水稻3花小穗基因LF1在提高禾本科粮食作物产量中的用途的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，尤其是水稻3花小穗基因lf1在提高禾本科粮食作物产量中的用途。

背景技术：

每穗粒数是水稻等禾本科粮食作物产量构成的重要因素之一，而穗(花序)形态性状，比如各级枝梗的数目以及其上小穗的着生密度等，都会影响每穗粒数的形成，目前克隆的与每穗粒数相关基因也主要是通过影响穗形态性状起作用。实际上每穗粒数的形成还有一个重要的影响因素——小穗内小花的数目，这一现象一直没有引起人们的重视，因为正常水稻一个小穗内小花数目是恒定的——只包含一个可育小花，只能产生一个籽粒，但根据前人和我们的研究结果表明，小穗内小花数目由基因调控，一些基因的改变会导致小穗内小花数目的增加(称之为―3花小穗”)，这提供了一种新的增加穗粒数的可能育种途径，理论上可以增加籽粒数3倍，对进一步提高水稻产量具有十分重要的意义。但目前这一现象产生的分子机制还不明确，还难以实现―3花小穗”的分子设计育种。

在水稻等禾本科植物中，花序结构(即稻穗)可以分为枝梗和小穗(颖花)两种类型。目前，已克隆的影响水稻每穗粒数的基因主要是通过调控一次/二次枝梗数目及小穗的着生密度来实现的。短穗基因sp1编码1个多肽转运蛋白家族的跨膜蛋白，正向调控水稻枝梗分生组织的伸长，sp1突变体枝梗原基的发育能够正常起始，但枝梗的延伸出现严重障碍，导致短穗(lietal.,2009b)。直立穗基因dep1编码g蛋白γ亚基，dep1是显性的功能性获得性突变，能促进细胞分裂，降低穗颈节长度并使稻穗变密、枝梗数增加、每穗籽粒数增多，从而促进水稻增产(huangetal.,2009；yanetal.,2007)。dep2基因编码一个植物特有的未知蛋白，正向调控穗轴和枝梗的伸长，突变后直立密穗，虽稻穗长度变短，但每穗粒数基本没变化(lietal.,2010；zhuetal.,2010)。osspl14/ipa1基因编码1个类squamosal启动子结合蛋白的转录因子，osspl14的一个点突变扰乱了osmir156对osspl14的调控，使得水稻分蘖减少、穗粒数和千粒重增加，同时茎秆变得粗壮，抗倒伏能力增强，进而提高产量(jiaoetal.,2010；miuraetal.,2010)。osckx2/gn1a基因编码一种降解细胞分裂素的酶，是产量的负向调控子，其突变后使得细胞分裂素在花序分生组织中累积，促进生殖器官数量的增加，从而增加了颖花数量，最终提高水稻的产量(ashikarietal.,2005)。ghd7基因编码的蛋白质为一含cct结构域蛋白家族成员，其表达和功能受光周期调控，主要通过增加二次枝梗数来增加每穗粒数(xueetal.,2008)。

小穗是所有禾本科作物特有的花序结构，根据前人的研究，将小穗发育过程大致分为八个阶段(ikedaetal.,2004):

第一阶段，副护颖原基形成且发育不完全；

第二阶段，护颖原基形成和副护颖原基发育停止；

第三阶段，外稃原基形成和护颖继续伸长；

第四阶段，内稃原基形成，护颖和外稃继续伸长；

第五阶段，浆片原基形成，浆片原基位于外稃一侧，护颖和内外稃持续伸长；

第六阶段，雄蕊原基形成，排列呈环状，外稃一侧的雄蕊原基发育迟缓；

第七阶段，心皮原基形成，在花分生组织外稃一侧形成心皮原基，雄蕊原基开始形成勤俭节约和花丝；

第八阶段，胚珠和花粉形成，早期心皮原基包裹着胚珠，开始形成雌配子体，同时花粉粉粒在花药中产生。

小穗由一对苞叶和数目不等的小花组成，而水稻等稻族的小穗又具有与禾本科其他物种不一样的小穗结构，由一对副护颖、一对护颖和一个顶生小花组成。水稻等其他稻族物种的副护颖和护颖是非常小的颖片状器官，其来源存在一定的争议。通常认为副护颖等同于其他禾本科小穗极度退化的颖片，而关于护颖的来源流行两种观点：一种认为护颖和副护颖一样，都是退化的颖片；而另一种主张一对护颖―代表”一对―退化的侧生小花”，护颖实际上是侧生小花的外稃退化而来，因此认为水稻为―3花小穗”。最近几个研究支持―3花小穗”假说，g1/longsterilelemma编码duf640结构域蛋白，属于植物特异的新基因家族，在g1突变体中，护颖被转变为外稃状器官(yoshidaetal.,2009)；eg1编码一个脂酶基因，在eg1突变体中，护颖被转变为外稃状器官，暗示eg1特化护颖特性(lietal.,2009a)；pap2编码osmads34，调控护颖的发育，在pap2极端突变体中，最明显的表型就是伸长了的具有外稃特征的护颖(gaoetal.,2010)；此外，osmads1/lhs1特化内外稃特征，本身并不在护颖中表达，但是其在护颖中异位表达会引起护颖外稃化(wangetal.2016)；nsg和asp1基因的突变也会产生外稃化的护颖(wangetal.,2013；yoshidaetal.,2012)。这些结果暗示原始稻族的小穗可能是一种―3花”小穗，包含两个侧生小花和一个顶生小花，后来侧生小花退化只剩下外稃，外稃进一步退化成为护颖(图1)。

虽然g1、osmads34/pap2、eg1、nsg、asp1和osmads1/lhs1等基因的研究为―3花小穗”假说提供了一定的支持，暗示护颖可能是侧生小花的退化外稃，但在这些突变体或转基因材料中，护颖只是―恢复”成外稃状器官或延长变大，而并没有―恢复”成具有雌雄蕊等内轮花器官的侧生小花，还不是一个真正意义上的―3花小穗”，更缺乏应用价值。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题为提高粮食产量提供一种新选择。

本发明提供了水稻3花小穗基因lf1在提高禾本科粮食作物产量中的用途。

具体的，所述的禾本科粮食作物为水稻或小麦。

具体的，所述的lf1基因编码的蛋白质具有如seqidno.3示的氨基酸序列。该氨基酸序列中，第192位氨基酸由pro突变为leu。

具体的，所述的lf1基因具有如seqidno.1或seqidno.2核苷酸序列。seqidno.1所示的核苷酸序列为lf1基因的基因组序列，第2308位碱基由c突变为t。seqidno.2所示的核苷酸序列为lf1基因的cdna序列，第575位碱基由c突变为t。

本发明还提供了提高禾本科粮食作物产量的制剂，其主要活性成分为lf1基因编码的蛋白质。

具体的，所述的禾本科粮食作物为水稻或小麦。

具体的，所述的lf1基因编码的蛋白质具有如seqidno.3示的氨基酸序列。

具体的，所述的lf1基因具有如seqidno.1或seqidno.2核苷酸序列。

育种上将一个完整的稻穗称为“穗”，而本申请中的小穗是指发育学上的小穗，相当于育种学上的一个颖花(图1)。此外，这里所指的小穗内小花数目的增加不同于大家所熟知的―簇生稻”，簇生稻在本质上并没有改变小花的结构，仍然由副护颖、护颖和顶生小花组成，2～3个颖花因枝梗的缩短而聚集在一起，并不能增加籽粒的数目(图1)。而本申请所指的―3花小穗”本质上改变了小穗的结构，是指“护颖”恢复成了完整的“侧生小花”，再加上一个“顶花”就形成了―3花小穗”，可以增加籽粒数目3倍(图1)。

