本发明涉及进化生物学研究领域，具体地，本发明涉及提取林木组织或器官rna的方法和鉴定林木组织特异性mirna的方法。
背景技术：
：dna测序技术在当代生物学领域具有重要的应用价值。自1977年sanger发明链终止法测序方法以来，dna测序技术经历了迅速发展。随后的二、三代测序技术以高通量为共同特征，也被称为“新一代测序技术(ngs)”。roche公司的454测序平台、illumina公司的solexa测序系统以及abi公司的solid测序系统标志着第二代测序技术诞生，且各平台具有各自的优势。尽管各系统在高通量水平、测序准确度、技术方法上各有差异，但共同特征是大大降低了测序成本并极大地提高了测序通量。然而，二代测序使用激光识别测序反应位点并进行cluster定位，如果测序dna片段缺少某一种碱基，将会导致图片无法合并以及cluster定位，导致数据浪费。因此设计高效的、物种特异的、具有碱基多样性的条形码序列(barcode)在多样本测序中尤为重要。mirna可以影响一系列生物学过程，包括生长、发育与分化过程。利用dna测序技术鉴定mirna是常用的一种技术。该方法已经成功运用于在人类(human)、大豆(soybean)、栓住螺母(quercussuber)、拟南芥(arabidopsis)的mirna发现及单个组织mirna的探测。然而，组织特异性表达的mirna因其功能的不确定性主要在动物领域研究较多，植物领域极少研究，尤其是林木领域则是空白。此外，针对林木基因组序列杂合度高，序列复杂，目前没有针对林木的特异条形码序列(barcode)，且没有高效的方法可以同时对林木多个组织表达的mirna进行高度平行性高通量测序检测。技术实现要素：本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提供了一种林木组织特异性表达的mirna的高通量检测方法，该方法与dna测序手段相比，大大简化了测序流程，本发明需要更少的样品量，减少了重复上机测序的次数，由于整个文库构建只需要一次完成，保证了样品间测序较好的均一性，弥补了高通量测序技术检测林木组织性特异表达的mirna的空白。在本发明的第一方面，本发明提出了一种提取林木组织或器官rna的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将待处理样品与交联聚乙烯吡咯烷酮(pvpp)进行第一接触，并在液氮条件下进行研磨处理，将研磨处理后产物与trizol、β-巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮(pvp)进行第二接触。发明人发现，在研磨过程中加入交联聚乙烯吡咯烷酮(pvpp)，pvpp具有崩解的作用，可以以更快的速度裂解细胞，提高研磨效率。pvp中的co-n＝基有很强的结合多酚的能力，减少了酚类被氧化的机会，且β-巯基乙醇是一种较强的还原剂，使多酚不易被氧化，并可经抽提去除。利用根据本发明实施例的上述方法，避免了因植物组织中富含多糖、酚类、色素等物质而导致rna提取效率和成功率不高的缺陷，利用上述方法，植物组织rna的提取效率和成功率显著提高，同时发明人发现，相比于现有技术，节约了约80％的样品用量，极大方便了微量样品的测序。根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：(1)将第二接触后所得混合物与无水乙醇、kac和氯仿/异戊醇混合液进行第三接触，冰置处理10min；(2)将步骤(1)所得混合物进行第一离心处理，并将第一离心处理后的上层水相与氯仿进行第四接触，并将第四接触后产物进行震荡、静置和第二离心处理；(3)将步骤(2)第二离心处理后上清与异丙醇和naac进行第五接触，并进行冰置、第三离心处理，以便获得rna粗产物；(4)将步骤(3)所得rna粗产物进行洗涤处理；(5)将步骤(4)所得洗涤处理产物进行第四离心和干燥处理，将干燥处理后产物与rnase-free水和dna消化酶进行第六接触，将第六接触后产物进行水浴处理，并将水浴后产物与等体积的氯仿和异戊醇进行第七接触，将第七接触后产物进行第四离心处理；以及(6)将步骤(5)所得第四离心处理后产物与无水乙醇和naac进行第八接触，将第八接触后产物进行静置和第五离心处理，收集沉淀物，所得沉淀物为样本rna产物。发明人发现，在上述方法中，通过两次加入naac，使多糖溶解，最后在nacl中再次析出，可有效去除大部分多糖。根据本发明的实施例，基于0.1g的待处理样品，所述交联聚乙烯吡咯烷酮(pvpp)的用量为20mg。所述trizol的用量为10微升，所述β-巯基乙醇的用量为1体积％，所述pvp的用量为1体积％。发明人发现，在上述用量下，对植物组织样品rna的提取效率进一步提高。根据本发明的实施例，在步骤(3)中，所述异丙醇的用量为所述上清总体积的2/3体积。发明人发现，在上述用量下，对植物组织样品rna的提取效率进一步提高。根据本发明的实施例，进一步包括：以rnsae-free水为空白对照，使用nanodrop仪测定所述rna产物的a260与a280值，基于a260与a280值判定rna产物的纯度和总量，使用agilent2100仪测定完整度，基于完整度判定rna产物的完整性，其中，a260与a280值在2.00-2.08，是rna产物纯度合格的指示，完整度在7.5～8.6，是rna产物具有完整性的指示。利用上述方式筛选出的纯度合格和完整性合格的rna产物用于构建cdna文库和高通量测序，测序结果更加真实有效，能够更加有效地鉴定林木组织特异性mirna。在本发明的第二方面，本发明提出了一种鉴定林木组织特异性mirna的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用前面所述的方法提取林木组织或器官rna；利用所提取的rna构建cdna文库；基于cdna文库进行高通量测序；以及根据测序结果及mirna筛选标准，鉴定林木组织特异性表达的mirna。