本发明属于生物技术领域，涉及人体体液中微小核糖核酸在早期乳腺癌中早期筛查及精准用药检测方法。
背景技术：
微小核糖核酸
本文所述的发明是基于以下观察：某些微小核糖核酸(miRNAs)将改变雌激素受体阿尔法66 型和雌激素受体阿尔法36在细胞内的表达。正如本文所述，本项目发明人发现，某些细胞对汤吗希芬抗性会被改变，使得其对汤吗希芬的治疗更为敏感.特别是，发明人发现，微小核糖核酸let-7等在某些细胞内能显著抑制雌激素受体阿尔法66及阿尔法36的表达，从而增加这些细胞对汤吗希芬治疗的灵敏度。
本发明包括多聚核苷酸及其使用。本文中所使用的术语“多聚核苷酸”是指任何长度的核苷酸聚合形式，无论是核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，由肽链演变而来的核苷酸链分子，或兼而有之，既包括单链分子，双链复式单位。多聚核苷酸获得包括直接来自天然来源，或通过分子重组技术、酶学反应修饰、或化学技术等技术获得。本发明的多聚核苷酸可以通过分离提取获得。分离提取多聚核苷酸指的是从其自然环境中挪去。而由基因重组，酶学反应技术或化学方法生产的多核苷酸指指的是定义上的分离与纯化，因为他们从来没有在自然环境中存在过。此处使用的“基因”是指一种核苷酸序列，编码mRNA或未转录加工过的RNA[例如，一个RNA分子，包括外显子和内含子及转录加工后产生的信使核糖核苷酸(mRNA)，或转录加工后的原型态微小核糖核酸(Pri-miRNA)]。基因在其5′端有转录起始位点，在其3’端有转录终止的信号。本文所用的“目标基因”，是指一个特定的基因，其表达会被本发明中多聚核苷酸抑制。本文所用的“目标mRNA”是由目标基因编码的mRNA。
除非另有说明，目标基因可导致多个完全不同的mRNA，而这些mRNA的产生是由于使用了多种不同组合的外显子。这些相关的mRNA被称为剪接变异体或基因转录的变体。
本发明的多聚核苷酸可称为有意义链。有意义链一般由17到30个核苷酸组成，例如17，18， 19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30个核苷酸。有意义链与目标mRNA序列一样，或者完全相同。本文中所使用的术语“相同”是指有意义链的核苷酸序列具有相同的多聚核苷酸的一个部分，如目标mRNA的核苷酸序列。本文中所使用的术语“实质上相同”是指有意义链序列与目标mRNA序列有一个或多个不同，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或11个核苷酸，其余核苷酸序列与目标mRNA是相同的。
本发明的多核苷酸可称为反义链。反义链之间可能有17和30个核苷酸，例如，17，18，19， 20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30个核苷酸。反义链序列是基本上或完全与目标RNA互补的。所谓“互补”是指两个单链多核苷酸的碱基对彼此配对，即，一个多核苷酸腺嘌呤将与第二个多核苷酸链中胸腺嘧啶碱基配对，或者，一条多核苷酸链的胞嘧啶或尿嘧啶碱基将与第二条多核苷酸链的鸟嘌呤配对。反义链是指与另一条多核苷酸链“互补”的链(如目标mRNA)。它是指反义链的核苷酸与另一条多核苷酸链的核苷酸序列互补(如目标mRNA)。本文中所使用的术语“基本上互补”是指反义链还有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或11个核苷酸未能与另一条多核苷酸链上的核苷酸序列(例如，靶mRNA)互补。实例之一，反义链可能有1，2或3个核苷酸碱基未能配对，也就是说，在一条多核苷酸链上(如目标mRNA)，可能有1、2、或3个核苷酸碱基不能与之互补[见图13，其中序列号(SEQ ID)：17-24中，每条序列中都有一个与目标序列号16中未能配对的核苷酸]。实例之二，一条多核苷酸链(如目标mRNA)可能包括1，2或3个核苷酸碱基未能配对，也就是说，没有在一个与本发明中多核苷酸反义链相应碱基互补。
本发明的多核苷酸还包括与本发明中双链RNA(dsRNA)相对应的双链DNA，其中包括不同长度的双链多聚核苷酸中有意义链和反义链(Marques et al.，Nat.Biotech.，24：559-565(2006))。本发明中还包括单链RNA多核苷酸以及与本发明中相对应于有意义链及反意义链的单链DNA。同时，还包括只需要把胸腺嘧啶换成尿嘧啶核苷后，任何从DNA序列转化成RNA的序列。
本发明的多核苷酸还可能包括从双链多聚核苷酸一端或两端伸出的都分核苷酸序列。伸出部分包括出现在双链多聚核苷酸链中任意一条非配对的一个或多个核苷酸；如，与另一条双股多核苷酸链中不能配对互补的核苷酸。这个伸出链也许位于有意义链或反意义链或两者的3‘-端。这个伸出架构通常1、2或3个核苷酸长度。实例一，这个伸出序列位于3’-端，并且，含有胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(或尿嘧啶-尿嘧啶如果它是RNA)结构。如果没有限制，这种伸出结构可能被用来增加一个双链RNA的稳定性。伸出架构的存在，并不能用来确定该有义链是否与目标基因序列完全相同或大体上相同，也不能用来确定该有意义链是否与目标基因mRNA完全互补或大体上互补。
本发明中双链多聚核糖核酸有意义链和反意义链也许也是共价结合的，比如，由几个核苷酸组成的分隔体结构。这样的多聚核糖核酸结构叫做短的发卡RNA(shRNA)。根据基本的有意义链与反意义链的配对原则，这样空间区域通常形成一个环状结构。组成的环状结构的核苷酸数目通常不一样，据报道这个核苷酸数目通常在3到23个(Sui et al.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，99：5515-5520 (2002)，and Jacque et al.，Nature，418：435-438(2002)).实例一，短的发卡结构包括一条有意义链，紧接着是一个核苷酸环状结构及其反意义链类似物。例如，在核苷酸环状结构之前是反意义链，并紧随着有意义链。
本发明描述的多聚核苷酸也可以有不同修饰。这些修饰通常是为了提高多核苷酸在特定环境中的稳定性。这些修饰包括核酸塘基、碱基、或骨架结构、或以上任何一种的组合。这些修饰可能是合成的、自然界存在的或非自然界存在的。本发明中多聚核苷酸包括修饰一个或多个存在于多核苷酸中的核苷酸。例如，骨架结构修饰包括(但并不局限于)磷酸乙酰、三磷酸乙酰、磷酸酯， phosphorodithioates，磷酸酰氨、甲基磷酸化、手性甲基膦酸，2氧甲基核糖核酸以及多肽核苷酸。例如，核苷酸碱基修饰(但不局限于)包括：肌苷，嘌呤，4-吡啶，2-吡啶，苯，假尿嘧啶，2，4，6-三甲氧苯，3-甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，萘，氨基苯，5-烷基胞嘧啶类(例如，5-甲基胞嘧啶)，5- 烷基尿嘧啶类(例如，核糖胸腺嘧啶)，5-环尿嘧啶类(例如，5-溴尿嘧啶)或6-杂氮嘧啶类或6- 烷基嘧啶类(如6-甲基尿嘧啶)，或丙炔修饰。例如，核苷酸塘基修饰(但不局限于)包括：2′ -糖修饰，如.，2′-氧-甲基核苷酸，2′-去氧-2′-氟核苷酸，2′-去氧-2′-fluoroarabino，2′-氧-甲氧核苷酸，2′-氧- 三氟甲基核苷酸，2′-氧-乙基三氟甲氧基乙基-核苷酸，2′-氧-二氟甲氧基乙氧基核苷酸，或2′-去氧核苷酸。多核苷酸及其修饰可通过商业购买或合成获得(譬如，Pharmacon公司，Lafayette，CO)。
本发明多核苷酸是类有生物活性的分子。生物活性分子抑制目标基因转录后表达，叫做目标基因敲除。这里所描述的多核苷酸也叫做干扰核唐核苷酸(RNAi)，小分子干扰核唐核苷酸(siRNA)，小分子发卡式核糖核苷酸(shRNA)，微小核糖核酸(miRNA)，或反意寡聚核苷酸。本发明中的多核苷酸转入到细胞后将与细胞内目标基因的mRNA结合，切断目标基因的mRNA或抑制目标基因 mRNA转录与翻译，最终，导致抑制目标多肽链的表达。这样，目标基因的表达是否被抑制将通过检测细胞内目标基因的mRNA是否被降低，或检测目标基因mRNA编码的多肽含量是否被降低，或检测由目标基因mRNA编码的多肽的活性是否被降低。这里及以后所提到的术语“多肽”泛指两个或多个氨基酸通过肽键连在一起的多聚体。这个术语“多肽”也包括一个以上的通过二流键连在一起的多肽分子，或共价键或非共价键以多聚体(如，二体或四聚体)形式存在的复合物。因此，本专利所用的术语多肽、寡聚核苷酸、及蛋白质都包含在多肽范畴内，这些术语在以后的内容中可能会交叉使用。
以编码雌激素受体-α(ER-α)的目标基因为例。编码雌激素受体-α的基因位于染色体6q24-q27，长度大于140kb，包括9个外显子。本发明的多核苷酸能显著性抑制ER-α基因编码的多肽表达。
雌激素受体新亚型ER-a36