本发明的有益效果：在本申请中，公开了一个功能获得性突变体lateralflorets1(lf1)。在lf1小穗中，产生了可以分化出相对正常花器官的侧生花分生组织。利用图位克隆的方法分离了lf1基因，发现lf1基因属于植物hd-zpiiii家族rev分枝中的oshb1。在lf1突变体中，lf1基因由于microrna165/166调控位点突变而发生异位表达，从而导致小穗内2个“侧生小花”的恢复，这样加上原本的一个顶生可育小花，lf1突变体一个小穗的小花数目就达到了3个(称为“3花小穗”)。这提供了一种新的增加穗粒数的育种途径，对进一步提高水稻产量具有十分重要的意义。

附图说明

图1、lf1突变体及其野生型抽穗期的小穗表型观察

a1-a4，野生型(wt)小穗。a1，体视镜分析；a2，电镜分析；a3，纵切片组织学分析；a4，横切片组织学分析；b1-b4，含一个侧生小花的lf1突变体小穗；b1，体视镜分析；b2，电镜分析；b3，纵切片组织学分析；b4，横切片组织学分析；c1-c4，含两个侧生小花的lf1突变体小穗；c1，体视镜分析；c2，电镜分析；c3，纵切片组织学分析；c4，横切片组织学分析；标尺＝500μm。

图2、lf1突变体及其野生型幼穗分化期的小穗形态观察a-d，野生型小穗；e-h，lf1小穗；星号表示雄蕊。标尺＝100μm。

图3、花器官特征基因在lf1突变体及其野生型幼穗分化期的小穗中的原位杂交分析a1-a4及c1-c4，第四发育阶段到第八发育阶段的野生型小穗；b1-b4及d1-d4，第四发育阶段到第八发育阶段的lf1小穗；a1-a4及b1-b4，osmads16基因的原位杂交分析；c1-c4及d1-d4，dl基因的原位杂交分析；星号表示雄蕊；黑色剑头表示lf1小穗侧生小花。标尺＝50μm。

图4、lf1基因的图位克隆

a，lf1基因的精细定位；b，lf1基因突变体位点是mirna的调控位点；c，lf1基因在野生型和突变体幼穗中的实时定量表达分析，纵坐标表示基因相对表达量；d，lf1基因在突变的lf1超表达转基因植株(moe1-3)和正常的lf1超表达转基因植株(wtoe1-3)中的实时定量表达分析，纵坐标表示基因相对表达量；e，超表达转基因植株表型观察；f，突变的lf1超表达转基因植株小穗表型数据。标尺＝500μm。

野生型cdna5’ctgggatgaagcctggtccgg3’

mirna1653’cccccuacuucggaccaggcu5’

lf1cdna5’ctgggatgaagcttggtccgg5’

图5、lf1基因表达模式分析

a，lf1基因在小于5cm发育时期野生型小穗和各轮花器官中的实时定量表达分析；b1-b4，lf1基因在第四发育阶段到第八发育阶段野生型小穗顶生小花中的原位杂交分析；b5-b8，lf1基因在lf1突变体小穗发育第四发育阶段到第八发育阶段顶生小花中的原位杂交分析；c1-c9，lf1基因在第四发育阶段到第八发育阶段lf1突变体小穗顶生小花及侧生小花中的原位杂交分析，其中c5-c9为c1-c4中侧生小花部位的放大图。<0.5,幼穗小于0.5cm；0.5-2,幼穗大小为0.5-2cm；2-5，幼穗大小为2-5cm；标尺＝50μm。

图6、lf1蛋白的氨基酸序列比对分析

图7、lf1基因系统进化和蛋白分析

a，lf1基因的系统进化；b，lf1基因亚细胞定位分析；c，lf1蛋白自激活分析。

图8、lf1基因调控途径的分子机理

a1～a3、b1～b3，osh1基因在小穗第四发育阶段到第八发育阶段的原位杂交分析；c1～c3、d1～d3，osmads6基因在小穗第四发育阶段到第八发育阶段的原位杂交分析；e1～e3、f1～f3，osmads15基因在小穗第四发育阶段到第八发育阶段的原位杂交分析；a1～a3、c1～c3和e1～e3为野生型；b1～b3、d1～d3和f1～f3为lf1突变型；g，osh1、osmads6和osmads15基因在野生型和突变体之间表达差异的实时定量pcr分析；h，osh1基因模式图；i，lf1蛋白对osh1基因的染色质免疫沉淀分析。标尺＝50μm。

具体实施方式

本发明实施例中使用的材料：野生型水稻材料缙恢10号(wt)和三花小穗突变体(lf1)均由购买自西南大学水稻研究所；m-mlv逆转录酶、高保真dna聚合酶pfu、taqdna聚合酶、t4dna连接酶、限制性内切酶、pmd19-t载体、trizol试剂盒、dna凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、λ-hindiiidnamarker及dl5,000dnamarker购自takara公司；dnamarkeriii购自天根生化科技(北京)有限公司；氨苄青霉素(ampicillin，amp)和卡拉霉素(kanamycin，kan)为sigma公司产品；引物合成和dna测序由上海英俊生物技术有限公司完成；其它化学试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；ptck303、pa7植物表达载体、大肠杆菌dh5α、农杆菌lba4404在biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买。

表1实施例中所用到的引物

实施例1lf1突变体的获得及表型分析

利用甲基磺酸乙酯(ems)诱变自育优良恢复缙恢10号，在后代突变群体中，发现一个遗传稳定的水稻―3花小穗”功能获得性(显性)突变体，经多代自交，遗传稳定，命名为lateralfloret1(lf1)。

在水稻抽穗期，取lf1与野生型的小穗进行形态学和组织学分析。形态学分析：一方面将新鲜的小穗放置于尼康sm1500体视显微镜下进行观察、解剖和照相；另一方面利用日立su3500电子扫描显微镜在-40°对新鲜的小穗进行扫描电镜的观察。组织学分析：将新鲜的小穗，在faa固定液(50％乙醇，0.9m冰醋酸和3.7％甲醛)中，4°固定过夜，经过乙醇梯度脱水，二甲苯置换，最后将材料包埋在石蜡(sigma)中。将包埋后的材料切成8mm的切片，然后将切好的材料放置于涂满多聚赖氨酸的载玻片上，用二甲苯脱蜡，利用不同浓度的

野生型水稻的小穗从基部到顶部依次由一对副护颖、一对护颖和一个正常的顶生小花构成(图1a1-a4)。顶生小花包括4轮花器官：第1轮是锁在一起的外稃和内稃，第2轮是两枚浆片，第3轮是6枚雄蕊，第4轮是1枚雌蕊(图1a1，a2)。护颖着生在顶生小花两侧(图1a3)。

在lf1突变体小穗中，护颖叶腋处产生侧生小花(图1b1～b4，c1～c4)。78％的lf1小穗具有一朵侧生小花(图1b1～b4)，4％具有两朵侧生小花(图1c1～c4)。这些侧生小花包含所有内轮花器官：内稃、浆片、雄蕊和雌蕊。突变体的护颖没有转化成正常外稃，略有退化(图1b1～b4，c1～c4)。此外，lf1突变体的顶生小花和副护颖发育正常(图1b1～b4，c1～c4)。结果表明lf1小穗产生了具有内轮花器官的侧生小花。

