一种与大豆耐盐性相关的QTL、SNP分子标记及应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种与大豆耐盐性相关的qtl、snp分子标记及应用。

背景技术：

近年来，我国约有10％的耕地出现了不同程度的盐渍化，我国北方粮食主产区降水量很少，导致含盐地下水上升，盐分停留在土壤中；滨海地区受到海水的侵蚀，土壤盐碱化也不断扩大。盐胁迫对大豆生长发育和产量有很大的影响，根据高盐胁迫下植物正常生长的比率对植物进行盐胁迫耐受性分级，分级结果显示栽培大豆是一种中度耐盐的农作物。大豆的耐盐性取决于其自身对盐胁迫的耐受能力，不同品种的耐受能力不同。

目前，通过连锁分析对大豆耐盐性相关基因进行了广泛的数量性状基因位点(quantitativetraitlocus，qtl)定位研究，通过定位发现大豆耐盐性相关qtl主要集中在3号染色体上，这些耐盐性相关的qtl赋予了大豆显著的耐盐性，并且耐盐qtl在野生大豆种和栽培大豆种中是非常保守的。但是，目前耐盐性相关qtl的作用机理及应用研究还尚未充分进行，尚未形成可有效用于育种的状况。因此，有必要寻找一个可以更有效反应大豆耐盐性qtl以及与其相关的snp(singlenucleotidepolymorphism，单核苷酸的多态性)分子标记，进而在大豆耐盐性遗传改良中应用。

技术实现要素：

本发明提供的一种与大豆耐盐性相关的qtl、snp分子标记，与大豆耐盐性性状紧密相关，可以作为大豆耐盐性状改良中的分子标记辅助选择，从而加速大豆耐盐性状的改良进程。

本发明的第一个目的是提供一种与大豆耐盐性相关的qtl，与大豆耐盐性相关的qtl位于2号染色体的m7322-m7321-m7306区间，由snp分子标记m7322、m7321、m7306定位。

本发明的第二个目的是提供一种与上述的qtl紧密连锁的snp分子标记，所述snp分子标记为m7322，m7322的核苷酸序列如seqidno.1所示，m7322的扩增引物为：

m22f：5’-acgagaaagcccaaggtt-3’，如seqidno.4所示；

m22r：5’-actcggagcatctctgataag-3’，如seqidno.5所示。

本发明的第三个目的是提供一种与上述的qtl紧密连锁的snp分子标记，所述分子标记为m7321，m7321的核苷酸序列如seqidno.2所示，m7321的扩增引物为：

m21f：5’-tgttggtttctttggaggg-3’，如seqidno.6所示；

m21r：5’-aacccaggtgattccaggt-3’，如seqidno.7所示。

本发明的第四个目的是提供一种与上述的qtl紧密连锁的snp分子标记，所述分子标记为m7306，m7306的核苷酸序列如seqidno.3所示，m7306的扩增引物为：

m06f：5’-ggtaagcaaaccagagtatcct-3’如seqidno.8所示；

m06r：5’-cctcaactgaatggtttgg-3’，如seqidno.9所示。

本发明的第五个目的是提供一种上述qtl在大豆耐盐性性状选育中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种上述snp分子标记，在大豆耐盐性性状分子标记辅助选择选育中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的一种与大豆耐盐性相关的qtl，具有以下有益效果：

(1)迄今为止，大豆耐盐性qtl定位大多只是初级定位，耐盐性属于典型的数量性状，对其定位的精确性较差。qtl随机定位是在不同组合的不同遗传背景下发生多样化的重组过程，因此定位的qtl具有杂交组合特异性，标记区间过大，随着世代和遗传背景的改变可能会丧失，不利于应用。本发明筛选的作图区间m7306-m7321-m7322仅为1.007cm，距离很小，且筛选出的分子标记m7322、m7321、m7306均与大豆耐盐性的性状紧密连锁、显著相关，可用于分子标记辅助选择育种，能够显著提高耐盐性材料的选择效率，为进一步丰富大豆耐盐性调控网络提供了一种最经济有效的分子育种新途径。