本利用根据本发明实施例的上述方法，实现了高通量测序技术检测林木组织性特异表达的mirna，检测效率、成功率和真实性高。根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述cdna文库是通过如下方式构建的：smallrna两端加林木特异接头-条形码，所述林木特异接头-条形码为接头中含有组织特异性标记序列的条形码。发明人发现，林木特异性的接头-条形码序列，降低了碱基的不均一性，提高了碱基复杂度、多样性、测序通量和组织间测序的均一性。根据本发明的实施例，所述组织或器官的数量至少为5个。发明人发现，随着组织个数的增加，检测到的mirna数目逐渐增多，但是5个组织之后，趋势明显放缓，说明5个组织已经几乎可以检测到所有的mirna，因此选择至少5个组织进行物种mirna的检测。根据本发明的实施例，所述林木特异的接头-条形码序列包括正链和负链，所述正链具有seqidno：1所示的核苷酸序列，所述负链具有seqidno：2所示的核苷酸序列。caagcagaagacggcatacgagatxxxxxxatgtgactggcca(seqidno：1)。gtcagatcggaagagcggttcagcaggaatgccgag(seqidno：2)。其中，正链链中xxxxxx代表林木组织特异性条形码序列。发明人发现，具有上述核苷酸序列的林木特异性的接头-条形码序列，进一步降低了测序引物的随机结合和假阳性，进一步提高了测序通量和组织间测序的均一性。根据本发明的再一具体实施例，每个样品所述条形码序列(barcode)具有seqidno：3～42所示核苷酸序列的之一。gaagaa(seqidno：3)。caagaa(seqidno：4)。agagaa(seqidno：5)。ggagaa(seqidno：6)。tcagaa(seqidno：7)。gcagaa(seqidno：8)。ttcata(seqidno：9)。gtcata(seqidno：10)。ccaata(seqidno：11)。aatata(seqidno：12)。tatata(seqidno：13)。gatata(seqidno：14)。catata(seqidno：15)。attata(seqidno：16)。actata(seqidno：17)。gagtta(seqidno：18)。cagtta(seqidno：19)。ttgtta(seqidno：20)。ctgtta(seqidno：21)。aggtta(seqidno：22)。tggtta(seqidno：23)。cggtta(seqidno：24)。cagtta(seqidno：25)。ccctta(seqidno：26)。acctta(seqidno：27)。tcgtta(seqidno：28)。ctactta(seqidno：29)。agctta(seqidno：30)。tgctta(seqidno：31)。ccagta(seqidno：32)。ggagta(seqidno：33)。tcggaa(seqidno：34)。gcggaa(seqidno：35)。ccggaa(seqidno：36)。gttcaa(seqidno：37)。aggtta(seqidno：38)。tactta(seqidno：39)。ctcata(seqidno：40)。aagtta(seqidno：41)。gccgaa(seqidno：42)。根据本发明的实施例，所述cdna文库为经琼脂糖凝胶电泳回收得到的95-112bp的cdna片段。经琼脂糖凝胶电泳回收得到的95-112bp的cdna片段为林木组织特异性cdna文库。本发明的技术方案充分利用了林木基因组的高杂合度，序列复杂的特点，设计了林木特异性的接头-条形码序列，降低了碱基的不均一性，提高了碱基复杂度、多样性、测序通量和组织间测序的均一性；充分考虑植物组织富含多糖、酚类、色素的等物质的特点，提高了rna提取的效率和成功率；同时节约了80％的样品的使用量，极大方便了微量样品的测序。附图说明构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：图1为根据本发明实施例的使用至少使用5个组织进行mirna检测的原因结果图；图2为根据本发明实施例的进行cdna文库构建的示意图；以及图3根据本发明实施例的杨树组织特异性mirna的数目及表达量结果图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。为了解决无完整技术流程筛选林木组织特异性的mirna的问题，本发明提供了一种基于新的研究策略而形成的鉴定方法，该方法包括以下步骤：s1，选取林木不同组织，其中样品用量为0.1g；s2，改良trizol法分别从各个组织提取总rna；s3，smallrna两端加林木特异的接头-条形码(adapter-barcode)，接头(adapter)中含有组织标记序列条形码(barcode)，构建组织特异性cdna文库，回收95-112bp的rna片段；s4，采用二代测序分析系统对建立的cdna文库进行测序，并对文库质量进行控制；s5，根据测序结果及mirna筛选标准，鉴定筛选出林木组织特异性表达的mirna；上述技术方案充分考虑了林木基因组杂合度高、dna序列多态性丰富、组织多糖、色素、酚类含量高等特点，对已有的总rna提取方法进行改进，从而使得rna提取成功率从原来的50％达到现在85％，且样品使用量从原来的的0.5g降低到现在的0.1g，节约了80％的样品的使用量；同时对特有的mirna的筛选方法进行全面整合及优化，克服了以往无法同时对林木组织特异性mirna进行同时检测的缺陷。根据本发明所提供的技术方案，逐步解释每一个步骤的具体实施过程。关于步骤s1，从各个组织提取总rna，其目的在于通过选取代表性的植物组织或者器官，从而避免因为取样不全对mirna全面探测产生影响。