一种检测菜豆晕疫病菌实时荧光PCR试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及微生物检测领域，具体地说是一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：菜豆晕疫病菌(pseudomonassavastanoipv．phaseolicola)是我国的进境植物检疫性有害生物。其寄主范围主要为豆科植物，包括大豆、菜豆、豌豆、绿豆等。由该病菌侵染引起的豆类晕疫病在欧洲、亚洲、美洲、非洲、大洋洲均有发生，可引起豆类作物严重损失，有时甚至绝收。菜豆晕疫病菌主要通过带菌种子作远距离传播，病菌的最适生长温度为25-30℃，中国各豆科作物产区均具备其定殖的条件。此病菌一旦传入我国，必将对我国的大豆产业产生严重影响。近年来，随着国内消费需求的增长，我国进口大豆量呈井喷态势，2016年进口量更是达到8391万吨。国外大豆主产国多数是菜豆晕疫病菌的疫区，因此该病菌随进口豆科植物材料传入我国的风险很大。菜豆晕疫病菌检测方法包括生理生化法、脂肪酸分析法、致病性测试结合玻片凝集试验、酶联免疫法等，但这些常规方法鉴定时间长，灵敏度不高，因此加快对进口豆科作物中携带菜豆晕疫病菌的快速检测技术研究，已成为当前越来越迫切需要解决的问题。taqmanreal-timepcr是在普通pcr方法的基础上，加入了一条荧光标记的探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；pcr扩增时，taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。利用荧光信号积累，实时监控整个pcr过程，整个过程只需一小时，此外去除了普通分子生物学多种弊端。国内外尚未见检疫性有害生物菜豆晕疫病菌实时荧光方法建立的报道。开发适用于口岸检疫的快速诊断技术对菜豆晕疫病菌进行严格检疫，对防止该类病原菌的传入至关重要。然而，目前权威的检测方法是国家质量监督检验总局发布的中华人民共和国出入境检验检疫行业标准（sn／t1586.2-2008）菜豆晕疫病菌检疫鉴定方法中包括：生理生化指标检测、致病性检测、普通分子方法。其中对可疑菌株进行生化指标的检测必须完成至少四项：接触酶阳性、氧化酶阴性、ｄ-甘露醇阴性、戊二酸盐阴性排除可疑菌落再进行下一步实验，实验周期长；致病性检测不能单独作为检测方法，常作辅助鉴定手段；普通pcr方法灵敏度一般，并且需要进行pcr扩增、琼脂糖凝胶电泳两个步骤，时间至少在3小时，电泳实验中用到的核酸染料污染环境，具有高致癌性，对人体健康有一定影响。此外，对于其它植物病菌，实验室常用的16srdna通用引物即可作为常规pcr方法的引物进行pcr扩增测序来鉴定，但是16srdna通用引物针对假单胞属下细菌鉴定特异性极差，难以鉴定到种。因此，对于口岸检疫来说，日常进出口检测业务量大，利用普通方法鉴定菌株效果不好，检测效率低，同时，检测周期长会增加进出口商运营成本。为此，本发明申请旨在提供一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒及其检测方法。技术实现要素：鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒及其检测方法，利用特异的扩增引物和taqman探针，采用real-timepcr技术，通过ct值对待检样品进行菜豆晕疫病菌定性分析。为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒，包括试剂盒主体和如表1所列试剂；其中试剂盒主体包括：盒身，所述盒身中空，内含冷冻液；盒内放置试剂；盒身上方设有盒盖；盒身一侧设有抽屉，抽屉内放置待测样品的dna。试剂盒一侧还设有带小孔的空腔，空腔与试剂盒内冷冻液采用弹性塑料片隔开，冷冻液凝固时体积膨胀，塑料片向空腔一侧弯曲，缓减膨胀的压力，从而避免试剂盒被胀破。表1试剂盒所含试剂内含试剂规格pcrforwardprimer2odpcrreverseprimer2odtaqmanprobe2od扩增预混液1mlrnase-freeddh2o1.5ml荧光校正液1ml阳性对照100μl阴性对照100μl优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒中pcrforwardprimer序列为：5’-gtgggtacatctggaatc-3’；以菜豆晕疫病菌argk基因为模板设计得到。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒中pcrreverseprimer序列为：5’-ctgacatcctccgtattg-3’；以菜豆晕疫病菌argk基因为模板设计得到。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒中taqmanprobe序列为：5’-(fam)atcaccgtcgcaccatacga(tamra)-3’；以菜豆晕疫病菌argk基因为模板设计得到。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒中扩增预混液包括：dna聚合酶、2×pcr缓冲液（500mm/lkcl、100mm/ltris-hcl、150mm/lmgcl2、1mg/ml明胶）、dntp贮备液、rnaseh。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒中荧光校正液包括：rox荧光染料。