在水稻小穗早期发育分化的sp4-sp8期(即小穗发育时期4-8，参考itoh等2005年的文献)，取新鲜野生型和lf1小穗，利用日立su3500电子扫描显微镜在-40°观察。野生型中，在sp4时期副护颖和护颖已经形成，同时顶花内、外稃原基开始形成(图2a)；随后的sp5-8，顶花内部的雄蕊、雌蕊原基依次起始分化，内外稃稃扩大(图2b，图2c，图2d)。与野生型相比，lf1小穗在sp4时期没有明显的差异，然而，大约在sp5/6时期，lf1护颖原基叶腋处最早形成了侧生花分生组织(图2e)；在sp7-8时期侧生花分生组织开始形成内稃及浆片、雄蕊和雌蕊内轮花器官原基(图2f，图2g)，侧生小花的发育时期比顶生小花的发育时期晚2～3个时期(图2h)。在整个生育时期，lf1的顶生小花没有异常，与野生型发育一致。综上所述，在小穗发育早期过程中，lf1小穗形成了侧生花分生组织。

为了进一步证实lf1小穗侧生小花的花器官特性，在突变体和野生型sp4到sp8期的小穗中进行了已知花器官特征基因osmads16和dl的原位杂交比较分析。提取野生型幼穗总rna并进行反转录，以反转录产物为模板，扩增osmads16和dl基因编码区序列(引物m16-f和m16sp6-r序列见表1，引物dl-f和dlsp6-r序列见表1)，利用roche公司的digrnalabelingkit进行体外转录合成rna探针；小穗的包埋和切片同上；切片预处理、杂交和免疫检测的具体操作流程按照文献(李云峰博士论文，2008)进行。结果显示，在sp4-8时期中，osmads16在野生型和lf1突变体顶生小花浆片和雄蕊中表达(图3a1–a4,b1-b4)。不出所料，在sp5-8时期中，osmads16在lf1突变体侧生小花中强表达(图3b2-b4)。在sp5-8时期中，dl在野生型和lf1突变体顶生小花外稃表达(图3c1,d1)，进入sp7-8时期后，dl在野生型和lf1突变体雌蕊表达(图3c2–c4，d2–d4)。在sp6-8时期中，dl在lf1突变体侧生小花中异位表达(图3d2–d4)。以上结果进一步暗示了，在小穗发育早期，lf1突变体形成了具有内轮花器官的侧生小花。

实施例2lf1基因的遗传分析、基因定位和图位克隆

lf1突变体与西大1a(由西南大学水稻研究所提供)进行杂交。共得到404株表现型与lf1突变体表型相同的f2植株用于lf1的遗传分析和基因定位。f2分离群体显示突变体与野生型植株分离比符合3：1的分离比例，提示lf1突变体表型受一对显性核基因控制。

初步定位：采用bsa(混合分群分析)法进行。选取均匀分布于水稻12条染色体上gramene、thericegenomicresearchprogram网站已公布的480对ssr引物，以及根据西大1a与缙恢10号之间的插入/缺失片段差异、snp(单核苷酸多态性)自主开发的in/del和dcaps标记引物(zin23f/r、zin29f/r、zin27f/r、zin67f/r和zln67引物序列见表1)，在亲本lf1和西农1a间检测多态性，其中有102对引物显示多态性。选取f2代分离群体中的10株野生型和10株突变体单株叶片分别等量混合，分别提取正常池和突变池基因组dna，用这102对引物在正常和突变基因池中进行基因连锁分析。经pcr扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染后，一般将具有母本带型的单株记为a,具有父本带型的单株记为b,具有双亲带型的单株记为h，经数据分析和作图并将重组率转化为遗传距离，筛选与基因lf1连锁的ssr标记，发现lf1与第3染色体短臂上in/del标记zln23、zln27和zln29连锁。用连锁标记分析131株lf1突变体与西大1a杂交后的f2分离群体中的隐性突变单株，结果显示，基因lf1与标记zln23、zln29和zln27之间的遗传距离分别为1.81cm、1.15cm和5.34cm，位于zln29和zln27之间(图4a)。

精细定位：在zln29和zln27之间进一步在进一步筛选和开发标记，其中ssr标记rm14281、rm14301和snp标记snp-16、snp-20在亲本间表现多态性(rm14281、snp-20、snp-16、rm14301引物序列表1)。用这4对引物分析lf1突变体与西大1a杂交后的所有f2分离群体中的273株隐性突变单株，标记rm14281、snp-20、snp-16和rm14301与基因lf1之间的重组子分别为7、5、2、8和12，rm14281、snp-20重组子包含在rm14281重组子中，snp-16重组子包含在rm14301重组子中，表明lf1位于标记snp-20和snp-16之间；在结合已公开的水稻基因组序列结果(http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/)，snp-20和snp-16之间物理距离为95.3-kb，包含13个注释基因。

测序分析显示，在lf1突变体中msu注释基因loc_os03g01890(http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/)第六个外显子上有一个c碱基到t碱基的替换(图4a)。进一步进行基因功能预测http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/分析和文献查阅显示，该突变位点位于水稻microrna165/166的目标序列上(图4b)。众所周知，micrornas通过结合到目标mrnas的互补序列抑制基因表达，从而介导mrnas的降解。因此，推测正常的loc_os03g01890基因可能受到了抑制，而突变的loc_os03g01890基因不受microrna165/166的降解。

为了证实此推测，采用实时定量pcr分析loc_os03g01890基因(引物qlf1-f和qlf1-r序列见表1，以actin为内标，引物actin-f和actin-r序列见表1)在野生型和突变体小穗中的表达情况。利用天根的rnapreppureplantrnapurificationkit试剂盒提取突变体lf1和野生型植株的小穗rna。取2微克的总rna用superscriptiiireversetranscriptasekit试剂盒进行反转录。定量pcr利用thesybrpermixextaqiikit(takara)试剂盒appliedbiosystems7500real-timepcrsystem中进行扩增，选用actin作为内参(引物actin-f和actin-r序列见表1)。每个反应进行三个重复取平均值计算表达水平。结果表明，loc_os03g01890基因在突变体幼穗中的表达均高于野生型幼穗(图4c)。

进一步，构建loc_os03g01890基因与gfp构建融合表达载体并进行遗传转化分析。首先以pa7质粒(biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)中包含的gfp序列为模板，扩增gfp编码框序列(引物gfp-f和gfp-r，序列见表1),并连接到植物表达载体ptck303(biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)上，构建成ptck303-gfp中间载体，然后分别扩增野生型缙恢10号和lf1突变体的的loc_os03g01890基因编码框序列(引物lf1oe-f和lf1oe-r序列见表1)，分别连接到ptck303-gfp上，构建成ptck303-wlf1-gfp和ptck303-mlf1-gfp表达载体，转入农杆菌后转化化野生型缙恢10号。

在转入突变的loc_os03g01890(ptck303-mlf1-gfp)基因的超表达植株中，与lf1突变体表型相似，53.3％的lf1小穗具有一朵侧生小花，2.2％具有两朵侧生小花(图4f)，且loc_os03g01890基因的表达量上升(图4d)。此结果说明，在lf1突变体和转入了突变的loc_os03g01890基因的超表达植株中，microrna165/166可能无法降解突变的loc_os03g01890mrnas，从而异位表达loc_os03g01890诱导侧生小花的产生。然而，在转入了正常的loc_os03g01890(ptck303-wlf1-gfp)基因的超表达植株中，虽然loc_os03g01890基因的表达量上升，小穗表现为正常表型(图4d，e)。这可能是由于microrna165/166对正常的loc_os03g01890基因的降解作用引起的。因此，以上结果暗示lf1突变体的显性表型是由microrna165/166无法降解突变的loc_os03g01890mrnas，从而异位表达loc_os03g01890引起的。即，loc_os03g01890基因就是lf1基因。先前有研究表明该基因调控水稻叶片极性发育，但是没有报道过在水稻小穗及花器官发育中承担功能。

