本发明涉及一种监测石油降解菌群落结构变化的方法，属于微生物生态技术领域。
背景技术：
pcr-dgge技术突破了传统的人工培养基的束缚，从基因层次探究细菌群落组成变化，可直接分析复杂样品中的混合菌群结构，更加真实地反映了自然状态下的微生物的多样性。该技术主要包括dna的提取、pcr扩增、dgge凝胶电泳三大主要步骤。dna是pcr-dgge技术的核心原材料，一般石油环境样品中杂质较多，dna的提取也会变得复杂。dna质量是研究石油环境中微生物群落结构的保证，研究中通常采用传统方法提取细菌dna，但此过程中试剂配制繁琐、用量极少，容易造成试剂浪费且操作费时；目前多采用进口试剂盒提取dna，由于价格昂贵，难以普及使用。在pcr步骤中，pcr的随机性较强并且受到多种因素影响，通常会产生许多非目的片段产物，比如异源双链、二聚体等，这些副产物均会影响细菌群落多样性的真实性。dna模板量、引物量、退火温度、循环数是影响pcr特异性扩增的主要因素。dna的提取质量和pcr的稳定扩增是变性梯度凝胶电泳的基础，影响其效果的主要条件包括凝胶浓度、电泳电压、电泳时间，电泳条件不合适对图谱的效果有直接影响。
鉴于pcr-dgge技术在石油降解菌群落结构的研究中存在的问题，有必要针对各技术中的不足之处进行改进，从而完善技术条件，保证提取的dna质量，稳定扩增目的片段，获取清楚的dgge图谱。
技术实现要素：
为了克服背景技术中的不足，本发明建立了一种改进的pcr-dgge方法用于监测海洋石油污染生物修复过程中石油降解菌群落结构的变化，该方法能够真实反映石油降解过程中菌群的动态变化，有利于开发不同阶段石油降解功能菌。
本发明的技术方案包括下列步骤：
a）采用试剂盒对含石油培养液中石油降解菌总dna进行提取；
b）以所提取dna为模板，pcr扩增出目的片段；
c）通过变性梯度凝胶电泳分离pcr扩增片段，获得指纹图谱；
d）势条带胶回收测序；
e）序结果在美国生物信息技术中心（ncbi）数据库中进行序列的同源性比对和分析。
上述方案步骤a）中：采用newprobe细菌总dna提取试剂盒提取石油降解菌总dna。
上述方案步骤b）中：对dna模板量、引物量、退火温度、循环数进行了优化，优化后pcr体系为25μl10xmaster、3μldna模板、1μl正向引物、1μl反向引物、20μlddh2o；优化后扩增程序为94℃预变性4min、94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min，25个循环、72℃最终延伸6min。
上述方案步骤b）中：对变性梯度凝胶电泳条件中凝胶浓度、电泳电压、电泳时间进行了优化，电泳条件包括丙烯酰胺凝胶浓度为8%，凝胶变性范围为30%-60%，凝胶溶液中加入100μlaps和18μltemed；pcr产物与加样缓冲液以4：1混合，共20μl；电泳温度为60℃、电泳电压60v、电泳时间16h。
本发明的有益效果是：a）本发明使用的newprobe细菌总dna提取试剂盒与进口试剂盒相比，价格相对低廉，适用于日常监测，同时可获得高质量的细菌总dna；b)本发明对pcr条件中dna模板量、引物量、退火温度、循环数做了改进，使得扩增效果好、稳定性更高；c）本发明对dgge条件中凝胶浓度、电泳电压、电泳时间进行了优化，从而提高了分离效果，可得到清晰的指纹图谱，有利于图谱分析和切胶回收；d）本发明可同时对不同时间的石油降解菌群进行监测，精确地反应出石油降解菌群落结构的动态变化；e）有利于开发不同阶段石油降解功能菌。
附图说明
图1是实施例中石油降解菌总dna琼脂糖电泳检测图谱。
图2是实施例中pcr产物琼脂糖电泳检测图谱。
图3是实施例中dgge指纹图谱。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容。
以石油培养液为研究对象，且石油作为培养液中唯一碳源。实验周期为2个月，7d取样一次。取4ml的含油培养液于离心管中，11500r/min离心4min得菌沉淀，严格按照newprobe细菌总dna提取试剂盒说明书操作，提取石油降解菌总dna。石油降解菌总dna成像结果如图1。
选用引物f357和r518作为引物对，以试剂盒提取的石油降解菌总dna为模板进行扩增。其中扩增体系为25μl10xmaster、3μldna模板、1μl正向引物、1μl反向引物、20μlddh2o；扩增程序为94℃预变性4min、94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min、25个循环、72℃延伸6min。石油降解菌pcr产物成像结果如图2。
通过dgge凝胶电泳对pcr目的片段进行分离，电泳条件为凝胶浓度8%、变性范围30%-60%、电泳温度60℃、电压60v，电泳时间16h。电泳结束后，将sybrgreen溶液均匀地铺在凝胶表面，避光染色30min。染色结束后，用ddh2o缓慢冲洗凝胶，小心地揭开凝胶底部并用ddh2o冲洗，最后将凝胶转移至geldoc2000凝胶成像系统进行观察。石油降解菌dgge指纹图谱的成像结果如图3。