由雌激素受体ER-α基因所编码的多肽之一，即ER-α36。ER-α36多肽已在王等2005年专利中有详细的描述(U.S.7,745,230)，(Wang et al.，2005，Biochem Biophys Res Commun 336：1023-1027， and Wang et al.，2006，Proc Natl Acad Sci USA 103：9063-9068)。实例1，本发明多核苷酸与目标基因 ER-α36mRNA互补。实例2，本发明中多核苷酸也包括与目标基因ER-α36mRNA不互补的核苷酸，如，本发明中多核苷酸与ER-α36mRNA基因基本互补。目标基因中的核苷酸也许是进化上保守的核苷酸。见实例(图19，或基因库编码BX640939)，是编码ER-α36的目标基因序列(SEQ ID NO) 3。其他含有不同的核苷酸序列，编码ER-α36的mRNA多核苷酸也是本发明所保护的，并且，有可能是本发明多核苷酸的靶位点。例如，不在SEQ ID NO：3内但是编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列的mRNA。编码SEQ ID NO：4的核酸类序列虽然大但是是有限的，而且，相同类型的每个成员的核苷酸序列很容易被确定，因此，不同的核苷酸三联体密码可编码相同的氨基酸序列。其他编码 ER-α36的mRNA多核苷酸在数据库里能很易找到，其他序列可通过常规手段就可以鉴定出来，不必要通过实验手段获得。
本发明多核苷酸也许通过碱基互补方式直接结合到目标mRNA的5‘-端非编码区(5’-UT R)、编码区、或3‘-端非编码区(3’-UTR)、或以上提到的所有区域(如，编码区，3‘端非编码区)，如，部分的5’端非编码区、编码区、或部分编码区、或3‘-UTR)。这里使用的及以后内容，“编码区“和“编码序列”术语也学会交叉使用，称作可被翻译成多肽的核苷酸序列。编码区包括5’ -端翻译起始密码及3‘-端终止密码。在SEQ ID NO：3目标基因ER-α36mRNA实例中，5’UTR长度包括第1-233核苷酸，编码区对应于核苷酸序列234-1166核苷酸，3’UTR区域对应于第1167-5439 核苷酸。
在本发明中多核苷酸中，多核苷酸也许与目标基因ER-α36mRNA互补配对。理论上讲，本发明中多核苷酸与靶标基因mRNA(譬如，编码ER-α36多肽的核苷酸序列)互补配对没有局限性，多核苷酸与一个靶基因mRNA杂交引起的细胞内切酶切割目标基因mRNA。结果是抑制目标基因 mRNA编码多肽表达。这种抑制性多核苷酸通常叫做晓得干扰性RNA(siRNA)。例如，本发明中与目标基因mRNA互补的多核苷酸可以与目标基因编码区相对应的核苷酸杂交，如，SEQ ID NO：3中第234-1166核苷酸。
实例，本发明中多核苷酸可大体上与目标基因ER-α36mRNA互补。理论上讲，本发明中多核苷酸与靶标基因mRNA大体上互补，如编码ER-α36多肽的核苷酸与mRNA杂交，从而抑制目标基因mRNA多肽表达。结果是，mRNA编码的多肽表达受到抑制，这类抑制性多核苷酸通常叫做微小核糖核酸(miRNA)(Barh et al.，2010，Curr.Oncol.，17：70-80).如果本发明中多核苷酸基本上与目标基因ER-α36mRNA互补，目标基因核苷酸序列也许位于5’UTR，编码区，或3’UTR区。如，目标序列位于靶基因的3’UTR。例如，编码ER-α36多肽的mRNA3’-UTR内靶基因序列 5’-AACACCAGGAAGGCCUACCUCA(SEQ ID NO：16)。例如，靶位点多核苷酸序列 5’-AACACCAGGAAGGCCUACCUCA(SEQ ID NO：16)与目标基因基本互补的序列包括以下序列：
3’-UUGAUAUGUUGGAUGAUGGAGU-5’(SEQ ID NO：7)，
3’-UUGGUGUGUUGGAUGAUGGAGU-5’(SEQ ID NO：8)，
3’-UUGGUAUGUUGGAUGAUGGAGU-5’(SEQ ID NO：9)，
3’-UUGAUACGUUGGAUGAUGGAGA-5’(SEQ ID NO：10)，
3’-UUGAUAUGUUGGAGGAUGGAGU-5’(SEQ ID NO：11)，
3’-UUGAUAUGUUAGAUGAUGGAGU-5(SEQ ID NO：12)，
3’-UUGACAUGUUUGAUGAUGGAGU-5’(SEQ ID NO：13)及
3’-UUGUCGUGUUUGAUGAUGGAGU-5’(SEQ ID NO：14)。从图13可以看出，具有生物活性的多核苷酸，例如，可以抑制ER-α36的表达的核苷酸包括22个核苷酸序列中的5到10没有与目标基因序列互补。而且，互补序列位置大部分在定义区域。例如，本发明中多核苷酸反意义链与目标基因 ER-α36mRNA所形成的二级结构的自由能(ΔG)在-6.0千卡/摩尔至-40千卡/摩尔之间，实际计算是-15.8千卡/摩尔。测定RNA所形成的二级结构的自由能ΔG的方法可用常规方法(见Zuker等， 1999，In：RNA Biochemistry and Biotechnology，Barciszewski and Clark，eds.，NATO ASI Series，Kluwer Academic Publishers).
例如，本发明中多核苷酸也许与7、8、9、10、11、12、13或14号序列(SEQ ID NO：7，SEQ IID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，或SEQ ID NO：14)是一样的。这里及以后所提到的″一致性″指的是两个多核苷酸具有相类似的序列。两个多核苷酸序列的相似形可以通过排序比较两个核苷酸序列各残基来确定(譬如，候选核苷酸序列与参照核苷酸序列，如，序列号7SEQ ID NO：7)以便优化选择全长序列中的相同序列；以及排序过程两条链出现的不同序列，以便最大程度优化确定两条链共有序列，而且，每条序列中核苷酸必须保持与原始序列的一致性。一般认为，序列的相似性指排序的核苷酸序列至少有80％相似性、81％相似性、82％相似性、83％相似性、84％相似性、85％相似性、86％相似性、87％相似性、88％相似性、 89％相似性、90％相似性、91％相似性、92％相似性、93％相似性、94％相似性、95％相似性、96％相似性、97％相似性、98％相似性或99％相似性。序列的相似性可以通过以下方法来确定，比如，用 GCG FastA(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)技术，Mac Vector 4.5(Kodak/IBI software package)技术、或其他合适的排序软件和完美的方法。用来确定两个核酸序列的相似性的首选方法应该是BLAST搜索算法中的Blastn软件，该软件可通过美国国立健康研究所下属的美国国家生物技术信息中心所维护的万维网获得。首选地，用于Blastn搜寻的所有参数都是已定设定值。用BLAST 软件分析比较两个核苷酸序列时，序列的相似性就叫做“一致性”。
其他案例中，可用这里描述的相同方法来确定微小核糖核酸let-7的直接靶向ER-α36mRNA.这里及此后所用的术语“let-7’指小分子非编码的调节性RNA分子。例如，微小核糖核酸let-7包括多核苷酸编码线虫(C.elegans)let-7(TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT(序号SEQ ID NO：25)GenBank 号码AY390762)，以及编码人类let-7家族的多核苷酸成员，包括但不局限于在基因库里所列出的多核苷酸，其基因库序号分别为AJ421724，AJ421725，AJ421726，AJ421727，AJ421728，AJ421729， AJ421730，AJ421731，AJ421732。
微小核糖核酸let-7是成熟的微小核糖核酸，即，含有19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，或29 个核苷酸长度的单链RNA分子。有些实例中，成熟的微小核糖核酸是21-23个核苷酸长度的核苷酸组成。微小核糖核酸本身由转录基因编码但不能翻译成蛋白质；相反，它们来自于原始转录子(也叫做原始微小核糖核酸pri-miRNA)的加工成短的颈环(stem-loop)结构，也叫pre-miRNA，的(Vella 和Slack 2005年的书中In：WormBook，ed.The C.elegans Research Community，WormBook， doi/10.1895/wormbook.1.26.1，及Lim等2003年文章Genes&Development，17：991-1008，及Lim等 2003年Science 299：1540，以及Lee和Ambros 2001，Science，294：862，以及Lau等2001年Science 294：858-861)。成熟的微小核糖核酸是通过一系列的前体微小核糖核酸修饰及加工而来。首先，编码微小核糖核酸的基因转录。编码微小核糖核酸的基因一般成熟的微小核糖核酸分子长得多；微小核糖核酸首先以原始的转录子(“pri-miRNA”)转录；这类转录子带有”帽子“和poly-A尾巴结构，并在细胞核内依次加工成短的、约70核苷酸长度”颈环”(stem-loop)结构(Lieberman等美国公开专利US 2010/0310583).