实施例3lf1基因的表达模式分析

利用实时定量pcr(引物qlf1-f和qlf1-r序列见表1，以actin为内标，引物actin-f和actin-r序列见表1)，检测lf1基因在幼穗及各轮花器官中的表达情况，结果表明lf1在不同时期幼穗中都有表达，尤其在2cm以下的幼穗中表达明显高于其它时期幼穗。在抽穗期，lf1在护颖及四轮花器官都有表达(图5a)。

利用原位杂交进一步分析lf1基因在小穗中的表达模式(引物lf1-f和lf1sp6-r序列见表1)。在sp4时期，lf1在野生型和lf1突变体小穗的顶生小花中大量表达(图5b1,b5)。在sp5到sp6时期，lf1在外稃、内稃、及雄蕊原基表达(图5b2,b5)。在sp7到sp8时期，lf1在护颖和内/外稃、浆片、雄蕊和雌蕊四轮花器官中表达(图5b3,b4,b7,b8)。在lf1的侧生小花中，lf1在护颖原基叶腋处侧生花分生组织的前体细胞强表达(图5c1,c2,c5-c7)。随后，lf1在侧生小花各轮花器官原基处表达(图5c3,c8)。在接近成熟时期时，lf1在侧生小花中的表达减弱(图5c4,c9)。因此，以上结果暗示了lf1基因在护颖原基叶腋处形成侧生花分生组织的部位异位表达。此表达模式与microrna165/166无法降解突变的lf1mrnas，从而导致lf1的在护颖叶腋处异位表达的假设一致。

实施例4lf1编码蛋白的序列和生物信息学分析

蛋白序列在phytozome网站通过blast获得，使用10^-5阈值(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！search？show＝blast)。利用mega5.0进行进化分析。进化树的构建使用最大似然法，采用jones–taylor–thorntonmatrix-basedmodel，bootstrap值为500次重复。

lf1基因被预测为编码iii类同源异型结构域－亮氨酸拉链蛋白(hd-zipiii)的oshb1基因。hd-zipiii蛋白包含4个结构域,从n端到c端依次是同源异型结构域(能够结合特异的dna序列,调控靶基因表达)、亮氨酸拉链结构域(形成同源或异源二聚体并行使功能)、start结构域(假定的脂质/类固醇结合受体)和mekhla结构域(可能与外界信号接收与传递有关)(图6)。此外，序列比对分析暗示hd-zipiii基因序列在单子叶植物和双子叶植物中具有很高的保守性(图6)。进化树分析显示，被子植物hd-zipiii基因分为rev、phb/phv和cna/hb8三个分支，此结果与以往的研究结果一致。水稻基因组包括oshb1-oshb5共5个hd-zipiii基因。oshb1和oshb1属于rev分支，oshb3和oshb4属于phb/phv分支，oshb5属于cna/hb8分支(图7a)。以往的研究显示，此家族基因调控植物胚胎发育，分生组织形成，维管发育，侧生器官极性发育等生长发育过程。在此研究中，鉴定了lf1/oshb1调控侧生花分生组织发育的新功能。

为了确定lf1蛋白的定位，利用水稻原生质体瞬时表达系统来研究lf1蛋白的定位。扩增lf1的编码区(引物为lf1-gfp-f和lf1-pa7-r，序列见表1)并连接到了35s-gfp-nos(pa7)表达载体(biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)中，构建gfp-lf1融合表达蛋白。然后将gfp和gfp-lf1的质粒转入水稻原生质体中，28℃过夜孵化，用奥林巴斯激光扫描共焦显微镜来观察gfp的荧光。

gfp-lf1融合蛋白和单独gfp蛋白在水稻原生质体中瞬时表达后，表达gfp-lf1融合蛋白的细胞在细胞核检测到绿色荧光，表达gfp蛋白的细胞在整个细胞中均检测到绿色荧光。此结果暗示mal蛋白定位于细胞核中(图7b)。

随后，利用酵母双杂交试验检测lf1蛋白的转录激活活性。扩增lf1基因编码区(引物lf1-pgbkt7-f和lf1-pgbkt7-r序列见表1)并连接到酵母表达载体pgbkt7(clontech)中获得pgbkt7-lf1载体。将pgbkt7-lf1，pgbkt7-53+pgadt7-t(阳性对照)和pgbkt7-lam+pgadt7-t(阴性对照)(clontech公司的酵母双杂交系统自带的阳性系统和阴性系统。阳性对照是pgbkt7-53作为一个质粒编码一个小鼠p53蛋白和gal4dna-bd的融合基因。阴性对照是pgbkt7-lam编码一个人laminc蛋白和gal4dna-bd的融合基因)分别转到y2hgold酵母菌株中。转化株通过在sd/-trp或者sd/-ade/-his/-trp平板中进行筛选(ade为腺嘌呤硫酸盐，his为组氨酸，trp为色氨酸)。并利用x-α-gal检测蛋白的转录激活活性。

将gal4dna结合域-lf1融合蛋白(pgbkt7-lf1)转入y2hgold细胞中，用gal4序列检测其转录激活作用。结果显示，转入pgbkt7-lf1蛋白和阳性对照的y2hgold细胞能在sd/-ade/-his/-trp培养基中生长，并显示x-α-gal活性。而转入阴性对照的y2hgold细胞不能在sd/-ade/-his/-trp培养基中生长(图7c)。以上结果暗示lf1蛋白具有转录激活活性。

实施例5lf1基因调控“3花小穗”的分子机理分析

以往的研究表明，revoluta(rev)(lf1在拟南芥中的同源基因)直接上调stm(osh1在拟南芥中的同源基因)在腋生分生组织细胞中的表达，以确保腋生分生组织的启动。为了检测lf1是否直接激活osh1在lf1小穗侧生分生组织中表达，首先进行qrt-pcr分析osh1(引物qosh1-f和qosh1-r序列见表1，以actin为内标，引物actin-f和actin-r序列见表1)在野生型和lf1突变体小穗中的表达情况。结果显示，与野生型相比，osh1在lf1突变体小穗中的表达水平显着增加(图8g)。随后，利用原位杂交分析、比较osh1在野生型和lf1突变体小穗中的表达模式(引物osh1-f和osh1sp6-r序列见表1)。在野生型小穗中，在sp4至sp6时期，osh1在花分生组织和花托处特异性高水平表达(图8a1，a2)。到sp7时期心皮原基形成时，osh1仅在小穗轴微弱表达(图8a3)。在lf1突变体顶生小花中，osh1在sp4至sp8时期的表达模式与在野生型小穗中的表达模式类似(图8b1-b3)。不出所料，在sp5至sp8时期，osh1在lf1突变体侧生花分生组织强表达(图8b2，b3)。

