本发明涉及烟用香料技术领域，具体是一种基于生物产香制备无花果香料的方法及其应用。
背景技术：
在烟草制品中，既要保证烟气感官品质，包括香气、浓度、刺激性、杂气、余味等综合指标，又要保证卷烟的低危害性。在烟草中添加天然的功能性烟用香料，能起到降害与补偿香气的作用，也能满足消费者对于天然产品的需求。加料加香技术是提高卷烟产品品质与市场竞争力的重要部分，是构筑卷烟独特口味和风格，实现产品品质差异化的最重要手段之一，是稳定卷烟抽吸品质的重要手段；是卷烟生产关键技术，获得特色加料加香材料，具有非常现实的意义。而烟用天然添加剂通常是植物水提或醇提的粗提物，存在杂气重、刺激性大和口感不适等吸味缺陷。
无花果又名映日果、隐花果和蜜果等，属桑科榕属落叶乔木或灌木果实，皮薄无核，肉质松软，营养丰富。无花果的果实富含葡萄糖、果糖、氨基酸、维生素和矿质元素等。无花果香料能改善卷烟吸味、减轻刺激性和丰满烟气，赋予卷烟一种独特的香味,并且能与卷烟香味谐调,其在卷烟加料中的应用相当广泛。
但由于无花果浸膏含有多糖大分子，因此在卷烟中存在刺激性大的负面效果。本发明人在实现本发明的过程中经过研究发现：产香菌植生拉乌尔菌(raoultellaplanticolavp4-4)是能将糖或者乙醇氧化成乙酸等酸香物质的一类细菌，其能消耗糖类大分子，消除这些大分子物质对卷烟的负面影响，同时转化部分物质生成香兰素以及其他香味物质，而产生的香味物质可以在卷烟中起到增加清香香韵和飘逸感的作用，能协调和增强“黄鹤楼”品牌卷烟的风格特征。
现有技术中，以产香菌植生拉乌尔菌发酵无花果粗提液，转化、降解多糖等大分子物质，生成小分子致香物质或香味前体物，丰富香气，减少无花果香料刺激性成分，提高香气品质；在卷烟中应用，与烟气协调，降低烟气刺激性，具有奶香、果甜香等香气，能丰富烟香，改善烟香品质，突出黄鹤楼品牌卷烟的风格特征，克服无花果香料在卷烟中应用有刺激性大、杂气重、余味不净的缺陷，尚未见报道。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供一种基于生物产香技术制备无花果香料的方法及其应用，采用产香菌植生拉乌尔菌(raoultellaplanticolavp4-4)发酵转化无花果水提液，降解、转化无花果粗提液中的多糖等大分子物质为小分子致香物质或香味前体物，提高香料品质；应用于卷烟中，可有效改善烟香品质，具有奶香、果甜香等香气，能丰富烟香，突出黄鹤楼品牌卷烟的风格特征，克服无花果香料在卷烟中应用刺激性大、杂气重、余味不净的缺陷。
本发明提供一种基于生物产香制备无花果香料的方法，包括以下步骤：
(1)无花果粗提液的制备：将无花果与水按重量比1:20～50混合均匀，90～100℃回流提取1～3次，每次3～5小时，抽滤，合并滤液，得到无花果提取液；
(2)菌种活化：将植生拉乌尔菌(raoultellaplanticolavp4-4)接种到固体斜面培养基上，在28～40℃，静置培养24～96h后得到活化菌种，置于4℃冰箱中；
所述的植生拉乌尔菌(raoultellaplanticolavp4-4)，保藏号为cctccm2012005，于2012年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；
(3)制备种子培养液：将步骤2)所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在28～40℃、100～150r/min条件下振荡培养24～96h，连续转接1～3次，制得种子培养液；
(4)无花果提取液的微生物发酵：将上述步骤(3)的种子培养液，按体积比15～30％接种到上述步骤1)的无花果提取液中，接种后的滤液的装罐量为40～70％，ph5～7，28～40℃，搅拌速度100～120r/min，避光条件下发酵1～6天，得到无花果发酵液；
(5)醇沉纯化：将步骤4)的无花果发酵液浓缩至相对密度1.1～1.3，与95％乙醇按质量比1:3～5混合，静置过夜，4000～10000r/min离心5～20min，取上清液，55～65℃减压浓缩至相对密度为1.0～1.2的无花果浸膏，即为基于生物产香技术制备的无花果香料。
进一步的，所述的斜面培养基组成为：黄豆汁125ml，木糖20g/l，琼脂15g/l。
进一步的，所述的种子培养基组成为：木糖45g/l，酵母粉8g/l，氯化钠4g/l。
本发明提供一种基于上述生物产香方法制备的无花果香料。
本发明还提供一种基于生物产香方法制备的无花果香料在卷烟烟丝中的应用，所述无花果香料作为天然烟用添加剂加入卷烟烟丝中，添加量为烟丝质量的百万分之1～3，与烟气协调，具有奶香、果甜香等香气，能丰富烟香，改善烟香品质，突出黄鹤楼品牌卷烟的风格特征，克服无花果香料在卷烟中应用刺激性大、杂气重、余味不净的缺陷。
