一种蕾二歧灯芯柳珊瑚来源的海洋真菌及其在制备抗菌药物中的应用的制作方法

本发明属于海洋药物，具体涉及一种蕾二歧灯芯柳珊瑚来源的海洋真菌及其在制备抗菌药物中的应用。

背景技术

海洋，由于其高压、高盐、少氧、少光照等特殊的环境，使其能够产生一些结构新颖的化合物。联苯醚糖苷化合物到目前为止仍属于结构少见的化合物，仅有8个此类化合物被报道，其中仅有一个是来源于海洋中的海绵真菌，而未见有来源于珊瑚及珊瑚真菌的联苯醚糖苷类化合物被报道。

技术实现要素：

本发明提供一种海洋真菌phomasp.，该真菌分离自蕾二歧灯芯柳珊瑚，其中蕾二歧灯芯柳珊瑚是发明人于2008年9月采集自中国南海西沙群岛。本发明所述海洋真菌phomasp.的菌种保藏信息：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年4月1日；保藏编号：cgmccno.13881；分类命名：茎点霉phomasp.。

本发明的另一实施方案提供一种式(i)、式(ii)化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于式(i)、式(ii)化合物具有如下结构：

本发明的另一实施方案提供一种同时制备式(i)化合物和式(ii)化合物的制备方法，其特征包括以下步骤：先在菌种培养基中对海洋真菌phomasp.进行菌种培养，再在发酵培养基中对该海洋真菌进行发酵培养，得发酵物后，用乙酸乙酯浸提2～6次，合并乙酸乙酯浸提液后减压浓缩得粗浸膏，进行色谱分离，分别得式(i)、式(ii)化合物；其中所述的菌种培养基中含有葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、琼脂、粗海盐、水；所述的发酵培养基中含有大米、粗海盐、水；所述的色谱分离为依次进行正相硅胶柱色谱分离、凝胶柱色谱分离和高效液相色谱分离。

上述制备方法中所述的菌种培养基优选含有葡萄糖0.10％–10％、酵母膏0.01％–4.0％、蛋白胨0.01％–4.0％、琼脂0.10％–6.0％、粗海盐0.05％–10％，其余为水，上述百分含量均为重量百分比；培养温度为5–45℃；培养时间为3–10天；所述的发酵培养基中大米、粗海盐和水的含量为每个500ml锥形瓶中含有大米50–150g，粗海盐0.05–10g，水50–150ml；培养温度为5–45℃；培养时间为20–50天；所述的正相硅胶柱色谱分离为先采用固定相为100～200目硅胶，流动相为80％–100％(体积百分比，下同)的乙酸乙酯/石油醚混合溶剂，洗脱体积优选为1-5个柱体积，然后再采用的固定相为200～300目硅胶，流动相为90％–100％的二氯甲烷/甲醇混合溶剂，洗脱体积优选为2-3个柱体积；凝胶柱色谱分离的固定相为sephadexlh-20，流动相为50％的二氯甲烷/甲醇混合溶剂，洗脱体积优选为1-5个柱体积；高效液相色谱分离中采用的色谱为半制备c18色谱柱，kromasil,7μm,10×250mm，首先以45％的甲醇/水混合溶液作为流动相，制备得到式(ii)化合物，然后以55％的甲醇/水混合溶液作为流动相，制备得到式(i)化合物。

本发明提供一种抗菌剂，其特征在于包含上述的式(i)、(ii)化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分；还可包括其他抗菌活性成分和/或药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明提供上述的式(i)、式(ii)化合物或其药学上可接受的盐在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗由白色葡萄球菌(staphylococcusalbus)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)、大肠杆菌(escherichiacoli)或副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)引起的疾病。

本发明的另一实施方案提供上述海洋真菌phomasp.在制备抗菌药物中的应用。

本发明的另一实施方案提供上述海洋真菌phomasp.在制备式(i)和/或式(ii)化合物中的应用。

本发明中术语“药学上可接受的盐”是指非毒性的无机或有机酸和/或碱的加成盐，可参见“saltselectionforbasicdrugs”,int.j.pharm.(1986),33,201–217。

具体实施方式

为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。

实施例1

(1)海洋真菌phomasp.菌种的培养

真菌phomasp.的菌种培养所用的培养基含有葡萄糖1.0％(重量百分比，下同)、酵母膏0.1％、蛋白胨0.2％、琼脂1.0％、粗海盐3.0％，其余为水，使用时制成试管斜面，真菌菌株在28℃下培养5天。

(2)海洋真菌phomasp.的发酵

真菌phomasp.的发酵培养所用的发酵培养基为每个500ml锥形瓶中含有大米80g，粗海盐2g，水120ml，真菌菌株于25-28℃静置发酵培养28天，得发酵物；共使用50个500ml锥形瓶发酵。