术语″pri-miRNA″指的是成熟的微小核糖核酸的前体分子，包括微小核糖核酸序列及颈环组分，其两端连有微小核糖核酸边沿序列，每个边沿序列一般以一个帽子或多聚腺嘌呤(ploy-A)构成。 pri-microRNA可由任何形式的能有利于微小核糖核酸边沿序列及微小核糖核酸序列的核酸分子组成。pri-miRNA前体的核苷酸序列及其颈环组成可能变化很大。一方面，pre-miRNA分子可能是一些孤立的核酸分子，包括具有微小核糖核酸边沿序列或一个颈环结构以及后来由此而整合的核酸分子。pri-miRNA分子可在体内外加工成一系列的中间态的“pre-miRNA，”分子，并最终形成成熟的微小核糖核酸分子。
术语″pre-miRNA″指的是前体微小核糖核酸加工成成熟的微小核糖核酸过程中的一类中间态的微小核糖核酸分子，pri-miRNA加工成pre-miRNA是在细胞核内进行，随后，pre-miRNA分子转移到细胞浆内，通过一系列的胞浆内加工进而形成成熟的微小核糖核酸。Pre-miRNAs一般约70个核苷酸长度，但有可能少于70，也有可能多于70个核苷酸。
微小核糖核酸let-7包括微小核糖核酸边沿序列，如，包括微小核糖核酸加工过程中的各组分的核苷酸序列。微小核糖核酸加工过程中的各组分是最小的核酸序列，它们在前体微小核糖核酸加工成成熟的微小核糖核酸过程中期关键作用。这些组分元素也许位于40个核苷酸序列内部但在miRNA 的颈环结构两侧。例如，已发现微小核糖核酸加工过程中的各组分元素位于微小核糖核酸颈环结构两侧的5到4000核苷酸长度内。因此，有些实例中，认为边沿序列是5到4000个核苷酸长度。总之，前体分子的长度有些情况下至少是150或270个核苷酸长度。可是，前体分子的总长度会更长或者更短于这个长度。在另外一些实例中，微小核糖核酸边沿序列的最小长度也许会是10，20，30，40， 50，60，70，80，90，100，150，200以及他们之间的任何一个整数。而在其他实际情况下，微小核糖核酸的边沿序列的最大长度也许是2,000，2,100，2,200，2,300，2,400，2,500，2,600，2,700，2,800，2,900，3,000，3,100，3,200，3,300，3,400，3,500，3,600，3,700，3,800，3,900 4,000以及它们之间的任何一个整数。
雌激素受体a66(ER-a66)
由ER-α基因编码的多肽之一是ER-α66。实例，本发明的多聚核苷酸与ER-α66mRNA互补的核苷酸序列。实例范畴，本发明的多聚核苷酸是与ER-α66mRNA基本互补的核苷酸序列。靶基因上的核苷酸序列也许是连续的核苷酸序列。实例之一是序号1中的编码ER-α66的目标基因mRNA 序列(SEQ ID NO：1)(即，图18，也请看基因库号X03635)。编码ER-α66但也许有不同核苷酸序列的其他多核苷酸也是本发明中多核苷酸的靶位点。例如，除在序号1中所描述的序列，任何一个核苷酸序列家族中的一个成员，是编码有不同氨基酸组成的序列(如，SEQ ID NO：2)的多肽分子。编码SEQ ID NO：2中的核苷酸序列家族是很大但有限，而且，通过以标准遗传码作为参照，该核苷酸族中每一个成员的核苷酸序列可以很容易被熟练操作人员所确定，这里及以后文中所指的标准的遗传码即不同核苷酸三连体密码，也即，编码相同的氨基酸的遗传密码。编码ER-α66的其他mRNA 多核苷酸也能在数据库里找到，并很容易地用常规不需要undue实验方法就能鉴定。
与本发明中的多核苷酸杂交的目标基因的核苷酸序列也许是目标基因中部分的5’-UTR，编码区， 3’UTIR，或它们以后的不同组合(如，部分的5’UTR、及编码区、或部分编码区、或3’UTR)。靶标ER-α66mRNA已展示在SEQ ID NO：1，5’UTR位于第1-360个核苷酸，编码区序列对应于该基因的第293-2080核苷酸，以及3’UTR序列对应于该目标基因的第361-2148核苷酸，而3‘-端非编码区对应于第2149-6434。
实例，本发明中多核苷酸也许完全与靶基因ER-a66mRNA互补。本发明的多核苷酸与目标 mRNA的互补配对，从理论上讲没有局限性，如，编码的ER-a66多肽的多核苷酸mRNA与目标基因mRNA杂交，并通过细胞内内切酶，进而切断靶基因mRNA。其结果是抑制mRNA编码的多肽的表达。这类抑制性多核苷酸通常叫siRNA。有些情况下，本发明中的与靶基因mRNA互补的多核苷酸与目标基因编码区核苷酸(如，序号1中的第293-2080核苷酸)杂交。
实例，本发明中的多核苷酸基本上与靶基因ER-a66mRNA互补。本发明的多核苷酸与目标 mRNA的基本上互补配对，从理论上讲没有局限性，如，编码的ER-a66多肽的多核苷酸mRNA与目标基因mRNA杂交，抑制靶基因mRNA的翻译表达。其结果是抑制mRNA编码的多肽的表达。这类抑制性多核苷酸通常叫miRNA微小核糖核酸。当本发明中的多核苷酸基本上与目标基因ER-α66 mRNA互补时，靶向核苷酸也许是在目标基因的5’-UTR，编码区，或3’-UTR。实例，靶向核苷酸在目标基因的3’-UTR。如，靶向编码ER-α66多肽的mRNA的3’-UTR内地序列是 5’-UUUCUAAGUAAUUGCUGCCUCU(序号6，SEQ ID NO：6)。例如，不能完全与靶基因序列 (5’-UUUCUAAGUAAUUGCUGCCUCU(SEQ ID NO：6))互补的靶向多核苷酸序列可能包括以下序列：
3’-UUGAUAUGUUGGAUGAUGGAGU-5’(SEQ ID NO：7)，
3’-UUGGUGUGUUGGAUGAUGGAGU-5’(SEQ ID NO：8)，
3’-UUGGUAUGUUGGAUGAUGGAGU-5’(SEQ ID NO：9)，
3’-UUGAUACGUUGGAUGAUGGAGA-5’(SEQ ID NO：10)，
3’-UUGAUAUGUUGGAGGAUGGAGU-5’(SEQ ID NO：11)，
3’-UUGAUAUGUUAGAUGAUGGAGU-5(SEQ ID NO：12)，
3’-UUGACAUGUUUGAUGAUGGAGU-5’(SEQ ID NO：13)，及
3’-UUGUCGUGUUUGAUGAUGGAGU-5’(SEQ ID NO：14).正如图5所示，具有生物活性的多核苷酸，如，能抑制ER-α66表达，包括22核苷酸中的5到7个不能与靶基因互补。而且，互补的核苷酸大部分位于所指定的区域。实例，本发明多核苷酸与靶基因ER-a66所形成的RNA二级结构所需要的自由能(ΔG)在-6千卡/摩尔到-40千卡/摩尔，而且，其实际自由能是-16.2千卡/摩尔。
实际上，本发明的多核苷酸也与以下序列是一致的：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9， SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，或SEQ ID NO：14.