(2)以m7321居中的m7306-m7321-m7322的qtl区间，其中m7321为lod最高点，其贡献率为12.61％。与此标记紧密相连的qtl的加性效应为正值，即长岭野生豆为该qtl的供体，即长岭野生豆该位点基因使盐胁迫耐受力增强。无论是从qtl的定位，还是qtl对表型的贡献率来看，以m7321居中的m7322-m7321-m7306的区间都是大豆耐盐性的理想标记区间。

附图说明

图1是位于2号染色体上的50-150cm遗传图谱部分与耐盐性有关的qtl的扫描结果；

图2是位于2号染色体上m7322-m7321-m7306区间的遗传图谱及qtl作图区间。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供的一种与大豆耐盐性相关的qtl，与大豆耐盐性相关的qtl位于2号染色体的m7322-m7321-m7306区间，由snp分子标记m7322、m7321、m7306定位。具体按照以下方法获得：

一、遗传群体的构建

以耐盐性低的大豆地方品种一千粒为母本，耐盐性高的长岭野生豆为父本，进行有性杂交，f1代选择长势良好的单株收获，然后采用单粒传法，繁种加代到f5，接着单株收获，次年种成株行，连续种植3代，获得f5:8家系，从中随机选取200个家系进行遗传图谱构建。

二、遗传图谱的构建

1.用ctab法提取上述亲本及200个子代f5:8家系的dna，用thermonanodrop2000检测dna浓度，并用1％琼脂糖电泳检测dna的纯度及完整性。

2.利用北京百迈客生物科技有限公司自主研发的slaf-seq技术和highmap软件对2个亲本和200个子代开发高密度分子标签，进行遗传图谱构建，具体步骤如下：

(1)基因组酶切：利用酶切预测软件对已公布大豆参考基因组进行酶切预测，选择内切酶rsai和haeiii对检测合格的各样品基因组进行酶切，然后选择基因组片段范围在364-414bp的slaf-seq片段。

(2)基因测序：对得到的slaf-seq片段用klenowfragment(3′→5′exo–)(neb)和datp在37℃下进行3′端加a处理，连接dual-index测序接头，然后进行pcr扩增及pcr扩增产物的纯化、切胶回收目的片段，并对回收的目的片段进行cdna文库质检，cdna文库质检合格后用illuminahiseqtm2500进行测序。为评估建库实验的准确性，选用水稻(oryzasativa)作为对照(control)进行相同的处理参与建库和测序。

所述pcr扩增使用的引物为f：aatgatacggcgaccaccga和r：caagcagaagacggcatacg。

利用agencourtampurexpbeads(beckmancoulter,highwycombe，uk)进行pcr扩增产物的纯化。

(3)snp标签与基因分型：根据测序reads在参考基因组上的定位结果，利用gatk软件进行局部重比对(localrealignment)和变异检测，同时采用samtools软件进行变异检测，取gatk软件和samtools软件两种方法得到的交集变异位点等步骤，以保证检测得到的snp(singlenucleotidepolymorphism，单核苷酸多态性)的准确性，最终筛选可用的snp标签为111399个。

(4)snp标签的筛选：为了避免染色体上的snp标签聚集现象对遗传图谱构建过程中的影响，在进行遗传图谱构建之前，对部分snp标签进行了去除冗余处理，对每个重叠群(contig/supercontig)，在一定大小的窗口(本实施例采用120kb)内，取唯一一个snp标签测序深度均值最高的marker代表该区段，用于后续分析，共计筛选出的4902个snp标签。

(5)连锁分析：将(4)筛选出的4902个snp标签，通过与参考基因组的定位，将snp标签分为20个连锁群，通过两两标签之间计算mlod值(距离指标)，共上图4564个，定位为上图标记(记作上图marker)。以连锁群为单位，采用highmap软件将分析获得连锁群内的上图marker进行线性排列，并估算相邻上图marker间的遗传距离，最终得到总图距为3403.90cm的遗传图谱。