随后，利用染色质免疫共沉淀试验(chip)结合实时荧光定量pcr(qrt-pcr)检测lf1在体内是否能直接结合到osh1的启动子序列上。取转入突变的loc_os03g01890(pca-mlf1-gfp)基因的超表达植株经甲醛交联与超声破碎后，利用抗gfp蛋白的抗体富集lf1基因结合的启动子序列，沉淀此免疫复合物后，经解交联并回收dna片段。将回收的dna片段与input样品进行比较，igg抗体作为阴性对照。利用sybrpermixextaqiikit(takara)试剂盒，在appliedbiosystems7500定量仪上，检测被富集的osh1基因启动子区域dna片段(引物osh1-af/r、osh1-bf/r、osh1-cf/r、osh1-df/r序列见表1)。数据统计过程中进行了三个生物学重复和三个技术重复。结果显示，lf1蛋白可以结合到osh1启动子上包含1-6个hd-zipiii的保守结合序列(atgat)的4个区域(图8h，i)。以上结果暗示lf1蛋白可激活分生组织特征基因osh1在lf1小穗的侧生小花区域表达。

利用qrt-pcr，还检测到花分生组织特征基因osmads6(引物qosmads6-f和qosmads6-r序列见表1)和osmads15(引物qosmads15-f和qosmads15-r序列见表1)在lf1突变体小穗中的表达量极显著高于野生型小穗中的表达量(图8g)。随后，利用原位杂交详细分析了osmads6和osmads15的表达模式(引物osmads6-f、osmads6sp6-r和osmads15-f、osmads15sp6-r序列见表1)。在sp4时期，osmads6和osmads15在野生型和lf1突变体顶花分生组织强表达(图8c1，d1，e1，f1)。从sp5到sp8时期，osmads6主要在野生型和lf1突变体顶生小花内稃边缘、浆片和心皮中表达(图8c2，c3，d2，d3)，而osmads15在两者的所有花器官均表达(图8e2，e3，f2，f3)。因此，osmads6和osmads15在野生型和lf1突变体顶生小花中的表达模式并没有差异。然而，在sp5到sp8时期，osmads6和osmads15在lf1突变体侧花分生组织强表达(图8d2，d3，f2，f3)。因此，猜测花分生组织特征基因osmads6和osmads15可能也参与了lf1侧生小花的起始发育过程。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本实用新型的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>西南大学

<120>水稻3花小穗基因lf1在提高禾本科粮食作物产量中的用途

<130>2017

<160>58

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>7923

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>lf1基因组序列

<220>

<221>突变位点

<222>(2308)..(2308)