其他多核苷酸靶向ER-α36mRNAs的例子还包括微小核糖核酸let-7，这些核苷酸是通过这里所用的方法来确定的。微小核糖核酸let-7将在下文做进一步的描述。
技术实现要素：
发明方法
这里所描述的多核苷酸，如，序列与靶向mRNA或微小核糖核酸let-7一致和几乎一致、互补或基本互补的多核苷酸，可以用常规方法或已知的最好方法进行设计获得。譬如，抑制ER-α36 or ER-α66多肽表达的多核苷酸也许可用细胞系或原代细胞测试。候选多核苷酸的有效性可通过测试其是否能降低ER-α36和ER-α66多肽的表达。其他已知的最好方法及常规方法可用来设计和筛选候选多核苷酸。候选多核苷酸一般可用大众通用的算法(如，BLAST)来比较候选多核苷酸序列与目标基因的mRNA序列获得。那些可能与目标基因非靶向的编码区的mRNA形成RNA二级结构的候选多核苷酸一般不在作为进一步的考虑。剩下的候选多核苷酸将进一步测试是否它们能抑制这里所指的多肽的表达。
一般情况下，每个候选多核苷酸将通过以下途径一一测定，即，在细胞内引入候选多核苷酸测试是否其能降低多肽的表达。候选多核苷酸也可以在体内制备，然后引入细胞。候选多核苷酸也可以通过引入一个编码候选多核苷酸的重组子获得，重组子引入到细胞内，测试表达候选多核苷酸后是否能抑制多肽的表达。这个重组子也许是已知的最好的，例如，包括编码及表达候选多核苷酸的有意义链和反意义链，及RNA表达载体包括编码候选多核苷酸有意义链或反意义链的可操作性的联接核苷酸序列，如RNA多聚酶起动子及RNA多聚酶终止子，进而RNA多核苷酸的产生。
能用来评估候选多核苷酸的效果的细胞系也许是可用来选择作为可表达适当多肽的细胞。这类细胞可能来自原代离体或在体。这里及以后所用的术语“原代离体”指的是从活物体内分离而取得的细胞。原代离体细胞包括原代细胞(如，最近从人或动物体内分离，并且在组织培养基中有限地生长)及组培细胞(如，利用体外培养基能可持续地培养的细胞)。这里及后文中提及的术语”在体“指的是存在于人或动物体内的细胞。例如，在体细胞也许是存在于一个器官或肿瘤组织中的细胞。细胞可以通过人乳腺组织标本或任胰腺组织标本获得。
分别表达ER-α36和ER-α66多肽的细胞系包括但不局限于T47D，HB3396，和ZR-75-1等细胞系。以表达ER-α36多肽的细胞系但不表达ER-α66多肽的细胞系包括但不局限于SK-BR-3， MDA-MB-231，MDA-MB-436，及MDA-MB-468细胞系。容易获得并表达ER-α66及ER-α36多肽的水平较低的细胞系包括MCF7细胞。其他合适的细胞系包括从人的离体标本获得的原代细胞，如，人乳腺肿瘤、子宫肿瘤、胰腺肿瘤、子宫内膜癌肿瘤、或直肠癌肿瘤、或淋巴结引流窝藏的肿瘤组织。其他改造过的细胞，如，通过重组技术使编码多肽的多核苷酸整合到分子载体并使之表达两个多肽之一或二者的细胞系。
候选多核苷酸也可以用动物模型进行选择。各种癌症的动物模型(如，小鼠)是同常被接受的研究癌症的可行性模型，如，裸鼠模型是最常用的用来研究人类各种癌症的可行性模型，通过注射人类肿瘤细胞到这种模型中来研究癌症的发病机理。候选多核苷酸将用这类模型或其他动物模型确定是否候选多核苷酸能降低与该疾病有关的一个或多个症状或迹象。
引入候选多核苷酸到细胞的方法包括重组编码候选多核苷酸重组子、最优方法或常规方法。如果所用细胞来自于原代离体，这些方法还包括用转染试剂(包括脂质体、氨类借导的试剂，如，阳离子脂质体或多聚DNA结合阳离子(如多聚-L-赖氨酸及聚乙烯亚胺)。可替补的方法，如，电转染、或病毒转染可用来引入候选多核苷酸或编码候选多核苷酸的载体。如体内细胞，使用方法还包括但不局限于局部处理(如，注射或包埋)、或静脉注射处理等。
当测试是否候选多核苷酸能抑制这里描述的多肽中的一个或多个表达，含有候选多核苷酸的细胞内目标基因的表达量可被测量及与相同类型但不含候选多核苷酸的细胞进行比较。将用已知最好的方法及常规方法测定细胞内或体液内mRNA水平。这些方法包括定量反转录多聚酶链式反应 (qRT-PCR)。用于扩大编码ER-α36及ER-α66mRNA引物及所用特殊条件可通过技术熟练人员测定。例如，用于qRT-PCR的有用引物包括检测ER-α36表达的5’-CAAGTGGTTTCCTCGTGTCTAAAG (SEQ ID NO：35)and 5’-ACGTCCACACACGGATTTGA(SEQ ID NO：36)以及ER-α66表达的引物 5’-GCGGCCACGGACCAT(SEQ ID NO：37)and 5’-TTCCCTTGGATCTGATGCAGTA(SEQ ID NO：38)。另一种方法包括通过表达可检测的生物标记物(如，荧光素酶)的报告基因系统。当适当的靶标序列(如以下实例中1及2中所论述的，ER-α36靶序列SEQ ID NOs：41和42；或ER-α66 的靶序列SEQ ID NOs：39和40)整合到报告基因系统后，通过靶序列对报告基因的活性调控，测试靶序列效应。其他方法，如，北方杂交及多目标基因的芯片分析，也是有效的研究方法。
其他研究是否候选多核苷酸对这里及下文所述的目标基因的多肽表达有抑制效果的方法还包括监测多肽的表达。如，分析目标基因mRNA编码的多肽表达是否降低，或者，测量目标基因编码的多肽活性是否降低。检测多肽含量的方法包括通过比较在候选多核苷酸干预或不干预的情况下，相同细胞内候选多核苷酸对多肽的表达效果的影响。可用常规及已知的最佳方法分析确定两种雌激素多肽在细胞内的表达，如，西方免疫杂交分析，酶联免役分析，或免疫组织化学分析。西方免疫杂交分析和免疫沉淀分析通常用在原代离体细胞，而免疫组织化学常用于体内或在体细胞分析。
以上所说的候选多核苷酸是指本发明中的多核苷酸，即与对照细胞比较时，能减低ER-α36或 ER-α66多肽的表达至少达20％，至少达30％，至少达40％，至少达50％，至少达60％，至少达70％，至少达80％，至少达90％或至少达100％。
附图说明
图1A和B为在不同病理期人乳腺癌组织中发现的miRNAs表达的热图。
图1C为在不同病理期人乳腺癌组织中发现的let-7a/b/c/i的真实性验证。
图1D为在人乳腺癌组织中发现的let-7家族在乳腺癌不同亚型细胞系中表达；*，p＜0.05；**，p＜0.01。
图2为miRNA参照基因RNU48在乳腺癌不同亚型乳腺癌细胞系中表达。
图3为除了雌激素受体(ER-α)阴性的人乳腺癌组织中28种差异表达miRNAs热图；A，为极显著差异的miRNAs；B，为miRNAs let-7家族在乳腺癌组织差异表达。
图4为miRNAs let-7a/b/i在乳腺癌肿瘤组织不同病理阶段的表达与ER-α成反比关系。
图5为差异表达miRNAs Let-7家族与雌激素受体α的靶向关系；A，let-7靶向预测；B，let-7a/b/i显著抑制雌激素受体介导的萤火虫载体活性；C，当把雌激素受体的let-7a/b/i结合位点突变了，这些 miRNAs分子失去对雌激素受体活性的抑制作用；D，当把let-7a/b/i的抑制剂加入后，明显刺激雌激素受体活性。
图6为miRNAs let-7家族影响雌激素受体α基因信号传递；A，let-7a/b/i转染细胞后2天河6天后对 ER-α及其介导的信号通路下游基因信号影响；B，转然后ER-αmRNA表达；C，外源诱导let-7a/b/i 高表达的效果；D，let-7a/b/i对MCF-7细胞系ER-α活性影响。
图7为miRNAs let-7家族转染细胞MCF-7后的转化效率。
图8为体外miRNAslet-7抑制剂转染细胞MCF-7细胞系2天后雌激素受体α表达；A为let-7a/b/i抑制剂作用下它们在细胞系中的表达；B为let-7a/b/i抑制剂对ER-α的抑制效果；C为抑制剂存在下ER-α的mRNA表达。
图9为在有或无雌激素作用下miRNAs对乳腺癌细胞生长的抑制效果；A为正常培养基下；B(let-7a)、 C(let-7b)、D(let-7i)为无雌激素存在下对细胞生长的抑制作用。
图10为三阴乳腺癌细胞系中let-7a/b/i对细胞系生长的影响。
图11为完全培养基下miRNAs let-7a/b/i/转染细胞3天后(A)和6天后(B)对乳腺癌细胞短暂抑制； C为miRNAs调节ER-α可能作用机制。
图12A为HER2，ER-a66和ER-a36在不同乳腺癌细胞系中表达；B为let-7a/b/i在乳腺癌组织中与ER-a36 的反比表达关系。
图13为miRNAs let-7家族靶向雌激素受体新亚型ER-a36；A为let-7靶向预测；B为let-7b/i显著抑制ER-a36活性；C为let-7结合ER-a36位点突变后即失去抑制效果；D为加入let-7抑制剂后显著提高ER-a36活性。
图14为miRNAs let-7家族在乳腺癌三阴细胞系中转染效果；let-7b/i转染2天后ER-a36的mRNA (A)和蛋白表达水平(B)；的表达与雌激素受体新亚型ERα的负相关关系；C为let-7b/i转染2天后的效果；D为转染2天后let-7对ER-a36信号通路影响；用let-7b/i抑制剂处理细胞2天后ER-a36 mRNA(E)和蛋白表达水平(F)影响。
图15为抗他莫昔芬乳腺癌细胞系MCF-7中雌激素受体66蛋白高表达和其新亚型ERα-36蛋白的低表达关系；B为抗他莫昔芬乳腺癌细胞系中ERa-66和-36mRNA表达关系；ER-a36的mRNA在抗他莫昔芬细胞中表达；D为miRNAs let-7家族在抗他莫昔芬细胞系中表达。
图16为miRNAs let-7家族敲除ER-a36活性后能提高抗他莫昔芬乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性； A为转染2天后ER-a36蛋白表达和let-7b/i表达；C为转染6天后ER-a36mRNA表达和let-7b/i 表达；D为外源高表达let-7b/i；为正常培养基(E)和去FBS培养基(F)下let-7b/i对细胞生长影响。
图17为miRNAs let-7家族对ERa-66和-36可能作用机制。
图18为编码为雌激素受体α66基因序列(SEQ ID NO：1)和蛋白序列(SEQ ID NO：2)。
图19为编码为雌激素受体α36基因序列(SEQ ID NO：3)和蛋白序列(SEQ ID NO：4)。
图20为miRNAs let-7b和miR-335在同一个乳腺癌组织和血清中表达关系。
图21为miRNAs在室温下稳定性测试。
图22为miRNAs在反复冻融状态下稳定性测试。
图23为妇女月经期对miRNAs稳定性的影响。
图24为年龄和妇女绝经期对血清中miRNAs的影响。
细菌和病毒载体
本发明中的多核苷酸可以整合到各种细菌和病毒载体里。载体是指能复制多核苷酸的生物体，比如，细菌质粒，嗜菌体，粘粒，外源的多核苷酸序列可以整合上去以便使其能得到复制。本发明中的多核苷酸复制载体的构件是利用标准的分子生物学酶联技术来完成(参考书籍：Sambrook et al，Molecular Cloning： A Laboratory Manual.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。载体能提供进一步的分子克隆(即，本发明中多核苷酸繁殖放大)，即，分子克隆载体，或多核苷酸的表达，即，表达载体。术语载体包括，但不局限于，细菌质粒载体、病毒载体、粘粒载体、转座子载体、以及人工制造的染色体载体。例如，病毒颗粒载体包括腺病毒载体、类腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体，和疱疹病毒载体。载体也许会导致目标基因序列整合到寄主细胞染色体DNA中。载体也许能在细菌寄主细胞内复制，如，E.coli。一般选择的载体是一类细菌质粒。本发明中的多核苷酸可以以两个分离的互补多核苷酸链出现在载体中，其中，每条链能产生双链R NA(dsRNA)中的有意义链和反意义链；或以单一的多核苷酸链存在于载体中，多核苷酸链包括有意义链、干预分隔区、及反意义链，这种重组载体可以产生双链RNA(dsRNA) 中的有意义链和反意义链。
载体的选择取决于重组后对重组子的要求，如，选择性标记物，载体繁殖速率等。这里及以后所提到的合适的用于克隆或基因表达寄主细胞是原核或真核细胞。合适的真核细胞包括哺乳动物细胞，如，鼠类细胞以及人类细胞。合适的原核细胞包括真细菌，如，革蓝式-阴性菌，譬如，大肠杆菌(E.coli)。.