三、人工鉴定亲本及200个子代的耐盐性

1.试验于2015年1月至2016年5月在吉林省农业科学院安普智能温室进行了两批次实验。

2.大豆植株培养：以河沙作为栽培介质，栽培桶高30cm、直径25cm，每份材料3个桶，每桶4株。同期播种，出苗后，每隔10天浇1l无氮营养液。

3.耐盐性鉴定：人工盐胁迫鉴定，每20个材料设一个耐盐对照，对照品种为文丰7号。播前浇水一次，以保证全苗。真叶展开后浇0.8g/100ml的氯化钠(nacl)溶液一次，之后土壤水分含量保持在80％左右，电导率保持在15ds/m左右。氯化钠处理30天后，利用6级盐害记载法，记录耐盐级别，具体如下：0级：叶片绿，无盐害症状；1级：受害叶面积<10％；2级：受害叶面积<25％；3级：受害叶面积<50％；4级：受害叶面积<75％；5级：受害叶面积>75％。利用盐害级别，计算盐害指数(pi)。盐害指数的(pi)计算公式为：pi＝σ(xini)/5n×100，其中xi为各级盐害级数，ni为各级记载株数，i为级别，n为调查总株数。大豆耐盐性分级标准如下：耐盐，盐害指数：≤20.0％；较耐盐，盐害指数：20.1％～35.0％；中耐盐，盐害指数：35.1％～65.0％；较敏感，盐害指数：65.01％～90％；敏感，盐害指数：>90.0％。

四、大豆耐盐性的qtl分析

利用两批次耐盐指数的平均值及构建的总图距为3403.90cm的遗传图谱，采用rqtl作图软件的复合区间(cim)作图法，以lod(连锁系数)≥3为标准，对大豆耐盐性进行qtl分析。在2号染色体上发现qtl区间m7322-m7321-m7306与大豆耐盐性相关，如表1所示。

表1大豆耐盐性qtl区间

五、耐盐性qtl区间标记的应用

与大豆耐盐性相关的qtl紧密连锁的snp分子标记为m7322、m7321、m7306，其是以待鉴定材料的基因组dna作为模板，以引物进行pcr扩增所得的片段；其中m7322的核苷酸序列如seqidno.1所示，m7321的核苷酸序列如seqidno.2所示，m7306的核苷酸序列如seqidno.3所示。