本发明的有益效果：本发明先将无花果进行水溶液回流提取有效成分，再以无花果提取液为底物，经产香菌植生拉乌尔菌((raoultellaplanticolavp4-4))发酵，降解、转化无花果提取液中的大分子物质，生成小分子致香物质和香味前体物质，减少刺激性成分，具有奶香、果甜香等丰富香气，提高香气品质；在卷烟中应用，与烟气协调，降低烟气刺激性，具有奶香、果甜香等香气，能丰富烟香，有回甜感，改善烟香品质，增强黄鹤楼品牌卷烟的风格特征，克服无花果香料在卷烟中应用刺激性大、杂气重、余味不净的缺陷。
本发明工艺条件温和，产品收率高，且所用的植物原料具有天然环保无害、营养丰富等优点，克服了无花果香料在卷烟中应用刺激较大、杂气较重的缺陷，生产工艺条件温和，具有工业应用转化前景。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解，此部分所描述的具体实施例仅可用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种基于生物产香技术制备无花果香料的方法，包括以下步骤：
(1)无花果提取液的制备：将无花果与水按重量比1:25混合均匀，92℃回流提取3次，每次3小时，抽滤，合并滤液，得到无花果提取液；
(2)菌种活化：将植生拉乌尔菌(raoultellaplanticolavp4-4)接种到固体斜面培养基上，在28℃，静置培养32h后得到活化菌种，置于4℃冰箱中；
(3)制备种子培养液：将步骤2)所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在30℃、100r/min条件下振荡培养30h，连续转接2次，制得种子培养液；
(4)无花果提取液的微生物发酵：将上述步骤(3)的种子培养液，按体积比12.5％接种到上述步骤1)的无花果提取液中，接种后的滤液的装罐量为45％，ph5.5，30℃，搅拌速度100r/min，避光条件下发酵1.5天，得到无花果发酵液；
(5)醇沉纯化：将步骤4)的无花果发酵液浓缩至相对密度1.15，与95％乙醇按质量比1:3混合均匀，静置过夜，5000r/min离心15min，取上清液，60℃减压浓缩至相对密度为1.13的无花果浸膏，即为生物产香制备的无花果香料。
所述的斜面培养基组成为：黄豆汁125ml，木糖20g/l，琼脂15g/l。
所述的种子培养基组成为：木糖45g/l，酵母粉8g/l，氯化钠4g/l。
实施例2
一种基于生物产香制备无花果香料的方法，包括以下步骤：
(1)无花果提取液的制备：将无花果与水按重量比1:30混合均匀，95℃回流提取2次，每次4小时，抽滤，合并滤液，得到无花果提取液；
(2)菌种活化：将植生拉乌尔菌(raoultellaplanticolavp4-4)接种到固体斜面培养基上，在32℃，静置培养48h后得到活化菌种，置于4℃冰箱中；
(3)制备种子培养液：将步骤2)所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在32℃、110r/min条件下振荡培养36h，连续转接3次，制得种子培养液；
(4)无花果提取液的微生物发酵：将上述步骤(3)的种子培养液，按体积比18％接种到上述步骤1)的无花果提取液中，接种后的滤液的装罐量为55％，ph6，32℃，搅拌速度110r/min，避光条件下发酵2.5天，得到无花果发酵液；
(5)醇沉纯化：将步骤4)的无花果发酵液浓缩至相对密度1.14，与95％乙醇按质量比1:4混合均匀，静置过夜，6000r/min离心10min，取上清液，65℃减压浓缩至相对密度为1.16的无花果浸膏，即为生物产香制备的无花果香料。
所述的斜面培养基组成为：黄豆汁125ml，木糖20g/l，琼脂15g/l。
所述的种子培养基组成为：木糖45g/l，酵母粉8g/l，氯化钠4g/l。
实施例3一种基于生物产香制备无花果香料的方法，包括以下步骤：
(1)无花果提取液的制备：将无花果与水按重量比1:45混合均匀，96℃回流提取1次，5小时，抽滤，合并滤液，得到无花果提取液；
(2)菌种活化：将植生拉乌尔菌(raoultellaplanticolavp4-4)接种到固体斜面培养基上，在38℃，静置培养72h后得到活化菌种，置于4℃冰箱中；
(3)制备种子培养液：将步骤2)所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在38℃、120r/min条件下振荡培养72h，连续转接2次，制得种子培养液；
(4)无花果提取液的微生物发酵：将上述步骤(3)的种子培养液，按体积比22％接种到上述步骤1)的无花果提取液中，接种后的滤液的装罐量为50％，ph7，38℃，搅拌速度120r/min，避光条件下发酵4.2天，得到无花果发酵液；