可选择性的表达载体包括与本发明中多核苷酸联接的可控的调节序列。“调节序列”是指调节编码序列表达的核苷酸序列，这个序列与编码序列相连。调节序列中的非限制性例子，包括起动子、增强子、转录起始位点、转录终止位点、转录中断子、以及多聚腺嘌呤信号。术语“可操作性地联接”是指一个相互并列的组成成分，它们互相协调并按照拟定的方式行使其功能。调节序列是通过“可操作性地联接”到编码区，当按其方式连在一起的时候，在适合于调节序列作用的条件下，才能使编码区序列得到表达。
载体还包括保守性的、诱导性的、以及促进本发明中多核苷酸在特定的组织里或细胞外环境中表达的组织特异性的促进子，譬如，目前所有已知的促进子。保守性的哺乳类促进子包括但不局限于多聚酶类促进子，以及以下基因的促进子：次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，腺苷脱氨酶，丙酮酸激酶和β-肌动蛋白。在真核细胞内功能上保守的病毒促进子包括但不限于，猿猴病毒，乳头状瘤病毒，腺病毒，人类免疫缺陷病毒 (艾滋病毒)，劳斯肉瘤病毒，巨细胞病毒，莫洛尼白血病病毒长末端重复序列和其它逆转录病毒，以及单纯疱疹病毒胸苷激酶基因促进子。另外，还包括目前已知的其他保守性的促进子。
在出现诱导因子情况下，诱导性的促进子表达，这些诱导因子包括(但不局限于)金属诱导性促进子及类固醇-调节的促进子。例如，当出现某些金属的情况下金属硫蛋白促进子被诱导启动转录。另外，其他已知的诱导性的促进子。
组织特异性促进子包括，但不局限于，肌酸激酶促进子，已经用来直接诱导在肌肉内、心肌组织表达，还有免疫球蛋白重链或轻链促进子诱导其在B细胞内表达。其他组织特异性促进子包括人平滑肌α-肌动蛋白促进子。又例如在肝脏内组织特异性表达的元素(但不局限于)HMG-乙酰A还原酶促进子，固醇调节元素1，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶促进子，人类C-反应蛋白促进子，人类葡萄糖激酶促进子，胆固醇-L-7-α羧基酶(CYP-7)促进子，β-半乳糖苷酶，α-2，6唾液酸kans转移酶促进子，胰岛素类似物生长因子结合蛋白(IGFBP-1)促进子，醛缩酶B促进子，人类转铁蛋白促进子，及胶原蛋白I型促进子。胰腺癌中组织特异性表达元素包括(但不局限于)胰腺炎相关蛋白促进子(PAP)，弹性蛋白酶1转录增强子，胰腺特异性淀粉酶和弹性蛋白酶增强促进子，以及胰腺胆固醇酯酶基因促进子。子宫内膜内组织特异性表达元素包括(但不局限于)子宫球蛋白促进子。淋巴细胞组织特异性表达元素包括(但不局限于)人CGL-1/颗粒酶B促进子，终端脱氧转移酶(TdT)，lambda 5，VpreB，and lck(淋巴细胞特异性酪氨酸蛋白激酶p561ck)促进子，人类CD2促进子及3′转录增强子，以及人类NK and T细胞特异性活化因子(NKG5)促进子。大肠中组织特异性表达元素包括(但不局限于)pp60e-src酪氨酸激酶促进子，器官特异性新抗原(OSNs)促进子，以及大肠特异性抗原-P促进子。乳腺细胞中组织特异性表达元素包括(但不局限于)人类α-乳清蛋白促进子。肺部组织特异性表达元素包括(但不局限于)囊肿性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因促进子。
本发明多核苷酸通常也包括转录终止因子。包括目前已知的终止子，例如，序列中5个连续的胸嘧啶核苷酸。
这里及后文所述的多核苷酸可从体内或体外获得。例如，通过体外合成方法，包括(但不局限于)利用传统的的DNA/RNA化学合成装置合成获得。用于体外合成的多核苷酸及合成试剂也可通过供货商获得。体外合成方法还包括利用环状或线性表达载体在无细胞系统体外转录合成获得。表达载体也可以用于细胞内本发明中多核苷酸的生产，然后，这类多核苷酸可以从该细胞系中分离获得。
组成成分
本发明组成成分包括这里及后文提及的一个或多个多核苷酸，涵盖通常制药业界可接受的运送载体。这里及后文所提到的“制药业界可接受的运送载体”包括生理盐水、溶剂、分散性介质、包埋物、抗细菌及抗真菌试剂、等渗和吸收延缓剂，以及其与药物治疗亲和的类似物。附加的活性成分也可以整合到这类组合物中。
这些组分也可以用医药界成熟的方法所配制。一般来讲，这些组分可以与其预定的给药途径兼容配伍而成。治疗也许只是局部或全身性的。在有些情况下，局部治疗对特异性的局部疼痛对症治疗有很多的优越性。局部治疗对局部治疗部位能提供高效、高临床治疗浓度，避免系统治疗所产生的副作用。常规治疗案例包括胃肠外，如，静脉注射，皮内注射，皮下组织，口腔，贴剂(外敷)，以及跨胃粘膜给药。溶液或悬浮液包括以下成分：无菌的稀释液，如，治疗用的水、生理盐水溶液、固定油，聚乙二醇类，甘油，丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌试剂，如，苯甲醇，或甲基苯甲酸酯；抗氧化剂，如，抗坏血酸，或亚硫酸氢钠；螯合剂，如，乙二胺四乙酸；缓冲液，如，醋酸、柠檬酸，或磷酸盐；电解质，如，钠离、氯离子、钾离子、钙离子、以及镁离子、以及用来调节离子强度的试剂，如，氯化钠或葡萄糖。可以用来调节酸碱度的试剂，比如，盐酸、或氢氧化钠。这些药物组分可以分装在安瓿瓶、一次性使用的针管、或用玻璃或塑料制成的多剂量样品小管里。
药物成分包括无菌溶液或乳浊液、以及用无菌液或分散剂制成的无菌粉剂。静脉注射用药，合适的运送载体，包括生理盐水、抑菌的水、聚氧乙烯蓖麻油ELTM(巴斯夫公司BASF，美国新泽西州Parsippany市) 或磷酸缓冲盐生理盐水。组分一般应是无菌的，而且，对注射用液体，还应该有一定程度的可流动性，这样便于注射器抽取。药剂在生产、入库储存及使用过程中的保存等条件下应该抗微生物污染，如，细菌及真菌。运送载体可以是溶剂或扩散的介质，含有(比如)水、酒精、多元醇(比如，甘油，丙二醇，液体聚乙烯乙二醇，以及其类似物)，以及接下来提到的合适的混合液。可以通过使用各种抗细菌及抗真菌试剂对可能造成微生物的过程进行预防，譬如，苯甲酸酯，氯代丁醇，酚类、抗坏血酸，硫柳汞，以及其类似物。很多情况下，组分中选择等渗剂试剂可能更为理想，如，蔗糖；多元醇，如，甘露醇，山梨醇，氯化钠。可注射性的组分中含有缓慢吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)可导致增强及延长对药物的吸收效率。
无菌溶液可以通过以下途径制备而成：掺入活性化合物(如，本发明中的多核苷酸)与一个或几个上面所列举的有效成分混在一起，然后，根据需要，通过对组分过滤杀菌。一般来说，通过把有效化合物纳入无菌的运送载体制成分散药剂，其中包含了分散介质，以及上面列举的所需的其他成分的活性化合物。对于用无菌粉末制备无菌注射液的情况，所需的方法也许包括真空干燥和冷冻干燥，产生的活性成分的粉末，在添加先前无菌过滤的溶液中任何额外的所需的成分。
口腔成分一般包括惰性稀释剂或一种可食用的载体。口服治疗管理的目的，活性化合物可以与辅料掺和，制成粒剂，片剂或胶囊剂，如明胶胶囊的形式使用。口腔成分也可以准备使用流体载体。药学兼容的结合剂，可以包括在部分的组成成分里。粒剂，丸剂，胶囊剂，片剂和其他的剂型，可能包含下列任何一种成分，或类似性质的化合物：粘结剂，如微晶纤维素，胶黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如褐藻酸，普里莫凝胶，或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；胶体二氧化硅的助流剂，甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷，水杨酸甲酯，或橙色的调味。
全身给药，也可以采用跨胃粘膜，或透皮手段给药。对于跨胃粘膜或透皮给药，渗透剂一般用在新药配伍中，因为能制定适当的渗透屏障。这样的渗透剂一般人都知道，包括，例如跨胃粘膜治疗，洗涤剂，胆盐，夫西地酸衍生物，。跨胃粘膜给药，可以通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂。透皮给药，活性化合物配制成人人皆知的药垫，药膏，凝胶或药浆，。透皮给药的一个例子，包括外电流离子化导入法(iontophoretic) 将药物传递至真皮或其他有关组织。
