利用引物对K37FR鉴定侧耳泛菌的方法与流程

本发明涉及生物技术领域中利用引物对k37fr鉴定侧耳泛菌的方法。

背景技术：

我国从上世纪九十年代开始杏鲍菇规模化栽培。泛菌属包括作为植物促生菌、生防菌或植物病原菌的几个种(pantoea:insightsintoahighlyversatileanddiversegenuswithintheenterobacteriaceae,femsmicrobiologyreviews(2015)39:968-984)。由泛菌引起的杏鲍菇细菌性枯萎病是近几年在国内外杏鲍菇工厂化生产中发生的严重病害，报道于北京地区的杏鲍菇枯萎病的病原菌被鉴定及定名为侧耳泛菌(pantoeapleurotisp.nov.,isolatedfromthefruitingbodiesofpleurotuseryngii,maetal.currentmicrobiology,(2016)72(2)207-212)。杏鲍菇细菌性枯萎病严重影响子实体的品质，不利于工厂化生产。侧耳泛菌快速诊断技术的开发，对杏鲍菇枯萎病的有效防控具有重要意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定或辅助鉴定侧耳泛菌(pantoeapleuroti)。

为解决上述技术问题，本发明提供了侧耳泛菌特异pcr引物对。

本发明所提供的侧耳泛菌特异pcr引物对名称为k37fr，由引物k37f和引物k37r组成；所述引物k37f为seqidno.1所示的单链dna分子；所述引物k37r为seqidno.2所示的单链dna分子。

本发明还提供了包括侧耳泛菌特异引物对k37fr的鉴定或辅助鉴定侧耳泛菌的试剂或试剂盒。

上述鉴定或辅助鉴定侧耳泛菌的试剂或试剂盒还包括进行pcr反应所需的除引物外的其它试剂。

本发明还提供了侧耳泛菌特异引物对k37fr的制备方法，鉴定或辅助鉴定侧耳泛菌的试剂或试剂盒的制备方法。

本发明所提供的侧耳泛菌特异引物对k37fr的制备方法包括将侧耳泛菌特异引物对k37fr的所述两条单链dna分子分别单独包装的步骤。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定侧耳泛菌的试剂或试剂盒的制备方法，包括将侧耳泛菌特异引物对k37fr的所述两条单链dna分子分别单独包装的步骤。

本发明还提供了seqidno.3所示的dna分子。

seqidno.3所示的dna分子为侧耳泛菌的特异dna片段。

侧耳泛菌特异引物对k37fr在鉴定或辅助鉴定侧耳泛菌中的应用或在制备鉴定或辅助鉴定侧耳泛菌产品(如鉴定或辅助鉴定侧耳泛菌的试剂或试剂盒)中的应用、鉴定或辅助鉴定侧耳泛菌的试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定侧耳泛菌中的应用和seqidno.3所示的dna分子在鉴定或辅助鉴定侧耳泛菌中的应用或在制备鉴定或辅助鉴定侧耳泛菌产品(如鉴定或辅助鉴定侧耳泛菌的试剂或试剂盒)中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用均不包括疾病的诊断方法和/或治疗方法。

本发明还提供了鉴定或辅助鉴定侧耳泛菌的方法。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定侧耳泛菌的方法，包括以待测生物样品的基因组dna为模板，用侧耳泛菌特异引物对k37fr进行pcr扩增得到pcr产物，检测所述pcr产物的大小，如果所述pcr产物含有500-700bp的dna片段(或所述pcr产物为500-700bp的dna片段)，所述待测生物样品为侧耳泛菌或含有侧耳泛菌，或者所述待测生物样品候选为侧耳泛菌或候选含有侧耳泛菌；如果所述pcr产物不含有500-700bp的dna片段(或所述pcr产物不为500-700bp的dna片段)，所述待测生物样品不为侧耳泛菌或不含有侧耳泛菌，或者所述待测生物样品候选不为侧耳泛菌或候选不含有侧耳泛菌。

上述鉴定或辅助鉴定侧耳泛菌的方法中，所述500-700bp的dna片段具体可为666bp的dna片段。

实验证明，侧耳泛菌特异引物对k37fr只在侧耳泛菌的基因组dna中扩增出了特异条带，在其它菌株中均没有得到扩增产物，侧耳泛菌特异引物对k37fr可用于快速鉴定侧耳泛菌。本发明为及早地预防和及时地切断侧耳泛菌引起的杏鲍菇枯萎病(杏鲍菇细菌性枯萎病)的传染源及传播途径提供了技术支持，可实现对侧耳泛菌引起的杏鲍菇枯萎病进行早期预防和控制。