具体而言，本发明的发明人利用同一植株的至少5个不同组织进行mirna的探测。通常物种特异的mirna具有组织特异性表达的特点，但随着组织样品的增加，测序费用也在增加，经过研究，如图1所示，使用至少5个组织来探测mirna可以达到较好的效果，mirna检测数目基本可以达到饱和。为保证rna不被降解，在本发明提供的具体实施例中，对各组织的分离是在液氮环境下进行的。关于步骤s2,各样品中提取总rna。现有技术中，提取植物总rna的方法有很多种，但目前存在的方法提取富含多糖、多酚、色素的杨树叶片rna效果并不好。。在本发明的具体实施方式中采用改良的trizol法对杨树叶片rna进行提取。trizol主要成分是苯酚和异硫氰酸胍，是一种新型总rna抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总rna，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。trizol在破碎和溶解细胞时能保持rna的完整性，因此对纯化rna及标准化rna的生产十分有用。pvpp具有崩解的作用，可以以更快的速度裂解细胞，提高研磨效率。pvp中的co-n＝基团有很强的结合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机会，同时加入还原剂巯基乙醇，能够打断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提去除。本发明是针对多酚、色素、多糖含量较高的杨树叶片，本发明采用改良后的trizol方法提取杨树叶片rna更加有效，极大减少了样品的使用量。常规的trizol方法可包括如下实施步骤：液氮研磨不同组织或器官成粉末(维持一定的液氮水平)，将粉末加入预冷的离心管，加入1mltrizol提取液，充分混匀，并用枪吹打混匀；加入0.25ml氯仿，震荡并静置5min。4℃,13000rpm,15min。重复3-4次；转移上清至预冷的新离心管，加入异丙醇，温柔地混匀，冰上静置10min。4℃,12000rpm,10min；弃上清，75％乙醇洗涤沉淀2-3次；1000rpm，5min，收集沉淀，彻底去除75％乙醇，稍干燥后用适量rnase-free水溶解rna，并利用dna消化酶去除dna，在37℃温度下水浴，加入等体积的氯仿和异戊醇，混匀后离心分离；将步骤s15得到的所述上清液分装到1.5ml的离心管中，然后加入无水乙醇和naac，混匀后，-20℃静置并沉淀，在4℃下离心分离,弃上清液，收集沉淀物，分离得到所述总rna。本发明提供的改良后的trizol法的具体流程为：s21，样品置于制冷研钵中，加入交联聚乙烯吡咯烷酮粉(pvpp)，液氮研磨不同组织或器官成粉末，将粉末加入预冷的离心管，加入1mltrizol提取液、1％β-巯基乙醇和1％pvp，充分混匀，并用枪吹打混匀；s22,每管+150μl无水乙醇+100μl5mol/l的kac(ph4.8)，混匀后缓缓+200μl氯仿/异戊醇(24:1)，冰上静置10min；s22，4℃、12000r/min离心20min，上层水相加入0.25ml氯仿，震荡并静置5min。4℃,13000rpm,15min。重复3-4次；s23,转移上清至预冷的新离心管，加入异丙醇和1/10体积的3mol/lnaac，温柔地混匀，冰上静置10min。4℃,12000rpm,10min；s24,弃上清，75％乙醇洗涤沉淀2-3次；s25，1000rpm，5min，收集沉淀，彻底去除75％乙醇，稍干燥后用适量rnase-free水溶解rna，并利用dna消化酶去除dna，在37℃温度下水浴，加入等体积的氯仿和异戊醇，混匀后离心分离；s26,将步骤s25得到的所述上清液分装到1.5ml的离心管中，然后加入75％无水乙醇和naac，混匀后，-20℃静置并沉淀，在4℃下12000r/min离心30min,弃上清液，收集沉淀物，分离得到所述总rna。改良后的提取方法，在研磨过程中加入pvp，其中的co-n＝基有很强的结合多酚的能力，减少了酚类被氧化的机会。β-巯基乙醇是一种较强的还原剂，使多酚不易被氧化，经抽提去除。本方法借助盐浓度来去除多糖的影响，通过两次加入naac，使多糖溶解，最后在nacl中再次析出，有效去除大部分多糖。完成上述步骤后，可进一步对得到的总rna进行测试和计算，以rnsae-free水为空白对照，使用nanodrop检测rna的纯度(a260与a280值)，判定rna样品的纯度并计算其总量；通过agilent2100仪器判断rna样品的完整性。在本发明提供的筛选方法中，优选地，上述步骤s3，根据提取出的各个组织总rna建立cdna文库的方法包括，具体建立cdna文库的流程参考图2：s31，纯化所述总rna；s32，使用smallrnasampleprekit构建文库，构建文库时，使用接头-条形码序列，包括正链和负链，用于区分不同cdna文库。具体为：正链：5‘caagcagaagacggcatacgagatxxxxxxatgtgactggcca3’，负链：5’gtcagatcggaagagcggttcagcaggaatgccgag3’，其中：正链链中xxxxxx代表林木组织特异性条形码序列。优选的，所述步骤s3，不同组织条形码序列包括40条，具体为：然后反转录合成cdna；s33随后经过pcr扩增，page胶电泳分离目标dna片段，切胶回收95-112bp的片段，得到的即为组织特异性的cdna文库。关于s4，对不同组织或器官cdna文库进行测序；测序数据经过严格过滤，包括：1、去除低质量reads(质量值sq<＝5的碱基数占整个read的50％以上的reads)；2、去除n(n表示无法确定碱基信息)的比例大于10％的reads；3、去除有5’接头污染的reads；4、去除没有3’接头序列和插入片段的reads；5.trim掉3’接头序列；6、去除polya/t/g/c的reads(大部分连续的polya/t/g/c，可能来源于测序错误，且信息熵低，可以不做分析)关于s5，根据测序结果及mirna筛选标准，鉴定筛选出林木组织特异性表达的mirna。