活性化合物给药，也可以通过任何适合多核苷酸试剂的给药方式进行，如除无针法外，如Johnston等微粒DNA疫苗技术(美国专利号6194389)，还可以使用基因枪，生物注射器，和皮肤补丁。此外，鼻腔内给药也是可行的方法，例如，Hamajima等发表的文章(Clin.Immunol.Immunopathol.，88，205-210(199))。也可用以下试剂配送，如血脂，阳离子脂质，磷脂，脂质体和微胶囊试剂。
活性化合物可以用一些能延缓该化合物在人体内的迅速消除试剂，如控释制剂，包括植入物。也可用生物可降解、生物相容性的聚合物，如乙烯-醋酸乙烯，聚酸酐，聚乙醇酸，胶原蛋白，聚邻酯，和聚乳酸。这些配方可使用标准的技术制备。该材料也可通过购买获得。脂质体悬浮液也可用于药学上可接受的载体。这些都可以根据目前已经成熟的方法制备。
本发明中的多核苷酸，可与其他药物结合使用，以协助细胞对多核苷酸的摄取，或以协助释放多核苷酸从内涵体或细胞间内腔进入细胞质或细胞核。这些试剂包括(但不局限于)肽段、尤其是细胞穿透肽，蛋白转导域，以及能增强细胞摄取的多核苷酸双链RNA结合结构域(Dowdy et al.，美国专利申请号 2009/0093026，Eguchi et al.，2009，Nature Biotechnology 27：567-571，Lindsay et al.，2002，Curr.Opin. Pharmacol.，2：587-594，Wadia and Dowdy，2002，Curr.Opin.Biotechnol.13：52-56.Gait，2003，Cell.Mol.Life Sci.，60：1-10)。多核苷酸交联可以在一个寡核苷酸的内部位置，或在5′-末端或3′-末端。
这些活性化合物的毒性和疗效可以用标准的药学程序，通过细胞培养或实验动物进行测定，如测定 ED50(即，对50％群体有效的剂量)。
从细胞培养实验和动物实验获得的数据可以用来制定在人类使用的剂量范围。这种化合物的使用剂量，最好控制在一个循环(恒定)的浓度范围，即很少或根本没有毒性的ED50范围内。在此范围内具体剂量可能会有所不同，这取决于所用剂量的形式和给药途径。对于在本发明的方法使用的化合物，治疗有效剂量可通过细胞培养实验进行初步估计。在动物模型中的剂量可能会重新制定以获得一个循环的血药浓度范围，包括通过细胞培养所确定的IC50(即，达到最大抑制迹象或症状的一半所需的测试化合物的浓度，也即，半致死剂量)。这些信息可用于更准确地确定最终在人体使用的剂量。
复合物的使用可以从每天一或多次，到每周一次或多次，隔日服用一次。有经验的药剂师会明白，某些因素可能会影响有效地治疗病人所需的剂量和时间，这些因素，包括但不限于，疾病的严重程度或障碍的程度，以前的治疗状况，健康状况及病人年龄，和目前有的其他疾病。此外，对病人有效治疗多核苷酸剂量包括单一的治疗剂量或系列的治疗剂量。
实施方法
本发明进一步使用此处所描述的多核苷酸的方法。理论上没有局限性，本文所述的多核苷酸通过 RNA干扰(RNAi)方式调控对编码ER-α66或ER-α36mRNA的转录活性。RNAi是动物和植物中的对特异序列转录后基因敲除的过程。此过程由双链RNA(dsRNA)中反意义链起始，通过与目标基因的敲除部分实行完全或基本序列互补，以达到该基因活性被敲除的过程。敲除起因于目标mRNA的降解，即，往往发生在当双链RNA中的一条链与靶标基因mRNA之间的高度互补性时的情况。敲除也能导致翻译抑制或去腺嘌呤化，这往往发生在当双链RNA中的一条与目标基因mRNA部分互补时的情况(见Barh等，2010， Curr.Oncol.，17：70-80)。
使用的RNAi敲除目标编码序列表达之方法已经熟为人知的技术。本发明的方法包括减少ER-α66多肽在细胞内表达，减少ER-α36多肽在细胞内的表达量，减少ER-α66和ER-α36多肽在细胞内表达，增加癌症细胞对选择性雌激素受体调制剂(SERM)的灵敏度，减少肿瘤的发生，减少血管生成，减少转移的进展。通常情况下，一个细胞的这些特点之一出现时，如ER-α36多肽，可与同一类型的细胞，不包含发明的多核苷酸的比较。这种不包含多核苷酸的细胞对照细胞。靶标mRNA或本发明的多核苷酸表达高的细胞中的靶mRNA编码多肽的数量表明多肽的表达受到了抑制。
在一些实施例中，本发明的方法包括对需要治疗的病人的某些疾病。这些病人是哺乳类的，包括鼠科家族的成员(如鼠科动物，如大鼠和小鼠动物)或灵长类哺乳动物(如猴子，人类)，尤其是一个人。由于此处使用“疾病”一词，是指特征性症状或临床症状表现的个体正常结构或部分功能，器官或系统的偏离或中断，或两者兼而有之。疾病包括雌激素受体阳性的癌症，如乳腺癌，卵巢癌，胰腺癌，子宫内膜癌，肺癌和结肠癌。这些癌症通常是原发癌，并包括还没转移以及已经转移的癌细胞。其他疾病包括导致癌症的转移的癌症，如原发性癌转移。转移性肿瘤位于，例如，淋巴结引流原发肿瘤组织中含有。
由于此处使用的朮語“症状”，是指疾病引起的個體証據或病人所經歷及引起的狀況。由于此处使用“临床迹象，”或简单的“迹象”，是指疾病出现在个体身上的客观证据。与疾病有关的症状或迹象称症状，常规的方法可评估这些症状的方法。疾病的征兆的例子不同，取决于疾病的本身。乳腺癌的症状可能包括肿瘤的发生，转移，血管生成，乳腺细胞表达ER-α66和ER-α36，乳腺细胞表达微小核糖核酸let -7，乳腺细胞对选择性雌激素受体调节剂的抗性，如汤吗希芬，或两者兼而有之。通常情况下，一个个体是否有疾病或是否对治疗有反应可通过对疾病有关的症状进行评估。
疾病的治疗可分为预防性的或疾病后的。预防性的治疗是指本文提到的当病人处于一种很可能发展成为疾病的“风险”期，如，疾病症状出现之前。风险期病人可能发展为疾病一个例子是该病人体内存在有一个危险因素。风险因素包括遗传标记物。遗传标记物的出现可能说明该病人有发展成为某些癌症的倾向，如乳腺癌，包括有乳腺癌家族史及BRAC1和/或BRAC2基因的突变。治疗可以在疾病发生前、发生期间、或本文所述的发生之后进行。疾病发展后的治疗可导致减少疾病迹象的严重性，或完全消除的疾病症状。
本发明的方法也可以利用治疗试剂降低ER-α36或ER-α66多肽的表达，或两者兼而有之。这类试剂包括，但不仅限于，小分子，多肽，核酸适体，抗体等。能降低ER-α36表达的试剂已经被李等专利保护(美国专利申请号20100016352)。本文所用“治疗剂”是指文中所述的多核苷酸和小分子，多肽，核酸适体，抗体等，减少ER-α36多肽，或ER-α66多肽的表达，或两者兼而有之。
在一些实施例中，所用方法包括用治疗试剂的有效浓度接触细胞，如本文所述的一个或多个多核苷酸。接触是指在适合的条件，引入一种治疗剂，如一个或多个多核苷酸进入细胞。“合适”条件指可导致治疗现象发生的条件，包括引入多核苷酸到细胞，或“合适”的条件也指没法防止此类事件发生的条件。因此，这些条件允许，增强，方便于，或有利于该事件发生。本文中所使用的“有效量”涉及到治疗剂的足够量，如一个或多个多核苷酸，以提供所需的效果。例如，在一个实施，“有效量”是有效地缓解一个或多个症状和疾病的迹象的有效量。在一些实施例中，有效量就是能足以导致减少与疾病相关的症状或其标志物水平。疾病症状或迹象减少是指在在可测量的症状上与对照组或没有治疗的个体或用多核苷酸治疗前的个体比较后，减少，例如，至少有10％，至少有20％，至少有30％，至少40％，至少50％，至少有60％，至少有70％，至少80％，至少有90％，或至少有100％。能测量的或可衡量的迹象包括，如细胞内雌激素受体ER-α66多肽表示水平，细胞内雌激素受体ER-α36多肽表示水平水平，细胞对SERM治疗所产生的抗性，肿瘤的发生，血管生成，肿瘤扩散，或两者兼而有之。然而，可以理解的是，就像本文所述，总日常使用的成分和配方的量将通过健全的医疗管理体系内的主治医生决定。正在接受治疗的疾病的类型等因素而定，所需的确切治疗剂量会受诸多因子影响，譬如，不同类性的疾病。