<223>n为c或t

<400>1

ctctctctctctcccgtgctgctctcccttctcctctcctcaattaccacgccgcagccg60

cagccccccaaccctagctagtacggcgggcgacctgagggggtagctgcctacctctat120

acctgctatctccgttcgatccgggtcgggctcgtgctgctgggggcgggggcaatcaat180

cggcgagctcggtgatccatggccgtggctgtggggtggctgtgagggtgcccccggcgg240

cgctcccctccgcgcctgccggcgagggggctcggactgaaggtcgccacactctaccgc300

cccacccatgctccctccgcgcgcgatctaagctaggcctaatctagggttcctgattgc360

ttttccattttcgcccggacggaccaaactactactatctatctatctagcttcttctgc420

tgcttctcgtgctgctcctgcatatttttttaaaatttttatttcatctcatttccgggt480

ttctctcatttatcatctactccgtaccactattagcaagcaacccattttccccccttt540

ttttcttgagatttttgtgggcgaattcgagtaacctttactccccccattctaggaagc600

ggtttcttttagcatggctttgttttttttcttttcctctcccgctttcttagttaatca660

actttaccatatctgttgcgtgcacttcaatccctgtcatttgtatccttcccctagatt720

ttgatgctcaaacgattgttttcaccaaatgctgagtcaaaagaactctccttttctttt780

ttcccccagggatctaggcgagctgaaaattgaagtgcaggcaaggagataagagcagcg840

tccaaattgtgagtacttcattagcaggagggtagtggttgtgcttgcttggctcctttg900

caatttggctttggcgaggtagcaatggctgcggcagtggcaatgcgagggagtagcagt960

gatggaggtggctatgataaggtttccgggatggactccggtaaatatgtgcgctacacg1020

cctgagcaggtggaggcgcttgagcgggtgtacgccgattgccccaagccaacctcctcc1080

cgcaggcagcaactgctgcgtgagtgccccatacttgctaacattgagcccaagcagatc1140

aaggtctggttccagaacagaaggtaatgataatagaattgaatctttctacgtttgttc1200

tctgtgacaaaaacttattatggcagttttccctgattgtttcatctgtcacctgaaata1260

acatttcgttagtttccttctggggaggctatggttctaaaatgctgcgttgttgtgatg1320

atgagcggtattttcatatgaggggagctgcaatgccaattgtttatcatttcatttgtt1380

tgcgcaccagcaaaatgtagtataattactttagctgacggctctgcatgtatatgattt1440

tttcgtttttcatgttcgctgaagtggatacttgtgcttgtgttgctctaggtgccggga1500

taagcagcggaaggagtcttcacggcttcaggctgtcaacaggaaattgacggcaatgaa1560

caagctacttatggaagagaatgagcgactccagaagcaggtctcccaattggttcatga1620

gaatgcccacatgcgacagcagctgcagaatgtaagctcttgatgtgctggtgctgatgt1680

tgtcccccatgcataaacatgttctcactgaaatgctatctattctttgtgcattttgtt1740

atacgcatggcatgtccggggatgtgttgttctgtactgtatattgtagattagtataac1800

tttaaaatttgatgtatgtgtagctataccagctggggccatatgcgtcagttcctttag1860

aattgatatatgaattaatcctcagaatgtccatgagatcgctagatttcactgataaca1920

ccacttgcttgggtgcagactccgctggcaaatgatacaagctgtgaatcaaatgtgact1980

acccctcaaaaccctttaagggatgcaagtaacccctctgggtaagtaaatagttctgag2040

tgactcaggtagaattattgttggatggacttgctctttcgatatcatgctatcttaact2100

gccttttatcttgttctaggctcctttcaattgcagaggagaccttgacagagttcctct2160

caaaggctactggtacagctattgattgggtccagatgcctgggatgaaggttccatgct2220

agcactgtttgtttttttgttctgtgatttgtgctaagaggtttttacttgaagtgctta2280

ctacccttttgttttcatgatgtaagcntggtccggattcggttggtattgtggccattt2340

cacatggttgccgtggtgttgctgcccgtgcctgtggtttggtgaacctagaaccaacaa2400

aagtaagtgttgtagctatttgggtacatgggtttggtatttttatgttacctcagtatt2460

ccctgtctgtatgttttctgaagcatctattttggtgatagcaagcctatccaccagtca2520

cttagttttctttgtgtgcaaatggttagaaacctactacctccatcccaaaatatagcc2580

aaaagttgctatatcaaaaatcctatcagaagtgcctcctgaacacattgctgccgagtg2640

tggaattaagacacactgtaattcactttaataaatactaaactttgaagatgtcacttt2700

agaggtctaatgatttcatgtctgccaactgttatcatcaaatttaatcgtgaagataag2760

cagatatcttgctttttttgttactttattcaggagattttgtgtctcatagaactttgt2820

tacgtaggtggtagagatattgaaagatcgtccatcttggttccgtgattgtcgaaacct2880

ggaagtctttacaatgattccagcaggaaatggaggaacggttgaacttgtctacacaca2940

ggtgaacactgtttcattttacattgtataatggtatatcctcagtcttctctatcaatg3000

catgtgcttcatgccatgaacattattacttgtttttgcttacagttgtatgctccaaca3060

actttagttcctgcacgagatttttggacgttacggtacacaaccacaatggaagatggc3120

agtcttgtggtatgtatgaacatgaacactgttttcaccccacaatgagtctcaatgtga3180

tgttacccttgctaatattcctccatctccaaggtctgtgagagatctttaagtggttca3240

gggggcggtccaagtgctgcctctgctcagcaatatgtgagagcggaaatgcttccaagt3300

ggatacctggttcgcccatgtgaaggtgggggatcaattgtgcacatagtggaccatctg3360

gatcttgaggtatttttcacacttttgtacagttgaaccatgttttttgtcctttgatgt3420

aggaccatttttgtatcctgtcaaactaataatacaatttggtttaatctttcaggcatg3480

gagtgttcctgaggtgcttcggccactctatgaatcttcaagggtagtcgctcagaaaat3540

gactactgcggtaagctgtcgtgaaatgatattcagctcaaatttcattgatgtgattac3600

aagttcatcatttcaagtgaaacttgtttttaatgaactcttcaagtttcataacattgg3660

attttttttagaaaaaataaaataaaaatccaatattatgaaacttgaagagttcaagct3720

aatgataaagtttgtgttttggataaagcttataatattggatatgtggtgaaaatgatt3780

tatatgggttggtacaactaatgataaaatttgccttttggatatgttgaacagttcatt3840

ttctgcaatctactttatactaaccttttattgtctatcctatatatcaaggcactccgg3900

cacatcagacaaattgctcaagaaacaagtggggaagtggtgtatgccttggggaggcaa3960

ccagcagtgctacggacttttagtcaaaggctgagcaggtgatttttttataaattatta4020

ctcagcaattaatatttttttcacctgtttaatctaacaccaatattatgcttttcttag4080

aggctttaacgatgccattagtggtttcaatgatgatgggtggtctataatgggcggaga4140

cggtgttgaagatgtagttattgcttgcaactcaactaagaaaattaggagtaacagcaa4200

tgctggcatcgcctttggagcccccggaggtattatatgtgctaaggcatcaatgttact4260

gcaggtaagggtaatcattatcagctcattagggtgcagatgacccctctgtatgtagcg4320

tcattttccaaggaagggaaaaaaaaacttttttagtgattcaacatatgcaagcacata4380

aataaattgctcggctgtattaacatttgatagtgagatcctaatgagatttttgatgtt4440

ttgcctggtcctacacctgatgataatttgtttgatttatttcattactttcttttttgc4500

ggagaaacttatttcataaaactgctgccatcgctggtgtgaatataaaagcagtgtcac4560

aaaagttttttcctcagagacattgaacacacagaatgagttctttggaactagatttcc4620

atgttcaaaacttgtagctgttaaatcatgttaatccatacgtcttcttttccttctttg4680

gtatttcagagtgttcctccagcagtactggttcgatttctgagggagcatagatctgaa4740

tgggccgattacaatattgatgcatatttggcttcaactctgaaaacaagtgcatgttca4800

cttactgggttgcgacccatgagattttctgggagccaaatcatcattccacttgctcac4860

acagttgagaatgaggaggtatattttcctgaatatggggaaagtctgttttttgtgcgc4920

ttgttgctgttgaactgatttgagtaatggttatagcaaactacttattttcattcttgc4980

tgatctgtttacattgtcatagtggatagtgactatctagttaattccattgtcggacat5040

agttttgttattattgatttattttcattaacttgaaaaaaaaacgaacagattcttgaa5100

gttgttcgccttgagggtcaacctcttactcatgatgaagctcttctttcaagggatatc5160

cacctgcttcaggtaagacactaaatgccattgctatgttttgtctgtatatgtactgtg5220

ttgcttctcaattgagaaaactagtagcttttaatacatgtaatttcttgcttaatatgt5280

tgatcattgtatctattcgtgagcatctttggctctatttcatcttatcaaattattgta5340

gagttaaatatgctgtgtaacaactaccaacccataagcctatctttatccgggcatatt5400

aagtttgttgctacacccttttttcccccttcgaagtacagtcaaagatgcaaagctttt5460

tatgaggcttgtaaatattccagtttgctaatatacccttatcttttgcagctctgcact5520

ggaatagacgagaagtctgtgggatcctcctttcagcttgtctttgcaccgattgatgat5580

ttcccagatgaaactccattgatttcttctggcttccgtgttataccacttgatatgaaa5640

acagttaagcgctgccaaattccaaattacattatccattacccttttgactgttcccta5700

ggtccatatgtgctttatttgctgttgcattaatctgtgatgagtcgtggatgtctttta5760

gcttttctaggaacctcagttttattcatttgttcagtgagttaaccctggccaatttta5820

actcttcataaacaattgttttggttgttctaagacaaataatctcttggaaatgtttca5880

tttattctcccctctagtccgctttaaatgttccagctctgtccacagagaccccaaaaa5940

aaagctattttgtaaactcccattaaattcagaaaaaaaactgttaaattggttatttgc6000

atcttgattgtatcaccagttagaactaatagaggcatttggtttcaaatattcccttgg6060

aaaaataaagcaagtatgtatgaaccaagcttgctaaaatgtttatcctttttgaaccag6120

aggtagtactatatttttggtcggctgccactaaatttttaggctctgtgcccaaaagtt6180

taaccgtcacatttcatgcaggatggtgcatcctctggtaggacattagatttggcatct6240

agtcttgaagtaggttcagcaacagctcaagcctccggagatgcatctgcagatgattgt6300

aacttgcgatctgttctgacgatcgcttttcaattcccttacgagttgcatctccaagac6360

agtgttgcagctatggctcgccaatatgtccgtagcattgtttctgctgtgcaaagagtg6420

tcaatggctatctctccctctcaaactggtctaaatgccggacagaggataatctctggt6480

ttccctgaagcagcaacccttgctcgatgggtttgccagagctaccagtaagtgtactcg6540

tagtttcttcctgtgcagtagtgatgatatttaataagaataaatttgatagttttccat6600

gttggttgcaagctgacaaaatattattatgccgtcgctcagttaccatctaggggtaga6660

gttacttagtcaatcagatggagatgcagaacaattgttgaagatgctatggcattacca6720

agatgctattttgtgctgctcattcaaggtatctgatgaattcaactcgatcaatgttcc6780

atcatttgatctaatatcatttagtctattaagtactattacagaccactcgatcaatgt6840

ttacccatgtattacagaccactcgatcaatgtttacccatgtactctaaaacttatcgc6900

ttgtccagctgacctacaatcttttcatgcatttttcaatctaacaaaaactggctctgt6960

taataataacctaatagttagaaagaactggctctgttaataatgacctagtaatagtta7020

gtacttagtacagacctaacgagtgcttagaccctcaaacgtgttttcaacagggtgatt7080

ttgctatatttttccctttgagtaaatgctctcaattttttgtaaggtttacacttttga7140

cactaatgcgatcatcggaccacaatatttgctatcttgtatgacagaaatgttttggtt7200

tctttcaggaaaaaccggtgtttacatttgccaacaaagcaggactggacatgctagaaa7260

cttcccttgtcgccttacaggacctcacattggacaggatctttgatgagcctggaaaag7320

aagcattgttctcaaacattcccaaattgatggagcaggtagaaactccttttcgcttaa7380

ctcacacccttaagtgcatcatatttcagaaatcgctgagttgaaataaattaaaattat7440

gttacattgcttaccatttttttccctgttttgtgtttagggccatgtctacctgccatc7500

aggcgtgtgcatgtcaggaatgggtcggcatgtttctttcgatcaggccgtggcttggaa7560

agtgcttgccgaggatagcaatgttcactgcctggccttctgtttcgtcaactggtcctt7620

tgtgtgaccatcccacatccactgcgaagtgaagattcatttttgcttgttcaagactgt7680

tttgcactagatctagacctgagaatctagtagtatttgcgaaatttctcgcttatgtaa7740

atgtaatctcgctcccattccatcaagtacccaagtacaaggcagtgtggccaagtggtt7800

ttagttgtagggggatcggagcaatcctgacggttgggtacttgggttccttccagcaat7860

gtaaaatcggatcctgtagggcgtcgaaaactgcattggcattggcaagattcttcgaaa7920

tgc7923

<210>2

<211>2520

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>lf1基因cdna编码框序列

<220>

<221>突变位点

<222>(575)..(575)