具体而言，包括：1、将测序读长使用bwa软件比对到杨树基因组(populustrichocarpa)，筛选得到能够比对上的测序读长；2、比对上的测序读长使用blast跟rfam数据库比对，过滤去除非mirna序列，留下比对上的mirna读长；3、mirna前体序列鉴定使用mirdeep软件，首先将过滤后的读长比对到杨树基因组(populustrichocarpa)，得到前体序列，再将前体序列比对到mirbase数据库，错配碱基数目≤4个，前体长度在几十到300nt之间，score＝3，成熟区错配数目＝0；4、同时使用mirdeep进行新mirna预测，筛选标准为score＝-0.6,自由能(mfe)小于-20kcal/mol；5、通过数据统计得到林木组织特异性表达的mirna。实施例实验材料：毛白杨优良无性系(lm50)作为研究对象。具体操作步骤如下：步骤s1,选择木质部、叶片、顶芽、根部、形成层，未成熟木质部6个组织进行总rna提取，为保证rna不被降解，对所有组织的分离都是在液氮环境下进行的。步骤s2，取0.1g植物组织样品，利用改良的trizol法对所有样品的总rna进行提取。以rnsae-free水为空白对照，使用nanodrop检测rna的纯度，具体结果如表1；表1:各组织rna提取结果从表1可以看出a260/a280数值范围为2.00-2.08，rna完整度在7.5-8.6之间，说明rna完整度极高，且没有蛋白质及dna污染，说明trizol法对于提取含多糖、酚类等次生代谢产物高的植物组织总rna非常有效。实施步骤s3，使用smallrnasampleprekit构建文库，直接将smallrna两端加上接头，接头序列包含林木组织特异性的条形码序列gttcaa、aggtta、cagtta、tactta、ctcata、aagtta、gccgaa，然后反转录合成cdna。随后经过pcr扩增，page胶电泳分离目标dna片段，切胶回收得到的即为cdna文库。同时我们对没有加林木特异性barcode的样品数据产出量进行对比，比较发现，使用林木特异性barcode序列之后，测序数据产出提高5％-18％、测序碱基质量值得到明显提升。实施步骤s4，将cdna文库进行hiseq/miseq测序，并对文库质量进行控制。表2：测序结果及质量评估表3：参考序列比对分析样品总srna数比对的srna正链比对srna负链比对srna叶片8346456680516241390012666161根部8645436671626547289921987273木质部8946586640306648792841523782顶芽8345749634656441847652161799未成熟木质部8245921626286945933291669540形成层8745940669616843352142360954测序结果如表2所示，在使用林木特异性barcode的情况下，每个组织样品产生11839301-11948645条reads(rawreads)，数据产出量非常稳定，产出的reads碱基平均质量值大于20(错误率1％；高质量reads指带有正确barcode)的比例均大于98.55％，产出的reads碱基平均质量值大于30的比率均大于97.68％，由此可以看出本文库构建方法可以产生较高质量的结果，且这些指标均比不使用林木特异性barcode测序结果有所提高，在不使用林木特异性barcode的情况下，会产生更多的无法确定样品来源的测序数据，且测序质量也会下降。如表3所示，所有组织样品至少71.5％的srna能够通过burrows-wheeleralignment(bwa)工具map到参考基因组上，说明测序结果非常准确。实施步骤s5，通过mirdeep软件及筛选标准进行mirna种类和数量进行鉴定。实施步骤s6，林木各组织检测到的mirna的种类和mirbase数据库筛选出杨树特有的mirna，统计杨树特有的mirna数目及表达量如图3所示。结果显示：杨树特有mirna为73个，数目较多，表达量差异明显。由此可见，采用本发明的检测方法可以非常迅速的检测到物种特异表达的mirna。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。sequencelisting<110>北京林业大学<120>提取林木组织或器官rna的方法和鉴定林木组织特异性mirna的方法<130>pidc3169042<160>41<170>patentinversion3.3<210>1<211>43<212>dna<213>artificial<220><223>正链的核苷酸序列，xxxxxx代表林木组织特异性条形码序列<400>1caagcagaagacggcatacgagatxxxxxxatgtgactggcca43<210>2<211>36<212>dna<213>artificial<220><223>负链核苷酸序列<400>2gtcagatcggaagagcggttcagcaggaatgccgag36<210>3<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>3gaagaa6<210>4<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>4caagaa6<210>5<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>5agagaa6<210>6<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>6tcagaa6<210>7<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>7gcagaa6<210>8<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>8ttcata6<210>9<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>9gtcata6<210>10<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>10ccaata6<210>11<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>11aatata6<210>12<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>12tatata6<210>13<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>13gatata6<210>14<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>14catata6<210>15<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>15attata6<210>16<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>16actata6<210>17<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>17gagtta6<210>18<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>18cagtta6<210>19<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>19ttgtta6<210>20<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>20ctgtta6<210>21<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>21aggtta6<210>22<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>22tggtta6<210>23<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>23cggtta6<210>24<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>24cagtta6<210>25<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>25ccctta6<210>26<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>26acctta6<210>27<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>27tcgtta6<210>28<211>7<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>28ctactta7<210>29<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>29agctta6<210>30<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>30tgctta6<210>31<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>31ccagta6<210>32<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>32ggagta6<210>33<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>33tcggaa6<210>34<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>34gcggaa6<210>35<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>35ccggaa6<210>36<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>36gttcaa6<210>37<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>37aggtta6<210>38<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>38tactta6<210>39<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>39ctcata6<210>40<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>40aagtta6<210>41<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>条形码序列<400>41gccgaa6当前第1页12