番茄腺毛性状的连锁标记及其应用的制作方法

本发明涉及一种番茄腺毛性状的连锁标记及其应用。
背景技术：
：番茄是世界上广泛生产和消费的一种重要的蔬菜作物，其在生长发育过程中常遭受多种病虫害的危害。番茄的腺毛及其次生代谢产物与其对昆虫的防御性密切相关，腺毛分泌物对多种植食性昆虫表现出趋避和毒杀作用。因此，利用分子标记辅助育种方法选择腺毛较密的番茄品种在生产上对于提高番茄产量、降低农药使用量具有重要意义。传统方法主要靠肉眼鉴定腺毛的密度，但该方法具有很大的局限性。绝大多数番茄品种的腺毛密度在定植前的幼苗期并无显著差别，难以通过肉眼鉴别。而利用分子标记辅助选择(marker-assistedselection，mas)技术可以在番茄幼苗期快速高效地鉴定出不同腺毛密度地番茄植株，从而选择所需的品种进行定植。目前，关于番茄的腺毛密度，还没有可应用于生产中的分子标记，因此，开发能够被广泛利用于育种中的标记，变得尤为重要。技术实现要素：本发明的目的是提供一种番茄腺毛性状的连锁标记及其应用。本发明提供了一种特异引物对；所述特异引物对由引物f和引物r组成；所述引物f为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链dna分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代且与序列1具有相同功能的dna分子；所述引物r为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链dna分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的dna分子。所述特异引物对的用途为如下(b1)-(b6)中的至少一种：(b1)鉴定或辅助鉴定番茄腺毛性状；(b2)筛选或辅助筛选具有腺毛的番茄；(b3)筛选或辅助筛选腺毛缺失的番茄；(b4)制备用于鉴定或辅助鉴定番茄腺毛性状的试剂盒；(b5)制备用于筛选或辅助筛选具有腺毛的番茄的试剂盒；(b6)制备用于筛选或辅助筛选腺毛缺失的番茄的试剂盒。本发明还保护所述特异引物对的应用，为如下(b1)-(b6)中的至少一种：(b1)鉴定或辅助鉴定番茄腺毛性状；(b2)筛选或辅助筛选具有腺毛的番茄；(b3)筛选或辅助筛选腺毛缺失的番茄；(b4)制备用于鉴定或辅助鉴定番茄腺毛性状的试剂盒；(b5)制备用于筛选或辅助筛选具有腺毛的番茄的试剂盒；(b6)制备用于筛选或辅助筛选腺毛缺失的番茄的试剂盒。本发明还保护含有所述特异引物对的试剂盒；所述试剂盒的应用为如下(c1)-(c3)中的至少一种：(c1)鉴定或辅助鉴定番茄腺毛性状；(c2)筛选或辅助筛选具有腺毛的番茄；(c3)筛选或辅助筛选腺毛缺失的番茄。本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将所述特异引物对中的各条引物进行独立包装的步骤。本发明还保护鉴定或辅助鉴定番茄果实腺毛性状的方法(方法甲)，包括如下步骤：以待测番茄的基因组dna为模板，采用所述特异引物对进行pcr扩增，如果pcr扩增产物中具有171bp的dna片段、待测番茄为或候选为具有腺毛的番茄，如果pcr扩增产物中具有193bp的dna片段且不具有171bp的dna片段，待测番茄为或候选为腺毛缺失的番茄。本发明还保护鉴定或辅助鉴定番茄果实腺毛性状的方法(方法乙)，包括如下步骤：检测待测番茄基因组dna中是否含有特异dna片段甲和特异dna片段乙，如果所述基因组dna中含有特异dna片段甲、待测番茄为或候选为具有腺毛的番茄，如果所述基因组dna中含有特异dna片段乙且不含有特异dna片段甲、待测番茄为或候选为腺毛缺失的番茄。所述特异dna片段甲为序列表的序列3所示的dna分子；所述特异dna片段甲为序列表的序列4所示的dna分子。所述特异dna片段甲或特异dna片段甲均位于番茄10号染色体39kb的区间内。本发明还保护一种筛选或辅助筛选腺毛丰富的番茄的方法(方法丙)，包括如下步骤：(d1)按照所述方法甲或所述方法乙鉴定待测番茄腺毛性状；(d2)基于步骤(d1)的结果筛选或辅助筛选具有腺毛的番茄。