当治疗剂是一种多核苷酸，多核苷酸可能以以下多种形式被引入到一个细胞：双链RNA核苷酸；表达载体，包括一个包括编码和表达的RNA核苷酸的DNA核苷酸的载体。可同时以多于一种类型的多核苷酸给药。例如，可以同时用两个或两个以上的多核苷酸敲除相同的目标mRNA，并在本方法中使用。使用体外模型和动物模型，可以评估本发明涉及多核苷酸是否有效及有效的治疗方法。这种模型是业内皆知的，并且一般认为都是人类疾病经典的模型和评价疾病治疗方法，并被医药业界普遍接受的。一个最好的例子是裸鼠动物模型。例如，乳腺癌细胞可以接种到雌性去卵巢裸鼠的乳腺脂肪体，然后观察病变的形成和评估，例如，通过触诊，游标卡尺测量，肿瘤重量。转基因动物模型也是可用的模型。
这些细胞可在体内或体外。细胞最好是哺乳动物细胞，例如，小鼠，大鼠，灵长类动物(如猴，人)，最好是人细胞。细胞首选的例子包括乳腺细胞，如乳腺癌细胞，卵巢癌，胰腺癌细胞，子宫内膜癌的细胞，和结肠癌细胞。对照细胞可用已知的方法进行培养。示例细胞是ER-α36阳性和ER-α66阳性，包括T47D， HB3396，ZR-75-1。示例细胞是ER-α36阳性但ER-α66阴性，包括SK-BR-3，MDA-MB-231，MDA -MB-436，和MDA-MB-468。细胞表达ER-α66并表示痕量水平的ER-α36，包括MCF7(AT CC#)。对照细胞也可以从组织样本中获得，例如，活检。其他细胞也可以通过以下途径改造，如，克隆多核苷酸编码的多肽到一个表达载体，然后再引入到一个细胞使其表达该多肽。
在一些实施例中，本发明的方法包括对有疾病或有疾病危险的病人用治疗试剂(如本发明中多核苷酸) 的有效治疗剂量给药。对病人给予一种或一种以上本文所述的多核苷酸药的最佳方法，包括手术给药，如切除部分病灶，或器官，或身体某部分，或两者兼而有之。病变部位，器官或身体某部位，包括肿瘤细胞。例如，切除癌细胞后，癌旁组织可用含有一种或一种以上本发明多核苷酸灌注，或用含有一种或一种以上本发明多核苷酸再癌旁组织植入治疗。多核苷酸给药也包括其他常规方法，例如，包括肠外给药，如静脉给药。
在一些实施例中，本发明的方法可能包括确定细胞是否具有某些特征。细胞可来自于原代体外培养，或可直接从人体内分离。在一个实施例中，使用方法包括确定人体内癌细胞的雌激素受体状态。“雌激素受体状态”是指一个细胞的ER-α36或ER-α66的水平，或两者ER-α36和ER-α66的水平。一个细胞可能显示雌激素受体的任意组合。因此，细胞可能是ER-α36阳性(ER-α36+)和ER-α66阳性(ER-α66+)， ER-α36+和ER-α66阴性(ER-α66-)，ER-α36阴性(ER-α36-)和ER-α66+或ER-α36-和ER-α66-。确定细胞内是否ER-α36+或ER-α36-及ER-α66+或ER-α66-的方法可以是常规方法和认可的最好的方法。例如，可用于实时PCR确定编码ER-α36或ER-α66mRNA的量(见例1和2)。另一种方法，包括使用能特异性结合ER-α66多肽或ER-α36多肽的抗体。特异性结合ER-α66的抗体可市场上买到。特异性结合ER-α36的抗体，可以很容易地使用人工合成相对应于ER-α36肽中独特的羧基端20个氨基酸的多肽(见王，美国专利申请公布20070258895)。本文中所使用的抗体，能特异性结合的多肽，只与抗原表位抗原诱导的抗体的交互作用，或与结构相关的抗原表位交互作用。在适当的条件下，特异性结合到一个抗原表位抗体，即使是有多个潜在的结合位点，只能与抗原表位相互作用。
因此，在一些实施方案，本发明的方法包括鉴定病人体内癌细胞是否是ER-α36+和ER-α66+， ER-α36+和EP-α66-，ER-α36-和ER-α66+，或ER-α36-和ER-α66-，以及对病人给药，包括本发明中的多核苷酸。有些病人体内癌细胞，要么是ER-α66-，要么ER-α36+或ER-α36-。而有些病人体内细胞，可能是ER-α36+和ER-α66-。而又有些病人体内细胞是ER-α36+和ER-α66+。还有一些情况下，病人体内细胞是ER，PR及HER2阴性。(也叫”三阴性“)。本文中所使用的细胞被认为是“三阴性”时，指的是雌激素受体阴性(ER-α66-)、孕激素受体(PR)阴性，人表皮生长因子受体2(HER2)阴性(Zhang et al.，2010，Oncogene，October 11，doi：10.1038/onc.2010.458)。这种细胞往往与乳腺癌侵略性的类型密切相关，而且，往往对SERM治疗表现出很强的耐药性。绝大部分三阴性乳腺癌细胞表达ER-α36。
在另一个实施例中，一个方法可能包括决定是否癌症细胞，如乳腺癌细胞，对选择性雌激素受体调节剂(SERM)有抗性。SERMs的例子包括汤吗希芬，雷洛昔芬，噢麦洛昔分芬(ormeloxifene)，氯米芬，肺莫瑞尔(femarelle)，托瑞米芬，艾非莫昔芬(afimoxifene)，阿唑昔芬(arzoxifene)，拉唆佛昔芬 (lasofoxifene)，和苯唑哚昔芬(bazedoxifene)。确定是否人体内的肿瘤细胞是汤吗希芬耐药的方法通常是业内熟悉的技工可以掌握的并可以常规使用的方法。例如，在实施汤吗希芬治疗过程中，对汤吗希芬治疗敏感的肿瘤体积缩小(即，尺寸减小)。如果病人汤吗希芬治疗10到14周后，体内肿瘤大小并没有变小，这类病人被认为是对汤吗希芬治疗有抗性，即，其体内肿瘤含有汤吗希芬耐药癌细胞。给药过程中，病人也可能会出现获得性耐药性，例如，汤吗希芬治疗后肿瘤最初可能会缩小，然后产生耐药性，肿瘤大小开始增加。同样地，确定癌细胞是否汤吗希芬耐药的体外方法通常是业内熟悉的技工可以掌握的并可成为常规方法。这些方法包括细胞培养方法及汤吗希芬体外细胞处理方法。如果与没有用汤吗希芬治疗的对照细胞相比，汤吗希芬治疗细胞的生长，复制，或迁移，或以上的综合性状没有改变，则说明该类细胞对汤吗希芬的治疗有耐药性。
因此，在一些实施方案，本发明的方法包括确定病人体内是否有癌症细胞，该癌症细胞是否对SERM 有抗性，如对汤吗希芬治疗，以及病人给药时的有效剂量确定，如本文描述多核苷酸药剂的有效剂量。实施时，病人体内有汤吗希芬耐药细胞，即通常ER-α36+和ER-α66-。实施例中的细胞指的是乳腺癌细胞。本发明的多核苷酸的有效治疗剂量是指能有效地减少体内汤吗希芬耐药(即，增加对汤吗希芬的敏感性) 的癌细胞。
用非侵入性的技术确定体内细胞是否具有某些特征。例如，通过使用成像技术测量肿瘤大小来确定体内细胞是否对SERM抗性。确定体内细胞是否有某些特征还可能包括其他方法，例如，体内生物样品取样活检。本文中所使用的“生物样品”是指从体内分离的组织或体液样品，包括但不限于，例如，血液，血浆，血清，尿液，骨髓，胆汁，脊髓液，淋巴组织和淋巴液，皮肤样本，外分泌液包括从皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道，眼泪，唾液，乳汁，血细胞，和器官组织。生物样品也包括部分组织，如活检和尸检样品，组织学为目的的冰冻切片。生物样品还包括来自病人组织的植原体和原始或转化的细胞培养。生物样品还包括来自病人体内的细胞样本，以及以前分离的细胞(例如，由他人在不同时间分离的，用于其他目的所留下的样品)。归档的库存组织，如那些有详细医学资料和背景知识的组织和体液样品，这些样品有在利用研究价值。
本发明所描述的多核苷酸还可以与其他治疗性化合物的人体给药相结合，以提高整体治疗效果。此处所描述的对疾病治疗有用的治疗性化合物是已经知道的，并已在临床上使用的常用药。多种可用的抗肿瘤药物，可作为次级，辅助性治疗试剂，以增强在本发明所描述的多核苷酸的活性。有些实施例中，其他治疗化合物就是一些抗癌药物。在有些实施例中，治疗化合物是一些化疗药物，如顺铂，派克西西托(paxicital) 等。在有些实施例中，治疗性化合物是放射治疗剂。有用的化疗药物的例子包括，例如，依托泊苷和替尼泊苷，包括环磷酰胺，异环磷酰胺，氮芥马法兰；乙基叶利米(ethylenimines)和甲基三聚氰胺，包括六溴甲基三聚氰胺和塞替派等；嘧啶类似物，包括氟尿嘧啶和氟去氧尿嘧啶；长春花生物碱类药物，如长春碱； epipodophyllo毒素，包括依托泊苷和替尼泊苷；抗生素，如放线菌素D，阿霉素，博莱霉素，和神霉素；生物应急调节剂，如干扰素，顺铂和卡铂的铂配合物的生物反应调节剂；雌激素，如已烯雌酚和炔雌醇；抗雄激素，如流感组胺；促性腺激素释放激素类似物，如醋酸亮丙瑞林。其他化合物，如去碳水化合物吖嗪，亚硝基脲，甲氨蝶呤，地替森(diticene)，甲基苄肼和其他化合物也是有效的。在一些实施例中，SERM 治疗也可能包括多核苷酸给药。其他一些已知的，并在临床上广泛应用的化疗药物，虽然没能一一例举，但也应该包括在内。