<223>n为c或t

<400>2

atggctgcggcagtggcaatgcgagggagtagcagtgatggaggtggctatgataaggtt60

tccgggatggactccggtaaatatgtgcgctacacgcctgagcaggtggaggcgcttgag120

cgggtgtacgccgattgccccaagccaacctcctcccgcaggcagcaattgctgcgtgag180

tgccccatacttgctaacattgagcccaagcagatcaaggtctggttccagaacagaagg240

tgccgggataagcagcggaaggagtcttcacggcttcaggctgtcaacaggaaattgacg300

gcaatgaacaagctacttatggaagagaatgagcgactccagaagcaggtctcccaattg360

gttcatgagaatgctcacatgcgacagcagctgcagaatactccgctggcaaatgataca420

agctgtgaatcaaatgtgactacccctcaaaaccctttaagggatgcaagtaacccctct480

gggctcctttcaattgcagaggagaccttgacagagttcctctcaaaggctactggtaca540

gctattgattgggtccagatgcctgggatgaagcntggtccggattcggttggtattgtg600

gccatttcacatggttgccgtggtgttgctgcccgtgcctgtggtttggtgaacctagaa660

ccaacaaaagtggtagagatattgaaagatcgtccatcttggttccgtgattgtcgaaac720

ctggaagtctttacaatgattccagcaggaaatggaggaacggttgaacttgtctacaca780

cagttgtatgctccaacaactttagttcctgcacgagatttttggacgttacggtacaca840

accacaatggaagatggcagtcttgtggtctgtgagagatctttaagtggttcagggggc900

ggtccaagtgctgcctctgctcagcaatatgtgagagcggaaatgcttccaagtggatac960

ctggttcgcccatgtgaaggtgggggatcaattgtgcacatagtggaccatctggatctt1020

gaggcatggagtgttcctgaggtgcttcggccactctatgaatcttcaagggtagtcgct1080

cagaaaatgactactgcggcactccggcacatcagacaaattgctcaagaaacaagtggg1140

gaagtggtgtatgccttggggaggcaaccagcagtgctacggacttttagtcaaaggctg1200

agcagaggctttaacgatgccattagtggtttcaatgatgatgggtggtctataatgggc1260

ggagacggtgttgaagatgtagttattgcttgcaactcaactaagaaaattaggagtaac1320

agcaatgctggcatcgcctttggagcccccggaggtattatatgtgctaaggcatcaatg1380

ttactgcagagtgttcctccagcagtactggttcgatttctgagggagcatagatctgaa1440

tgggccgattacaatattgatgcatatttggcttcaactctgaaaacaagtgcatgttca1500

cttcctgggttgcgacccatgagattttctgggagccaaatcatcattccacttgctcac1560

acagttgagaatgaggagattcttgaagttgttcgccttgagggtcaacctcttactcat1620

gatgaagctcttctttcaagggatatccacctgcttcagctctgcactggaatagacgag1680

aagtctgtgggatcctcctttcagcttgtctttgcaccgattgatgatttcccagatgaa1740

actccattgatttcttctggcttccgtgttataccacttgatatgaaaacagatggtgca1800

tcctctggtaggacattagatttggcatctagtcttgaagtaggttcagcaacagctcaa1860

gcctccggagatgcatctgcagatgattgtaacttgcgatctgttctgacgatcgctttt1920

caattcccttacgagttgcatctccaagacagtgttgcagctatggctcgccaatatgtc1980

cgtagcattgtttctgctgtgcaaagagtgtcaatggctatctctccctctcaaactggt2040

ctaaatgccggacagaggataatctctggtttccctgaagcagcaacccttgctcgatgg2100

gtttgccagagctaccattaccatctaggggtagagttacttagtcaatcagatggagat2160

gcagaacaattgttgaagatgctatggcattaccaagatgctattttgtgctgctcattc2220

aaggaaaaaccggtgtttacatttgccaacaaagcaggactggacatgctagaaacttcc2280

cttgtcgccttacaggacctcacattggacaggatctttgatgagcctggaaaagaagca2340

ttgttctcaaacattcccaaattgatggagcagggccatgtctacctgccatcaggcgtg2400

tgcatgtcaggaatgggtcggcatgtttctttcgatcaggccgtggcttggaaagtgctt2460

gccgaggatagcaatgttcactgcctggccttctgtttcgtcaactggtcctttgtgtga2520

<210>3

<211>839

<212>prt

<213>artificial

<220>

<223>lf1基因编码蛋白序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(192)..(192)