本发明还保护一种筛选或辅助筛选腺毛缺失的番茄的方法(方法丁)，包括如下步骤：(e1)按照所述方法甲或所述方法乙鉴定待测番茄腺毛性状；(e2)基于步骤(e1)的结果筛选或辅助筛选腺毛缺失的番茄。本发明还保护所述特异引物对或以上任一所述方法在番茄育种中的应用。本发明还保护番茄育种方法，为方法a或方法b。所述方法a包括如下步骤：将所述方法丙筛选得到的具有腺毛的番茄作为育种材料。所述方法b包括如下步骤：将所述方法丁筛选得到的腺毛缺失的番茄作为育种材料。以上任一所述待测番茄具体可为番茄‘moneymaker’(solanumlycopersicum‘moneymaker’)及其自交后代。所述番茄‘moneymaker’(solanumlycopersicum‘moneymaker’)在tomatogeneticsresourcecenter的代码为la2706。以上任一所述待测番茄具体可为醋栗番茄solanumpimpinellifolium及其自交后代。所述醋栗番茄solanumpimpinellifolium在tomatogeneticsresourcecenter的代码为la1375。以上任一所述待测番茄具体可为番茄‘moneymaker’(solanumlycopersicum‘moneymaker’)和醋栗番茄solanumpimpinellifolium的杂交后代。本发明首次利用分子标记辅助育种的方法，开发了番茄腺毛的连锁标记，并在近等基因系群体中进行了验证。利用番茄腺毛连锁标记来选育腺毛密度较高的抗虫番茄品种可以在番茄的幼苗期就进行鉴定，不需要等到定植后再进行表型测定，大大提早了鉴定时间，缩短了不必要的种植面积，减少了人力和物力的消耗。附图说明图1为bc4f2群体连锁标记引物鉴定结果。图2为nil群体腺毛性状表型鉴定结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。番茄‘moneymaker’，英文名称为solanumlycopersicum‘moneymaker’，是一种栽培品种，整个植株均有腺毛分布。tomatogeneticsresourcecenter，代码为la2706。醋栗番茄solanumpimpinellifolium，为野生近缘种，整个植株均无腺毛分布。tomatogeneticsresourcecenter，代码为la1375。实施例1、连锁标记的发现1、以番茄‘moneymaker’和醋栗番茄solanumpimpinellifolium为亲本进行杂交，并按单粒传法获得由200个重组自交系构成的f10代rils群体。2、通过对步骤1得到的rils群体进行重测序及腺毛相关性状的全基因组关联分析，获得了一个与腺毛相关性状的qtls(p值为5.94e-18)，位于10号染色体39kb的区间内。在此区间内设计合成了一对可应用的连锁标记引物对(由引物f和引物r组成)，引物信息如表1所示。表1引物信息引物名称引物序列(5’-3’)faaattggacaattggtccac(序列表的序列1)rgagcaaatcctactacttttg(序列表的序列2)实施例2、使用连锁标记引物对鉴定待测番茄基因型的方法的建立提取待测番茄的基因组dna，以基因组dna为模板，采用引物f和引物r进行pcr扩增，将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。如果pcr扩增产物中具有171bp的dna片段且不含有193bp的dna片段，则将待测植株定义为mm纯合型；如果pcr扩增产物中具有193bp的dna片段且不具有171bp的dna片段，则将待测植株定义为pp纯合型。采用上述方法对番茄‘moneymaker’和醋栗番茄solanumpimpinellifolium进行鉴定，番茄‘moneymaker’为mm纯合型，醋栗番茄solanumpimpinellifolium为pp纯合型。实施例3、连锁标记引物对在判断番茄腺毛性状中的应用1、从实施例1构建的重组自交系rils群体中选择sl021株系(经抽样检测，该株系所有植株均为mm纯合型)和sl134株系(经抽样检测，该株系所有植株均为pp纯合型)。