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒中阳性对照采用菜豆晕疫病菌标准菌株所提取纯化的dna。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒中阴性对照采用健康大豆种子提取纯化dna。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒采用-20℃保存，密闭保存，防止污染。一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr检测方法，包括如下操作步骤：1、探针及引物稀释；2、配置pcr反应液；3、进行real-timepcr反应；4、实验结果分析。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr检测方法，其中步骤1探针及引物稀释包括：探针和引物在开盖前离心5min，然后根据nmol数，使用rnase-freeddh2o配制成浓度为xμmoligo溶液。配制浓度为xμmoligo溶液加入rnase-freeddh2o体积：v(ml)=nmol数/x优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr检测方法，其中步骤2配置pcr反应液时按表2所述方法配制：表2pcr反应液的配制方法试剂使用量扩增预混液10μlpcrforwardprimer(10μm)0.4μlpcrreverseprimer(10μm)0.4μltaqmanprobe0.2μlrnase-freeddh2o6.6μldna2μl荧光校正液0.4μltotal20μl优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr检测方法，其中步骤3进行real-timepcr反应时两步法pcr扩增标准程序，具体包括如下步骤：holdstage:预变性reps:195℃30秒pcrstage:pcr反应reps：4095℃5秒60℃30秒。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr检测方法，其中步骤4实验结果分析的具体方法为：在反应结束后确认real-timepcr反应扩增曲线及ct值。如果待测样品２个平行样检测结果ct≥40，阳性对照检测20≤ct≤36并出现典型的扩增曲线，阴性对照和空白对照结果正常，此时可以判定该样品未检出菜豆晕疫病菌。如果待测样品２个平行样检测结果ct≤36，阳性对照检测20≤ct≤36并出现典型的扩增曲线，阴性对照和空白对照结果正常，此时可以判定该样品检出菜豆晕疫病菌。如果待测样品２个平行样检测结果36＜ct＜40并出现典型的扩增曲线，阳性对照检测20≤ct≤36并出现典型的扩增曲线，阴性对照和空白对照结果正常，此时应适当增加dna模板量后重做实时荧光pcr检测。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr检测方法，该方法除需要上述检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒外，还需要real-timepcr扩增仪、高压灭菌离心管和微量移液枪和高压灭菌枪头。有益效果：菜豆晕疫病菌本身存在毒素抗性编码基因argk，该基因只存在于菜豆晕疫病菌和丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(p．syringaepv．actinidiae)两种细菌中；采用argk作为检测的靶基因具有高度的特异性。而传统方法采用16srdna通用引物作为检测靶基因，对于丁香假单胞属特异性低，在genebank中检索至少有23个菌种与之配对，难以鉴定到种。本发明申请设计taqman探针和扩增引物，优化体系得到最佳体系配置及扩增程序条件，生产了基于taqman探针菜豆晕疫病菌real-timepcr检测试剂盒，多次试验结果证明该试剂盒能够从供试菌株中快速、特异地检测出菜豆晕疫病菌，另外试剂盒灵敏度远高于常规pcr，检测dna的阈值达到180fg/μl。试剂盒的设计能够进一步方便测试，试剂盒内设有了冷冻液，试剂和样品dna在测试过程中能够保持低温，使测试结果更精确。本发明可大大节约菜豆晕疫病菌检测时间成本，整个实验仅需50分钟；检测所用试剂无毒环保。检测实验过程操作简单，配置好体系上机即可，全称可视；试剂盒中试剂耗材成本低，适用于口岸检疫部门大批量检测业务；试剂盒灵敏度远高于常规pcr，检测dna的阈值达到180fg/μl；试剂盒特异性强，样本一旦出现阳性结果，即可判定含有我国检疫性有害生物菜豆晕疫病菌。附图说明图1是本发明一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr检测方法的扩增曲线。图2是本发明一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr检测方法探针对菜豆晕疫病菌的灵敏度检测扩增曲线。图3是本发明一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr检测方法阳性菌株致病性检测图。图4是本发明一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr检测试剂盒示意图。