附图说明

图1为引物对16sp1-16sp2对泛菌的16srdna的pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为侧耳泛菌特异引物对k37fr特异性检测泛菌的pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为侧耳泛菌特异引物对k6fr检测泛菌的pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图1至图3中，m为1kbplusdnaladder(天根)；1为侧耳泛菌(pantoeapleurotisp.nov.)jzb2120015^t；2为pantoeavaganslmg24199；3为pantoeastewartiisubsp.stewartiilmg2715；4为pantoeastewartiisubsp.indologeneslmg2632；5为pantoeawallisiilmg26277；6为pantoeaalliilmg24248；7为pantoeaananatislmg2665；8为pantoeadeleyilmg24200；9为pantoeabrennerilmg5343；10为pantoearodasiilmg26273；11为pantoeaeucalypti24197；12为pantoeaagglomeransjcm1236；13为北京泛菌(pantoeabeijingensissp.nov.)jzb2120001^t；14为pantoeagaviniaedsm22758；15为pantoeaanthophiladsm23080；16为pantoeadispersadsm30073。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的北京泛菌(pantoeabeijingensissp.nov.)jzb2120001^t(即lmg27579^t或kctc32406^t)(pantoeabeijingensissp.nov.,isolatedfromthefruitingbodyofpleurotuseryngii.liuetal.antonievanleeuwenhoek(2013)104:1039–1047)公众可从北京市农林科学院植物保护环境保护研究所或比利时bccm/lmg菌种保藏中心或韩国kctc菌种保藏中心获得该菌株。

下述实施例中的侧耳泛菌(pantoeapleurotisp.nov.)jzb2120015^t(pantoeapleurotisp.nov.,isolatedfromthefruitingbodiesofpleurotuseryngii.maetal.currentmicrobiology.19november2015)公众可从北京市农林科学院植物保护环境保护研究所或比利时bccm/lmg菌种保藏中心或中国cgmcc菌种保藏中心获得该菌株。

下述实施例中的pantoeagaviniaedsm22758、pantoeaanthophiladsm23080和pantoeadispersadsm30073均为德国dsm菌种保藏中心的菌株。

下述实施例中的pantoeaagglomeransjcm1236为日本jcm菌种保藏中心的菌株。

pantoeavaganslmg24199，pantoeastewartiisubsp.stewartiilmg2715，pantoeastewartiisubsp.indologeneslmg2632，pantoeawallisiilmg26277，pantoeaalliilmg24248，pantoeaananatislmg2665，pantoeadeleyilmg24200，pantoeabrennerilmg5343，pantoearodasiilmg26273，pantoeaeucalyptilmg24197为比利时lmg菌种保藏中心的菌株。

实施例1、利用pcr引物对k37fr鉴定侧耳泛菌

1、鉴定侧耳泛菌的特异pcr试剂

侧耳泛菌(pantoeapleurotisp.nov.)jzb2120015^t的基因组dna中含有seqidno.3所示的一段dna序列，在ncbi上比对无明显的序列相似性，以此序列设计特异引物对，命名为k37fr。

本实施例的鉴定侧耳泛菌的pcr试剂由侧耳泛菌特异引物对k37fr、2×taqpcrmix(bioeasy)和ddh2o组成。

其中,侧耳泛菌特异引物对k37fr由k37f(上游引物)和k37r(下游引物)组成，k37f的核苷酸序列是5'-attggttcggaatctactcgtt-3'(seqidno.1)，k37r的核苷酸序列是5'-atgctataaactcacccacagg-3'(seqidno.2)。

2、鉴定侧耳泛菌

2.1、提取菌株的基因组dna

从-80℃保存的16个菌种(菌株)(北京泛菌(pantoeabeijingensissp.nov.)jzb2120001^t；侧耳泛菌(pantoeapleurotisp.nov.)jzb2120015^t；pantoeagaviniaedsm22758；pantoeaanthophiladsm23080；pantoeadispersadsm30073；pantoeaagglomeransjcm1236；pantoeavaganslmg24199；pantoeastewartiisubsp.stewartiilmg2715；pantoeastewartiisubsp.indologeneslmg2632；pantoeawallisiilmg26277；pantoeaalliilmg24248；pantoeaananatislmg2665；pantoeadeleyilmg24200；pantoeabrennerilmg5343；pantoearodasiilmg26273和pantoeaeucalyptilmg24197)分别在固体lb培养基中划线，28℃培养20h，用接种环挑取各细菌菌株单个菌落接于装有lb培养基(3ml)的试管中，以200rpm28℃振荡培养18h。将各供试菌株用dneasyblood&tissuekit(qiagen)提取总dna作为pcr模板，按照试剂盒的说明书操作，具体步骤如下：