2、以sl021株系和sl134株系为亲本杂交，得到f1代植株；将f1代植株与亲本sl021株系回交3代，再自交一代，获得bc4f2群体。3、从步骤2得到的bc4f2群体中随机选取85棵单株，提取基因组dna。4、检测基因型待测番茄分别为番茄‘moneymaker’、醋栗番茄solanumpimpinellifolium和步骤3得到的85棵单株。采用实施例2的方法检测待测番茄的基因型。部分待测番茄的电泳图见图1。图1中，向上箭头指向的为番茄‘moneymaker’，显示一条特异条带(命名为特异条带1)，向下箭头指向的为醋栗番茄solanumpimpinellifolium，显示一条特异条带(命名为特异条带2)，其余泳道分别为步骤3得到的不同单株(有的与番茄‘moneymaker’带型一致，有的与醋栗番茄solanumpimpinellifolium带型一致，有的显示为番茄‘moneymaker’和醋栗番茄solanumpimpinellifolium的叠加带型)。将番茄‘moneymaker’以及与番茄‘moneymaker’带型一致的各个单株中的特异条带均进行测序，均如序列表的序列3所示(171bp)，这些单株均为候选mm纯合型单株。将醋栗番茄solanumpimpinellifolium以及与醋栗番茄solanumpimpinellifolium带型一致的各个单株中的特异条带均进行测序，均如序列表的序列4所示(193bp)，这些单株均为候选pp纯合型单株。将显示为番茄‘moneymaker’和醋栗番茄solanumpimpinellifolium的叠加带型的各个单株中的两条特异条带均进行测序，其中一条特异条带均如序列表的序列3所示(171bp)，其中另一条特异条带均如序列表的序列4所示(193bp)，这些单株均为杂合型。5、取步骤4鉴定为mm纯合型的所有单株、鉴定为pp纯合型的所有单株和鉴定为杂合型的所有单株作为待测样本，进行腺毛表型鉴定。结果如图2所示。图2中，1为mm纯合型植株的腺毛表型，2为pp纯合型植株的腺毛表型。结果表明，85棵单株中的mm纯合型植株表型全部显示图2中的有腺毛表型(85棵单株中的杂合型植株也显示相同表型)，主要显示在植株茎段和幼嫩新鲜组织区域；而85棵单株中的pp纯合型植株表型全部显示图2中的腺毛缺失表型，看不到明显的腺毛，整个植株表皮呈现光滑的表型。因此，说明该位点是与控制植株腺毛性状紧密连锁主要的位点，该标记可应用于腺毛性状的鉴定。<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所<120>番茄腺毛性状的连锁标记及其应用<160>4<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1aaattggacaattggtccac20<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2gagcaaatcctactacttttg21<210>3<211>171<212>dna<213>番茄（lycopersiconesculentummill.）<400>3aaattggacaattggtccactttttctaaaatagttgaagacaacccataaatagctata60taccataaatatagtccaaaaatattgtactactaatttgtacgagacattttctttaaa120aaaattcacccaaaataggattgtttttttcaaaagtagtaggatttgctc171<210>4<211>193<212>dna<213>番茄（lycopersiconesculentummill.）<400>4aaattggacaattggtccactttttctaaaatagttgaagacaacccataaatagctatt60taccatagatatagtccaaacataccataaatatagtccaaacatattgtactactaatt120tgtatgagacatttcctttaaaaaaattcacccaaaatagaattgtttttttcaaaagta180gtaggatttgctc193当前第1页12