图5是本发明一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr检测试剂盒切面示意图。具体实施方式为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。实施例1如附图4和5所示，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒，包括试剂盒主体和如表3所列试剂；其中试剂盒主体包括：盒身3，所述盒身3中空，内含冷冻液8；盒内放置试剂2；盒身上方设有盒盖1；盒身3一侧设有抽屉4，抽屉4内放置待测样品的dna5。试剂盒一侧还设有带小孔的空腔6，空腔6与试剂盒内冷冻液8采用弹性塑料片7隔开，冷冻液8凝固时体积膨胀，塑料片7向空腔6一侧弯曲，缓减膨胀的压力，从而避免试剂盒被胀破。表3试剂盒所含试剂内含试剂规格pcrforwardprimer2odpcrreverseprimer2odtaqmanprobe2od扩增预混液1mlrnase-freeddh2o1.5ml荧光校正液1ml阳性对照100μl阴性对照100μl进一步地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒中pcrforwardprimer序列为：5’-gtgggtacatctggaatc-3’。进一步地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒中pcrreverseprimer序列为：5’-ctgacatcctccgtattg-3’。进一步地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒中taqmanprobe序列为：5’-(fam)atcaccgtcgcaccatacga(tamra)-3’。进一步地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒中扩增预混液包括：dna聚合酶、2×pcr缓冲液（500mm/lkcl、100mm/ltris-hcl、150mm/lmgcl2、1mg/ml明胶）、dntp贮备液、rnaseh。进一步地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒中荧光校正液包括：rox荧光染料。进一步地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒中阳性对照采用菜豆晕疫病菌标准菌株所提取纯化的dna。进一步地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒中阴性对照采用健康大豆种子提取纯化dna。进一步地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒采用-20℃保存，密闭保存，防止污染。实施例2本实施例提供了一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr检测方法，包括如下操作步骤：1、探针及引物稀释；2、配置pcr反应液；3、进行real-timepcr反应；4、实验结果分析；优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr检测方法，其中步骤1探针及引物稀释包括：探针和引物在开盖前离心5min，然后根据nmol数，使用rnase-freeddh2o配制成浓度为xμmoligo溶液。配制浓度为xμmoligo溶液加入rnase-freeddh2o体积：v(ml)=nmol数/x优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr检测方法，其中步骤2配置pcr反应液时按表4所述方法配制：表4pcr反应液的配制方法试剂使用量扩增预混液10μlpcrforwardprimer(10μm)0.4μlpcrreverseprimer(10μm)0.4μltaqmanprobe0.2μlrnase-freeddh2o6.6μldna2μl荧光校正液0.4μltotal20μl优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr检测方法，其中步骤3进行real-timepcr反应时两步法pcr扩增标准程序，具体包括如下步骤：holdstage:预变性reps:195℃30秒pcrstage:pcr反应reps：4095℃5秒60℃30秒。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr检测方法，其中步骤4实验结果分析的具体方法为：在反应结束后确认real-timepcr反应扩增曲线及ct值。如果待测样品２个平行样检测结果ct≥40，阳性对照检测20≤ct≤36并出现典型的扩增曲线，阴性对照和空白对照结果正常，此时可以判定该样品未检出菜豆晕疫病菌。如果待测样品２个平行样检测结果ct≤36，阳性对照检测20≤ct≤36并出现典型的扩增曲线，阴性对照和空白对照结果正常，此时可以判定该样品检出菜豆晕疫病菌。如果待测样品２个平行样检测结果36＜ct＜40并出现典型的扩增曲线，阳性对照检测20≤ct≤36并出现典型的扩增曲线，阴性对照和空白对照结果正常，此时应适当增加dna模板量后重做实时荧光pcr检测。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr检测方法，该方法除需要上述检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒外，还需要real-timepcr扩增仪、高压灭菌离心管和微量移液枪和高压灭菌枪头。