(5)醇沉纯化：将步骤4)的无花果发酵液浓缩至相对密度1.18，与95％乙醇按质量比1:5混合均匀，静置过夜，8000r/min离心6min，取上清液，70℃减压浓缩至相对密度为1.312的无花果浸膏，即为生物产香制备的无花果香料。
所述的斜面培养基组成为：黄豆汁125ml，木糖20g/l，琼脂15g/l。
所述的种子培养基组成为：木糖45g/l，酵母粉8g/l，氯化钠4g/l。
试验例1感官评价
将实施例1-3基于生物产香技术制备的无花果香料按烟丝质量比的百万分之1、百万分之2、百万分之3分别添加到某中档卷烟品牌配方烟丝中，烟丝装入密封袋，放置在烘箱中80℃恒温30min，至含水量合适，卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内(22℃+1、相对湿度为60％+2％)平衡48h，请专家评吸小组评吸。
经评吸小组反复评吸，感官评价结果如表1，表明：本发明的生物产香制备的无花果香料，在添加量百万分之1～3时，与烟气协调，具有奶香、果甜香等香气，能丰富烟香，能降低烟气刺激性，余味较好，烟气柔和，增加喉部舒适性，明显改善了无花果提取液使烟气刺激变大、有杂气的吸味缺陷。
表1.基于生物产香技术制备的无花果香料的感官评价
试验例2挥发性成分气相质谱对比检测分析
采用gc/ms对基于生物产香技术制备的无花果香料与无花果粗提物(以下简称对照)进行挥发性香气成分gc/ms对比分析。
(1)同时蒸馏萃取
将5g生物产香技术制备的无花果香料或其对照装入圆底烧瓶中，加入400ml水，用电热套加热至沸腾，另一侧的圆底烧瓶中加入200ml的二氯甲烷，60℃水浴沸腾，待中间分液管处液面出现分层后计时萃取4h。萃取结束后，向二氯甲烷萃取液中加入无水硫酸钠，过夜，过滤并浓缩至1ml，浓缩液用于进行gc/ms分析。
(2)gc/ms分析：hp-5ms(50m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；进样温度：250℃；分流比25:1；载气：he，1ml/min；升温程序：从50℃(1min)以5℃/min升到250℃(5min)；传输线温度：250℃；离子源：ei源；电子能量：70ev；扫描范围：50～550amu；使用wiley和minilab谱库进行检索。
(3)挥发性香气成分对比分析
通过gc/ms对本发明的生物产香技术制备的无花果香料进行香气成分分析，从表1可以看出，(1)无花果提取物共鉴定出34种挥发性成分，包括酯类11种、酸类4种、醛类2种、烯类2种及其他烷烃类、醇类、酮类等；而本发明的基于生物产香技术制备的无花果香料共鉴定出52种挥发性成分，包括酯类15种、酸类8种、醇类7种、酮类4种、烯类5种及吡唑、呋喃、噻唑等。挥发性香气成分增多，更丰富。(2)基于生物产香技术制备的无花果香料新增挥发性成分36种，其中3-羟基-2-丁酮的相对百分含量为48.6891％，具有强烈的奶油、脂肪、白脱样香气，高度稀释后有令人愉快的奶香气，4-甲基-2-戊酮，有令人愉快的酮样香味，3-羟基丁酸乙酯呈果香、葡萄香、青香和白酒似香气，苯甲醇具有微弱的芳香味，甲酸辛酯具有清甜的水果香气，苯乙醇具有柔和、愉快而持久的玫瑰香气，灵猫酮在极度稀释时有强烈的愉快的麝香香气，(3)与对照相比，挥发性成分相对百分含量增加的有肉豆蔻酸，增加了30倍，从0.1101％到3.3854％，肉豆蔻酸有柔和烟气作用，与烟香谐调，提高甜而醇和的风味，棕榈酸乙酯相对量升高了8倍，从0.3730％到2.6269％，呈微弱蜡香、果爵和奶油香气；(4)与对照相比，挥发性香气成分相对百分含量减少或消失的有糠醛、乙苯、苯乙醛、大马酮、2，4-二叔丁基酚、十五烷酸、棕榈酸、邻苯二甲酸二异丁酯、亚油酸、邻苯二甲酸单乙基己基酯、2,2'-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)等，其中棕榈酸有增加烟气甜味、蜡味、丰满度的作用，但同时会带来粗糙感和刺激性，其他如邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯等大分子物质的消失，降低了在烟气中的刺激性。综合来看，可能是由于产香菌对无花果提取液的转化、分解、氧化等作用，使得一些大分子物质分解成小分子致香成分或香味前体物，甚至彻底降解转化，所得到的基于生物产香技术制备的无花果香料，大分子杂质减少，与烟气协调，具有浓郁奶香、果甜香等香气，能丰富烟香，能降低烟气刺激性，余味较好，烟气柔和，增加喉部舒适性，明显改善了无花果提取液使烟气刺激变大、有杂气的吸味缺陷。
表1.基于生物产香技术制备的无花果香料与对照的挥发性成分gc/ms对比分析
表1中内标为丙酸苯乙酯；“/”表示未检出。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。