本发明还包括决定是否使用本文所述的方法可能会增加在受癌细胞SERM的敏感性的方法。在一个实施例中，该方法包括从人体内取得生物样品，其中的生物样品，包括SERM耐药的肿瘤细胞，并确定SERM 耐药癌细胞的雌激素受体状态。在一个实施例中，SERM是指汤吗希芬。确定SERM耐药癌细胞的雌激素受体状态，包括确定ER-α36的表达。如果SERM耐药细胞中ER-α36高表达，用本发明所述的方法治疗，可提高癌症细胞对SERM的敏感度。这种方法也以用来评估对癌症治疗的效果。例如，选择治疗试剂时，本发明所述的多核苷酸试剂可能是合适的。
确定SERM耐药癌细胞的雌激素受体状态，可能还包括确定ER-α66、HER2及孕激素受体表达。任何组合表达ER-α36，ER-α66，HER2和孕激素受体可以检测。因此，在一些实施方案，确定是否是SERM 耐药细胞，只要确定是否ER-α36和ER-α66阳性，或ER-α36阳性和ER-α66阴性。在实施例中，SERM 耐药细胞是ER-α36阳性，ER-α66阴性，孕激素受体阴性，和HER2阴性。
本发明还包括用于诊断体内是否有，或有风险会发展为癌症的方法。这些方法包括定量测定来自人体内的生物样品微小核糖核酸(如，let-7，miR-375，miR-21)的水平。来自体内生物样品的微小核糖核酸(如let -7，miR-375，miR-21)水平(与对照比较)增高(如，miR-21)或降低(如，let-7，miR-375)说明，有癌症或有风险会发展成为癌症。微小核糖核酸增加或降低不同的程度可作为预测癌症发生风险的指标。癌症可能指的是对雌激素敏感肿瘤，如乳腺癌，卵巢癌，胰腺癌，子宫内膜癌，肺癌或结肠癌。在一个实施例，乳腺癌是指早期的乳腺癌，如导管原位癌(DCIS)。人体内可能会显示更多的癌症的迹象中的一种，并可能会显示某癌症的一个或多个症状。在一个实施例子中，使用的法也可能会包括对人体给药的方法，包括本发明中的多核苷酸，如，增加本发明多核苷酸在癌症个体内地水平以达到有效治疗癌症的方法。
所测定的微小核糖核酸也可能是测量体内来自微小核糖核酸基因(如let-7，miR-21)原型转录因子(“Pri miRNA”)，或中间态的微小核糖核酸(“pre-mRNA“)，或转录加工后的(例如，成熟)RNA转录子。原型转录因子(“Pri miRNA”)可能包括本发明所描述的微小核糖核酸的侧翼序列。
微小核糖核酸在生物样品中的表达水平可以使用合适的技术去检测生物样品中RNA的表达水平。合适的技术的例子包括Northern blot和qRT-PCR分析和掌握这些技术的技工。在一个实施例中，采用 Northern blot分析let-7微小核糖核酸的水平，。例如，核酸存在于生物样品，如血液，血浆，血清或尿液中的核酸，通过沉淀，用DNase除掉DNA。然后，RNA分子用标准技术，通过琼脂糖凝胶电泳将其分开，并转移到硝酸纤维素膜上。然后，通过使用适当的标记的与之互补的DNA或RNA作为探针，特异性地测量和检测RNA(见，例如，分子克隆实验手册，Sambrook等人合编，第2版，冷泉港实验室出版社，1989 年，第7章)。
let-7miRNA的Northern杂交所用的合适的探针可以从核酸序列获得，包括但不限于，探针，即，与 let-7微小核糖核酸互补或基本互补的核苷酸序列。标记DNA和RNA探针的制备方法，及后续与目标序列的杂交条件，在分子克隆描述：实验室手册里有详细的描述(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J. Sambrook等人，EDS，第2版，冷泉港实验室出版社。1989年，第10章和第11)。核苷酸探针可用以下方法标记，如放射性核素，如3H，32P，33P，14C，或35S；重金属；能够作为标记的配体(例如，生物素标记核酸探针抗生物素蛋白或抗体)；荧光分子，化学发光分子；或酶或其类似物。
生物样品中的微小核糖核酸水平可用反转录聚合酶链反应(RT-PCR检测)来测定。微小核糖核酸在样品中的绝对量可以通过与内部标准相比较后来测定的，例如，可以通过同一样品中存在的“看家”基因的表达水平来定量测定。目前，可作为内部标准的合适“看家”基因包括，例如，RU48基因。用来定量和半定量的RT-PCR技术，是目前众所周知的用来测量的方法。
对照生物样品可从正常人体获得，即，没有癌症迹象或者症状的人群。微小核糖核酸将分别从对照生物样品与病人样品在相同的条件下提取，并用于测定，以比较其在生物样品中的差异。参照用的微小核糖核酸在生物样品的表达水平也可以作为对照。
本发明还包括试剂能增加细胞内的微小核糖核酸如let-7量的方法。该方法包括用该试剂怎样处理细胞，如癌细胞。这些细胞可能包括，例如，乳腺癌细胞，卵巢癌，胰腺癌细胞，子宫内膜癌的细胞，或结肠癌细胞。癌细胞可能是以下ER-α36阳性或ER-α36阴性和ER-α66阳性或ER-α66阴性中的任意组合。在一个实施例中，肿瘤细胞是乳腺癌细胞ER-α36阳性。癌细胞可能是孕激素受体阳性或孕激素受体阴性，也可能是HER2阳性或HER2阴性。在一个实施例中，肿瘤细胞是三重阴性乳癌细胞(即ER-36α阳性， ER-α66阴性，孕激素受体阴性，和HER2阴性)。
该方法还包括细胞培养方法、合适的细胞培养条件、所用细胞及试剂、以及定量测量在细胞中微小核糖核酸let-7量的方法。微小核糖核酸let-7也许在细胞的细胞质或细胞核中。当与没有用该试剂处理的对照组细胞相比较，处理过的细胞含有更多的微小核糖核酸let-7，这说明，该试剂能增加细胞内微小核糖核酸let-7的量。这类试剂可能是一种化合物，其中包括，例如，一种有机化合物，无机化合物，金属，多肽，非核糖体多肽，聚酮，或肽类化合物。这些潜在的试剂来源于，例如，化合物库，植物细胞提取物和其他蔬菜水果。
本发明还包括临床检测中所用方法及所用的试剂盒。试剂盒应包括一种或多种多核苷酸试剂，并且，被装在合适的、至少能供一次使用的包装盒内。另外，本发明方法中所用的其他试剂，如缓冲液和其他溶液试剂也应该包括在试剂盒内。通常，这样的试剂盒内还应该包括使用说明书。
这里使用的术语，“包装材料”是指用来包裹检测试剂所需要的一个或多个物理结构的包装盒。包装盒可以用大家熟知的方法来打造，并保证能提供一个理想化的无菌、无污染的环境。包装盒上要有一个标签，明确标明，本发明方法中要用的试剂，包括多核苷酸或抗体等。此外，包装盒内还应该有说明书，将明确说明，如何利用试剂盒内所提供的试剂进行检测。本文中所使用的术语“包裹”是指一个固体但能防冲撞的网状结构材料，或其它结构材料，如玻璃，塑料，纸张，铝箔，以及其类似物，并且能够稳定地把这些多核苷酸，或抗体装下来的器皿。例如，一个包裹，可以是一个能装适当数量的多核苷酸或抗体的玻璃小瓶。“使用说明书”通常应明确地说明，检测时，如何正确使用试剂盒内的试剂进行检测。
实例1
微小核糖核酸如let-7家族调节乳腺癌中雌激素受体α的信号传递(请看文章：Zhao Y，Deng C， Wang J，Xiao J，Gatalica Z，Recker RR，Xiao GG.Let-7 family miRNAs regulate estrogen receptor alpha signaling in estrogen receptor positive breast cancer.Breast Cancer Res Treat.2011 May；127(1)：69-80.Epub 2010Jun 10.)。
实例2
微小核糖核酸如let-7家族通过下调雌激素受体α的信号传递提高乳腺癌对汤吗希芬的敏感性(请看文章：Zhao Y，Deng C，Lu W，Xiao J，Ma D，Guo M，Recker RR，Gatalica Z，Wang Z，Xiao GG. Let-7 microRNAs Induce Tamoxifen Sensitivity by Down-Regulation of Estrogen Receptor Alpha Signaling in Breast Cancer.Molecular Medicine，2011 in press)。