其中，m7322的扩增引物为：

m22f：5’-acgagaaagcccaaggtt-3’(如seqidno.4所示)；

m22r：5’-actcggagcatctctgataag-3’(如seqidno.5所示)；

m7321的扩增引物为：

m21f：5’-tgttggtttctttggaggg-3’(如seqidno.6所示)；

m21r：5’-aacccaggtgattccaggt-3’(如seqidno.7所示)；

m7306的扩增引物为：

m06f：5’-ggtaagcaaaccagagtatcct-3’(如seqidno.8所示)；

m06r：5’-cctcaactgaatggtttgg-3’(如seqidno.9所示)。

利用上述snp分子标记辅助判断大豆耐盐性的具体步骤如下：

1.利用ctab法提取待鉴定材料基因组dna

1)取大豆新鲜叶片加入液氮研磨成粉状，取适量放入1.5ml离心管中。

2)加入0.6ml预热的ctab提取液，颠倒混匀几次，在65℃的温度下水浴一小时，每15min混匀一次，12000rpm离心15min。

3)加入0.6ml24：1(v/v)的氯仿：异戊醇溶液，颠倒混匀5-10次，10000rpm离心15min。

4)取上清溶液转移到另外一个空的离心管中，用24:1(v/v)的氯仿：异戊醇溶液重新抽提一次，然后加50μlrnase(10mg/ml)室温下放置30min。

5)加等体积-20℃预冷的异丙醇，于-20℃冰箱中30min，5000rpm离心10min去上清。

6)用70％乙醇清洗两次。吹干后用灭菌水溶解，得到基因组模板dna，将基因组模板dna放入4℃冰箱保存备用。

7)用0.8％的琼脂糖检测dna的浓度，稀释到工作浓度用于pcr扩增。

2.分别利用m7322、m7321、m7306的引物进行pcr扩增，分别得到m7322扩增产物、m7321扩增产物和m7306扩增产物。

1)pcr扩增体系：总体积为20μl，包括10ng基因组模板dna2μl，2×estaqmastermix10μl，10mm的引物各2μl和ddh2o4μl。

2)pcr扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s；循环35次；72℃终延伸10min。

3.根据序列比对结果判断耐盐性

分别将m7322扩增产物、m7321扩增产物和m7306扩增产物进行测序分析，m7322扩增产物自5’端第98位在母本一千粒中为t、父本长岭野生豆中为c，seqidno.1中第98位以[t/c]表示；m7321扩增产物自5’端第108位在母本一千粒中也为g、父本长岭野生豆中为a，seqidno.2中第108位以[g/a]表示；m7306扩增产物自5’端第152位在母本一千粒中为c、父本长岭野生豆中为g，seqidno.3中第152位以[c/g]表示。当子代这些位点的snp与母本一致时，耐盐性弱，当与父本一致时耐盐性强，m7322的判断准确率为84.6％，m7321的判断准确率高达91.2％，m7306的判断准确率为85.1％，因此上述snp分子标记m7322、m7321、m7306可作为大豆耐盐性的共显性分子标记。

本发明以m7321居中的m7306-m7321-m7322的qtl区间都是大豆耐盐性的理想标记区间(见表1所示)，其中m7321为lod最高点，其贡献率为12.61％。与此标记紧密相连的qtl区间的加性效应为正值，即长岭野生豆为该qtl的供体。因此，无论是从该qtl区间的定位，还是该qtl区间对表型的贡献率来看，以m7321居中的m7306-m7321-m7322的区间都是大豆耐盐性的理想标记区间。

图2是位于2号染色体上m7322-m7321-m7306区间的遗传图谱及qtl作图区间，如图1或图2所示，利用本发明提供的如表1所示的大豆耐盐性02染色体作图区间m7322-m7321-m7306仅为1.007cm，距离很小，且筛选出的分子标记m7322、m7321、m7306与大豆耐盐性紧密连锁、显著相关，可用于分子标记辅助选择育种，显著提高耐盐性强的材料选择效率，为进一步丰富大豆耐盐性调控网络提供了一种最经济有效的分子育种新途径。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110>吉林省农业科学院

<120>一种与大豆耐盐性相关的qtl、snp分子标记及应用

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>203

<212>dna

<213>大豆

<400>1

acgagaaagcccaaggttgcgctaagcgcttgattaaaccaccattctcgctaagcttgg60

gagtgcacgttcggcatgatgaagtcagcgtgaaaaa[t/c]aagctaccttaggtttacaaaa120

gaagtaggaagcagaagggaaagacacaccgagtctcagagctgtctattgaatatattc180

caactcggagcatctctgataag203

<210>2

<211>225

<212>dna

<213>大豆

<400>2

tgttggtttctttggagggtacataatgttcatgtttttgaagacaaagagtggcctgaa60

tggtacattataaaccaaattcagacaaccattcaggtgttaaattt[g/a]gatgttcagagt120

tctaaaccaaaacatcttattcgcgtatcttgacaagctccgagtcttggtactacaagt180

tgaatgttgatggcagctcaaggggaaacccaggtgattccaggt225

<210>3

<211>369

<212>dna

<213>大豆

<400>3

ggtaagcaaaccagagtatccttcaagaagcatcttccctccaaaaaatctaagttgctt60

gaattggtgcatctagatgtttatggccctttgaaggtgaaatcctttagtggtgcactc120

tatttttttttaccttcgttgatgactattc[c/g]aggaaactttgggtctatgttttgaaga180

caaaagaccaagttcttgagaaatttaaggagtttcatgtcttagttgagaggcagtcat240

gtaagatgctgaaacgcattcgtattgacaatggtggtgagtattatggaccatttgatg300

tctactgcaagcagcatggtattgcttaggagaaaactcctcctaaaactcctcaactga360

atggtttgg369

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

acgagaaagcccaaggtt18

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

actcggagcatctctgataag21

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

tgttggtttctttggaggg19

<210>7

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

aacccaggtgattccaggt19

<210>8

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

ggtaagcaaaccagagtatcct22

<210>9

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

cctcaactgaatggtttgg19