(3)本发明式(i)、式(ii)化合物的分离提取

取步骤(2)所得的发酵物，用乙酸乙酯浸提3次，浸提液减压浓缩得到粗浸膏，先进行正相硅胶柱色谱分离，固定相：100～200目硅胶，流动相为80％(体积百分比)的乙酸乙酯/石油醚混合溶剂，洗脱3个柱体积，洗脱液浓缩后再进行正相硅胶柱色谱分离，固定相：200～300目硅胶，流动相为90％(体积百分比)的二氯甲烷/甲醇混合溶剂，洗脱2个柱体积，洗脱液浓缩后进行sephadexlh20凝胶柱色谱分离，流动相：50％(体积百分比)的二氯甲烷/甲醇混合溶剂，洗脱液浓缩后进行高效液相色谱分离，固定相：半制备c18色谱柱(kromasil,7μm,10×250mm)，先以45％的甲醇/水混合溶液作为流动相，制备得到式(ii)化合物，为无色无定型粉末；然后以55％的甲醇/水混合溶液作为流动相，制备得到式(i)化合物，为无色无定型粉末。

式(i)化合物结构为：结构确证数据：¹hnmr(cd3od,600mhz)δ:6.60(1h,brs,h-4′),6.39(1h,brs,h-2′),6.35(1h,d,j＝2.9hz,h-3),6.31(1h,d,j＝2.9hz,h-5),6.29(1h,brs,h-6′),5.55(1h,d,j＝4.5hz,h-1″),4.13(1h,dd,j＝6.4,4.5hz,h-2″),4.10(1h,dt,j＝3.5,3.5hz,h-4″),4.06(1h,dd,j＝6.5,3.2hz,h-3″),3.74(3h,s,4-ome),3.69(1h,dd,j＝12.1,3.4hz,ha-5″),3.63(1h,dd,j＝12.2,3.8hz,hb-5″),2.24(3h,s,5′-me),2.03(3h,s,6-me)；¹³cnmr(cd3od,150mhz)δ:160.7(c,c-1′),159.8(c,c-3′),158.7(c,c-4),151.8(c,c-2),141.3(c,c-5′),135.6(c,c-1),134.0(c,c-6),111.7(ch,c-4′),110.4(ch,c-6′),107.8(ch,c-5),101.4(ch,c-3),102.6(ch,c-2′),102.3(ch,c-1″),87.5(ch,c-4″),73.4(ch,c-2″),71.2(ch,c-3″),63.2(ch2,c-5″),55.8(ch3,4-ome),21.8(ch3,5′-me),16.5(ch3,6-me).hresimsm/z415.1370[m+na]⁺(calcdforc20h24o8na,415.1363).

式(ii)化合物结构为：结构确证数据：¹hnmr(dmso-d6,600mhz)δ:9.27(1h,brs,3′-oh),6.69(1h,d,j＝2.9hz,h-3),6.51(1h,d,j＝2.8hz,h-5),6.18(1h,brs,h-4′),6.08(1h,brs,h-6′),5.93(1h,brs,h-2′),5.04(1h,brs,2″-oh),5.04(1h,brs,3″-oh),4.82(1h,d,j＝7.8hz,h-1″),4.68(1h,d,j＝5.2hz,4″-oh),4.60(1h,brs,6″-oh),3.73(3h,s,4-ome),3.68(1h,d,j＝11.0hz,ha-6″),3.40(1h,d,j＝11.0hz,hb-6″),3.30(1h,ddd,j＝8.4,6.4,2.0hz,h-5″),3.20(1h,dd,j＝8.9,8.8hz,h-3″),3.08(1h,m,h-4″),3.06(1h,m,h-2″),2.13(3h,s,5′-me),2.02(3h,s,6-me)；¹³cnmr(dmso-d6,150mhz)δ:159.3(c,c-1′),158.2(c,c-3′),156.3(c,c-4),150.9(c,c-2),139.5(c,c-5′),135.2(c,c-1),132.4(c,c-6),109.4(ch,c-4′),108.5(ch,c-5),106.6(ch,c-6′),100.82(ch,c-3),100.76(ch,c-1″),99.2(ch,c-2′),77.3(ch,c-5″),76.8(ch,c-3″),73.2(ch,c-2″),69.8(ch,c-4″),60.8(ch2,c-6″),55.2(ch3,4-ome),21.2(ch3,5′-me),16.2(ch3,6-me).hresimsm/z445.1474[m+na]⁺(calcdforc21h26o9na,445.1469).