实施例3本实施例提供了一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr检测的具体方法，包括如下步骤：1.1供试菌株不同植株个体样本分离菜豆晕疫病菌（pseudomonassavastanoipv．phaseolicola）菌株3份，菜豆细菌性萎蔫病菌（curtobacteriumflaccumfacienspv.flaccumfaciens）、菜豆普通细菌性疫病（xanthomonasaxonopodispv.phaseoli）、番茄细菌性叶斑（pseudomonassyringaepv.tomato）、西瓜细菌性果斑（acidovoraxavenaesubsp.citrulli）、番茄细菌性溃疡（clavibactermichiganensissubsp.michiganensis）、番茄细菌性疮痂（xanthomonascampestrispv.vesicatoria）菌株样本各1份。1.2核酸制备挑取单菌落，液氮研磨，采用tiangendp320植物基因组dna提取试剂盒提取菌株dna，用超微量核酸蛋白仪测量提取dna浓度，-20℃保存。1.3探针的特异性测试以菜豆晕疫病菌不同植株个体样本分离菌株dna及其他供试菌株dna作为模板，对该探针进行实时荧光pcr的特异性检测。按试剂盒说明书配置pcr反应液，同时设置阳性对照、阴性对照及空白对照。反应体系如下表5：表5pcr的特异性检测反应体系试剂使用量扩增预混液10μlpcrforwardprimer(10μm)0.4μlpcrreverseprimer(10μm)0.4μltaqmanprobe0.2μlrnase-freeddh2o6.6μldna2μl荧光校正液0.4μltotal20μl1.4探针的灵敏度测试用超微量核酸蛋白仪测量阳性样本dna浓度，再将提取dna进行10倍梯度稀释，稀释10管：1.8μg/ml、1.8×10-1μg/ml、1.8×10-2μg/ml、1.8×10-3μg/ml、1.8×10-4μg/ml、1.8×10-5μg/ml、1.8×10-6μg/ml、1.8×10-7μg/ml、1.8×10-8μg/ml、1.8×10-9μg/ml。各取2μl作为模板进行实时荧光pcr扩增，反应体系同1.3。以ct≤36作为阳性标准阈值。1.5real-timepcr反应按照两步法pcr扩增标准程序进行扩增：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。real-timepcr仪器设置探针报告荧光基团fam和淬灭荧光基团tamra。以ct≤36作为阳性标准阈值。1.6阳性菌株接种real-timepcr反应得到阳性结果的菌株，再接种到健康的豆科作物上，置于24℃气候培养箱，观察发病症状。2结果分析2.1探针的特异性采用该试剂盒所提供的探针，对不同植株个体样本分离得到菜豆晕疫病菌菌株及其他供试菌株进行实时荧光pcr的特异性检测。结果显示探针对3份菜豆晕疫病菌菌株样本及阳性对照表现特异性阳性扩增，荧光信号明显增加，而非目标菌株及阴性对照、空白对照均没有检测到荧光信号（如附图1）。表明该试剂盒探针对菜豆晕疫病菌具有非常好的特异性。2.2探针的灵敏度测试超微量核酸蛋白仪测量阳性样本dna浓度为18μg/ml，将原液dna模板与10倍梯度稀释后的dna模板同时进行实时荧光pcr扩增，18μg/ml、1.8μg/ml、1.8×10-1μg/ml、1.8×10-2μg/ml、1.8×10-3μg/ml、1.8×10-4μg/ml均有明显的扩增曲线，1.8×10-5μg/mlct值大于36（如附图2），因此该混合探针灵敏度为1.8×10-4μg/ml，即180fg/μl，远远高于普通pcr灵敏度。2.3阳性菌株致病性检测将real-timepcr反应得到阳性结果的菌株，再接种到健康的豆科作物上，置于24℃气候培养箱，三天后观察子叶发病情况，子叶皱缩变形，出现明显褐斑和晕圈（如附图3），与菜豆晕疫病菌致病症状相同。综上所述，本发明实施例提供了一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒及其检测方法，利用特异的扩增引物和taqman探针，采用real-timepcr技术，通过ct值对待检样品进行菜豆晕疫病菌定性分析。以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。<110>甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心<120>一种用于检测菜豆晕疫病菌taqmanreal-timepcr试剂盒及其检测方法<160>3<210>1<211>111<212>dna<213>菜豆晕疫病菌(pseudomonassavastanoipv．phaseolicola)<400>1gtgggtacatctggaatc18<210>2<211>114<212>dna<213>菜豆晕疫病菌(pseudomonassavastanoipv．phaseolicola)<400>2ctgacatcctccgtattg18<210>3<211>20<212>dna<213>菜豆晕疫病菌(pseudomonassavastanoipv．phaseolicola)<400>3atcaccgtcgcaccatacga20当前第1页12