<223>xaa为pro或leu

<400>3

metalaalaalavalalametargglyserserseraspglyglygly

151015

tyrasplysvalserglymetaspserglylystyrvalargtyrthr

202530

progluglnvalglualaleugluargvaltyralaaspcysprolys

354045

prothrserserargargglnglnleuleuargglucysproileleu

505560

alaasnilegluprolysglnilelysvaltrppheglnasnargarg

65707580

cysargasplysglnarglysgluserserargleuglnalavalasn

859095

arglysleuthralametasnlysleuleumetglugluasngluarg

100105110

leuglnlysglnvalserglnleuvalhisgluasnalahismetarg

115120125

glnglnleuglnasnthrproleualaasnaspthrsercysgluser

130135140

asnvalthrthrproglnasnproleuargaspalaserasnproser

145150155160

glyleuleuserilealaglugluthrleuthrglupheleuserlys

165170175

alathrglythralaileasptrpvalglnmetproglymetlysxaa

180185190

glyproaspservalglyilevalalaileserhisglycysarggly

195200205

valalaalaargalacysglyleuvalasnleugluprothrlysval

210215220

valgluileleulysaspargprosertrppheargaspcysargasn

225230235240

leugluvalphethrmetileproalaglyasnglyglythrvalglu

245250255

leuvaltyrthrglnleutyralaprothrthrleuvalproalaarg

260265270

aspphetrpthrleuargtyrthrthrthrmetgluaspglyserleu

275280285

valvalcysgluargserleuserglyserglyglyglyproserala

290295300

alaseralaglnglntyrvalargalaglumetleuproserglytyr

305310315320

leuvalargprocysgluglyglyglyserilevalhisilevalasp

325330335

hisleuaspleuglualatrpservalprogluvalleuargproleu

340345350

tyrgluserserargvalvalalaglnlysmetthrthralaalaleu

355360365

arghisileargglnilealaglngluthrserglygluvalvaltyr

370375380

alaleuglyargglnproalavalleuargthrpheserglnargleu

385390395400

serargglypheasnaspalaileserglypheasnaspaspglytrp

405410415

serilemetglyglyaspglyvalgluaspvalvalilealacysasn

420425430

serthrlyslysileargserasnserasnalaglyilealaphegly

435440445

alaproglyglyileilecysalalysalasermetleuleuglnser

450455460

valproproalavalleuvalargpheleuarggluhisargserglu

465470475480

trpalaasptyrasnileaspalatyrleualaserthrleulysthr

485490495

seralacysserleuthrglyleuargprometargpheserglyser

500505510

glnileileileproleualahisthrvalgluasnglugluileleu

515520525

gluvalvalargleugluglyglnproleuthrhisaspglualaleu

530535540

leuserargaspilehisleuleuglnleucysthrglyileaspglu

545550555560

lysservalglyserserpheglnleuvalphealaproileaspasp

565570575

pheproaspgluthrproleuileserserglypheargvalilepro

580585590

leuaspmetlysthraspglyalaserserglyargthrleuaspleu

595600605

alaserserleugluvalglyseralathralaglnalaserglyasp

610615620

alaseralaaspaspcysasnleuargservalleuthrilealaphe

625630635640

glnpheprotyrgluleuhisleuglnaspservalalaalametala

645650655

argglntyrvalargserilevalseralavalglnargvalsermet

660665670

alaileserproserglnthrglyleuasnalaglyglnargileile

675680685

serglypheproglualaalathrleualaargtrpvalcysglnser

690695700

tyrhistyrhisleuglyvalgluleuleuserglnseraspglyasp

705710715720

alagluglnleuleulysmetleutrphistyrglnaspalaileleu

725730735

cyscysserphelysglulysprovalphethrphealaasnlysala

740745750

glyleuaspmetleugluthrserleuvalalaleuglnaspleuthr

755760765

leuaspargilepheaspgluproglylysglualaleupheserasn

770775780

ileprolysleumetgluglnglyhisvaltyrleuproserglyval

785790795800

cysmetserglymetglyarghisvalserpheaspglnalavalala

805810815

trplysvalleualagluaspserasnvalhiscysleualaphecys

820825830

phevalasntrpserpheval

835

<210>4

<211>21

<212>rna

<213>artificial

<220>

<223>图4中mirna165

<400>4

cccccuacuucggaccaggcu21

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>引物zin-23f

<400>5

cccaggacagagtaggcacaat22

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>zin-23r

<400>6

cgctgtgcctatggaaacatact23

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>zin29f

<400>7

cattaccaacctctacgcgc20

<210>8

<211>25

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>zin29r

<400>8

cgtactcacggttgtaatactctcc25

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>zin27f

<400>9

gcagctagtgcaagacggag20

<210>10

<211>19

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>zin27r

<400>10

gatgagccgtatgatccgc19

<210>11

<211>21

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>zin67f

<400>11

catgttccaagtattcctggg21

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>zin67r

<400>12

agctagggcactagcattcg20

<210>13

<211>23

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>rm14281f

<400>13

catgcatgcaactctgctaaacg23

<210>14

<211>23

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>rm14281r

<400>14

atcaggatccaggaaatcgaacc23

<210>15

<211>25

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>snp-20f

<400>15

cctctttctatatcatgactcgatc25

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>snp-20r

<400>16

catggaaggtgggaggacag20

<210>17

<211>24

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>snp-16f

<400>17

gctctctctcttgttcccctctca24

<210>18

<211>18

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>snp-16r

<400>18

catggatcggcgatgggt18

<210>19

<211>23

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>rm14301f

<400>19

tcatcatcatcagtccagcatcg23

<210>20

<211>24

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>rm14301r

<400>20

gcggcgattgaattgtttcttagg24

<210>21

<211>29

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>lf1oe-f

<400>21

gccggtaccatggctgcggcagtggcaat29

<210>22

<211>37

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>lf1oe-r

<400>22

gccactagtcacaaaggaccagttgacgaaacagaag37

<210>23

<211>30

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>gfp-f

<400>23

gccactagtatggtgagcaagggcgaggag30

<210>24

<211>35

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>gfp-r

<400>24

gccgagctcttacttgtacagctcgtccatgccgt35

<210>25

<211>43

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>lf1-gfp-f

<400>25

acggcatggacgagctgtacaagatggctgcggcagtggcaat43

<210>26

<211>47

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>lf1-pa7-r

<400>26

tgatgcattcccgggtctagatcacacaaaggaccagttgacgaaac47

<210>27

<211>22

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>actin-f

<400>27

tgctatgtacgtcgccatccag22

<210>28

<211>22

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>actin-r

<400>28

aatgagtaaccacgctccgtca22

<210>29

<211>25

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>qlf1-f

<400>29

ctgtgaatcaaatgtgactacccct25

<210>30

<211>26

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>qlf1-r

<400>30

ggacgatctttcaatatctctaccac26

<210>31

<211>21

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>qosh1-f

<400>31

caggacctggagcttcgccag21

<210>32

<211>23

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>qosh1-r

<400>32

ggagagcgtgttgagctgcgtct23

<210>33

<211>24

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>qosmads6-f

<400>33

agagaaagacgcaactgatgatgg24

<210>34

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>qosmads6-r

<400>34

aggcttgctgcatggctctg20

<210>35

<211>26

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>qosmads15-f

<400>35

gtcacaaacacctcatgggagaggat26

<210>36

<211>25

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>qosmads15-r

<400>36

cacattcttctgcctctccaccagt25

<210>37

<211>22

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>lf1-f

<400>37

cggattcggttggtattgtggc22

<210>38

<211>45

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>lf1sp6-r

<400>38

agatttaggtgacactatagaacgttaaagcctctgctcagcctt45

<210>39

<211>17

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>m16-f

<400>39

tacggcggcaaccacga17

<210>40

<211>42

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>m16sp6-r

<400>40

agatttaggtgacactatagaatccaagcacagttgcacacc42

<210>41

<211>18

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>dl-f

<400>41

gccgcaatggatctcgtg18

<210>42

<211>41

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>dlsp6-r

<400>42

agatttaggtgacactatagaatcacaacgaagggtgctct41

<210>43

<211>18

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>osh1-f

<400>43

cagttcgtgatgatggac18

<210>44

<211>42

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>osh1sp6-r

<400>44

agatttaggtgacactatagaactaaaaccgacccgagttga42

<210>45

<211>23

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>m6-f

<400>45

gacgcaactgatgatggaacaag23

<210>46

<211>43

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>m6sp6-r

<400>46

agatttaggtgacactatagaagacgcagaaggtgcaaacagc43

<210>47

<211>28

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>osmads15-f

<400>47

tgaagcggatagagaacaagatcaacag28

<210>48

<211>47

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>osmads15sp6-r

<400>48

agatttaggtgacactatagaacacattcttctgcctctccaccagt47

<210>49

<211>29

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>lf1-pgbkt7-f

<400>49

gccgaattcatggctgcggcagtggcaat29

<210>50

<211>37

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>lf1-pgbkt7-r

<400>50

gccgtcgaccacaaaggaccagttgacgaaacagaag37

<210>51

<211>31

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>osh1-af

<400>51

gtgatttatgatatatgatttggagatgatt31

<210>52

<211>24

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>osh1-ar

<400>52

gatttcactccattcccaaatcat24

<210>53

<211>26

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>osh1-bf

<400>53

ccttgacatacaaccaatgataccat26

<210>54

<211>23

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>osh1-br

<400>54

tattagttcaggccatcacccgt23

<210>55

<211>26

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>osh1-cf

<400>55

catcgtctaaagtacacgcaagattc26

<210>56

<211>28

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>osh1-cr

<400>56

gagaaacacgatacgctttactactact28

<210>57

<211>26

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>osh1-df

<400>57

ctctaatgatagcttggagcaagttc26

<210>58

<211>26

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>osh1-dr

<400>58

agtgtgtatgatagatgggaccagat26