1)收集2ml细菌培养液，12000rpm离心1min，去掉上清。

2)加入180μlbufferatl，20μl蛋白酶k，4μlrnasea，56℃处理1小时。

3)振荡15s，加入200μlbufferal混匀。

4)加入200μl无水乙醇，8000rpm离心3min。

5)上清收集到离心柱中，8000rpm离心1min。

6)在离心柱中加入500μlbufferaw1，8000rpm离心1min。

7)在离心柱中加入500μlbufferaw2，8000rpm离心1min。

8)将离心柱放到一个新的1.5ml离心管上，加入50μlbufferae，室温放置1min，8000rpm离心1min，所得即为上述16个菌种每个菌种的基因组dna。

分别以上述各菌种的基因组dna为模板，利用引物对16sp1-16sp2pcr扩增各菌株的16srdna片段。引物对16sp1-16sp2由16sp1(序列为5’-agagtttgatcctggctcagaacgaacgct-3’)和16sp2(序列为5’-tacggctaccttgttacgacttcacccc-3’)组成。pcr反应体系(20μl)：10μmol·l^-1的上、下游引物各1μl，2×taqpcrmix(bioeasy)10μl，模板dna0.5μl，ddh2o7.5μl。pcr反应条件：95℃，5min；95℃，30s，55℃，30s，72℃2min,30个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测。

结果表明引物对16sp1-16sp2在供试的16个菌株中均能扩增出目的条带，说明供试菌株的dna提取效果良好(图1)。

2.2、利用引物对k37fr进行pcr扩增

分别以2.1提取的各菌株的基因组dna为模板，利用步骤1的侧耳泛菌特异引物对k37fr进行pcr。pcr反应体系(20μl)：10μmol·l^-1的上、下游引物各1μl，2×taqpcrmix(bioeasy)10μl，模板dna0.5μl，ddh2o7.5μl。pcr反应条件：95℃，5min；95℃，30s，60℃，30s，72℃1min,30个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测。

结果表明侧耳泛菌特异引物对k37fr只能以1号菌株侧耳泛菌(pantoeapleurotisp.nov.)jzb2120015^t的基因组dna为模板扩增出大小为500-700bp条带，侧耳泛菌特异引物对k37fr在其它15个菌株中均没有扩增出条带(图2)。回收侧耳泛菌(pantoeapleurotisp.nov.)jzb2120015^t的500-700bp条带，进行测序，结果表明该500-700bp条带的大小为666bp，其序列为seqidno.3。说明侧耳泛菌特异引物对k37fr是侧耳泛菌的特异引物对，可用于快速鉴定侧耳泛菌。

对比例1、pcr引物对k6fr不能鉴定侧耳泛菌

侧耳泛菌(pantoeapleurotisp.nov.)jzb2120015^t的基因组dna中含有另外一段dna序列(名称为k6，序列如seqidno.4所示)，在ncbi上比对无明显的序列相似性，以此序列设计特异引物对k6fr由k6f(序列为5’-ccattacacagtttcggttcc-3’)和k6r(序列为5’-gcttgcccaataaattccttc-3’)组成，以实施例1的16个菌种的基因组dna为模板分别进行pcr，结果显示特异引物对k6fr的特异性不好，除了1号菌株侧耳泛菌(pantoeapleurotisp.nov.)jzb2120015^t能扩增出特异条带外，9号菌株pantoeabrennerilmg5343也能扩增出目的条带(图3)，说明侧耳泛菌特异引物对k6fr不能特异鉴定侧耳泛菌。其中，pcr反应体系同实施例1，pcr反应条件：95℃，5min；95℃，30s，60℃，30s，72℃1min,30个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测。

<110>北京市农林科学院

<120>利用引物对k37fr鉴定侧耳泛菌的方法

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

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<213>人工序列

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<213>侧耳泛菌（pantoeapleuroti）

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