实施例2

(1)海洋真菌phomasp.菌种的培养

菌种培养基含有葡萄糖0.10％–10％(重量百分比，下同)、酵母膏0.01％–4.0％、蛋白胨0.01％–4.0％、琼脂0.10％–6.0％、粗海盐0.05％–10％，其余为水；培养温度为5–45℃；培养时间为3–10天。

(2)海洋真菌phomasp.的发酵

发酵培养基为每个500ml锥形瓶中含有大米50–150g，粗海盐0.05–10g，水50–150ml；发酵培养温度为5–45℃；经20–50天的发酵培养得发酵物。

(3)本发明式(i)、式(ii)化合物的分离提取

取步骤(2)所得的发酵物，用乙酸乙酯浸提2–6次，得乙酸乙酯浸提液，浸提液减压浓缩得到粗浸膏，先进行正相硅胶柱色谱分离，首先采用的固定相为100～200目硅胶，流动相为80％–100％(体积百分比，下同)的乙酸乙酯/石油醚混合溶剂，获得粗组分a，然后再使用正相硅胶柱色谱分离，采用的固定相为200～300目硅胶，流动相为90％–100％(体积百分比)的二氯甲烷/甲醇混合溶剂，获得粗组分b，再进行凝胶柱色谱分离，所选固定相为sephadexlh-20，流动相为50％(体积百分比)的二氯甲烷/甲醇混合溶剂，得到粗组分c，最后进行高效液相色谱分离，采用的色谱柱为半制备c18色谱柱(kromasil,7μm,10×250mm)，首先以45％的甲醇/水混合溶液作为流动相，制备得到式(ii)化合物，然后以55％的甲醇/水混合溶液作为流动相，制备得到式(i)化合物。其中式(i)、式(ii)化合物的结构确证数据与实施例1中相应数据一致。

实施例1–2中未具体指明的其他菌种培养、发酵条件，以及正相硅胶柱色谱分离、凝胶柱色谱分离、高效液相手性色谱分离等其他实验操作条件均为本领域常规的实验操作条件，本领域的技术人员可以根据实际需要，进行合理的选择。

实施例3

在菌种培养基中对海洋真菌phomasp.进行菌种培养，再在发酵培养基中对上述海洋真菌进行发酵培养，将发酵产物用乙酸乙酯浸提2～6次，浸提液减压蒸馏得到粗浸膏，进行色谱分离后得到2个无色不定型粉末状化合物，即为式(i)、(ii)化合物，其结构确证数据与实施例1中相应数据一致。其中所述菌种培养基中含有葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、琼脂、粗海盐、水，所述发酵培养基中含有大米、粗海盐、水；所述的色谱分离为依次采用正相硅胶柱色谱分离，凝胶柱色谱分离和高效液相色谱分离。

为了探索更广泛的适用于制备本发明式(i)、(ii)化合物的方法，本实施例中菌种培养基、发酵培养基中各成分的添加，均按本领域中常规比例添加或按任意比例添加，色谱分离时所用硅胶及凝胶的规格、色谱柱的型号及洗脱溶剂的选择，均为本领域的常规选择。实验结果表明，上述常规选择的制备方法，均能得到发明的式(i)、(ii)化合物，其结构确证数据与实施例1中相应数据一致，仅仅是化合物纯度和收率方面存在微小差异。

实施例1–3的结果表明，按照本领域常规的菌种培养、发酵条件，常规的正相硅胶柱色谱分离、凝胶柱色谱分离以及高效液相色谱分离的条件对海洋真菌phomasp.进行培养、发酵、分离纯化，均能得到本发明式(i)、(ii)结构的化合物。本发明式(i)、(ii)化合物的制备方法，优选实施例1–2中记载的方法。

实施例4

本发明式(i)、(ii)化合物的抗菌活性的测定

(1)本发明的化合物按照文献方法(piercec.g.；uppulurip.；teistana.r.；wormleyjr.f.l.；mowate.；ramageg.；lopez-ribotj.l.nat.protoc.2008,3,1494–1500)，测试对2株革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(s.aureus)、白色葡萄球菌(s.albus)，以及3株革兰氏阴性菌：大肠杆菌(e.coli)、副溶血弧菌(v.parahaemolyticus)、鳗弧菌(v.anguillarum)的抗菌活性。

(2)本发明的化合物抗菌活性

其中式(ii)化合物对白色葡萄球菌(s.albus)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)、大肠杆菌(e.coli)、副溶血弧菌(v.parahaemolyticus)具有显著的抗菌活性。其中对白色葡萄球菌(s.albus)的抗菌活性与阳性对照药环丙沙星(ciprofloxacin)相当，其最小抑制浓度(mic)为0.312μm，如表1所示。

表1本发明的式(i)、式(ii)化合物对细菌的抑制活性

本发明提供一种抗菌剂，其特征在于包含式(i)、式(ii)化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，用于预防或治疗由白色葡萄球菌(s.albus)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)、副溶血弧菌(v.parahaemolyticus)或大肠杆菌(e.coli)引起的有关疾病，且原料可以通过真菌发酵进行大规模生产，不受资源限制，因此应用前景广阔。