蛋白的纯化

按下述步骤进行包涵体蛋白的变性及复性：将菌体沉淀重悬于20ml裂解缓冲液(sigma公司，20mmtris-hclcontaining1mmpmsfandbacteriaproteaseinhibitorcocktail,ph8.0)，超声破碎(功率400w，工作4sec，间歇8sec，共20min)；将超声破碎的细胞裂解液4℃10000g离心20min，收集沉淀；使用包涵体洗涤液(20mmtris，1mmedta，2m尿素，1mnacl，1％tritonx-100，ph8.0)洗涤包涵体3次；用溶解缓冲液(20mmtris，5mmdtt，8m尿素ph8.0)，按一定比例溶解包涵体，4度放置过夜；室温，15000rpm离心15min；将上述溶液滴加20mmtris-hcl100mmnaclbufferph8.0(sigma公司)缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于20mmtris-hcl，100mmnacl，ph8.0溶液中透析过夜。将复性得到的蛋白经超滤浓缩后，溶解于pbs缓冲液(ph7.4)中得到包涵体溶液。

按下述步骤进行ale75蛋白的纯化：利用低压层析系统，包涵体溶液以0.5ml/min流速上样至ni-idabinding-buffer预平衡的ni-ida-sepharosecl-6b亲和层析柱(sigma公司)；用ni-idabinding-buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液od280值到达基线；用ni-idawashing-buffer(20mmtris-hcl，20mm咪唑，0.15mnacl，ph8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液od280值到达基线；用ni-idaelution-buffer(20mmtris-hcl，250mm咪唑，0.15mnacl，ph8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mmtris-hcl，0.10mnacl，ph8.0进行透析过夜；进行12％sds-page分析，用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度(图4)。

结论：经过蛋白变性和复性后，可成功获得ale75蛋白，大小约为75kd，该蛋白浓度为0.4mg/ml。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>江苏省农业科学院

<120>一种绿盲蝽细胞核激素受体e75、其编码序列、载体和菌株

<130>sg20170509001

<160>9

<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>绿盲蝽细胞核激素受体e75

<220>

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