禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌等的五重PCR检测方法及检测试剂盒与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的多重pcr引物组、包括该引物组的五重pcr检测试剂盒以及利用该引物组的五重pcr检测方法。

背景技术：

随着规模化养禽业的快速发展，疫病的发生和流行也相应增加，导致养禽业经济效益下降。重要的细菌性传染病如禽大肠杆菌病、鸡白痢、鸡伤寒等重要细菌病严重危害养禽业。

目前，国内主要依靠抗生素防治细菌病，但由于长期、不合理地使用抗生素导致：一方面产生广泛的耐药性，另一方面药物残留直接影响了动物产品的安全。因此，加强对这些细菌性疾病的长期监测和研究，对养禽业和公共卫生都具有重要意义。

国内外对细菌性疾病的诊断和监测技术种类繁多，主要包括：细菌分离培养及生化鉴定、分子生物学技术、免疫学技术等。pcr技术因其特异性强、敏感性高、操作简单、检测快速等优点而被广泛应用。

目前，针对禽大肠杆菌和不同血清型沙门菌建立了多种检测方法，然而，没有针对禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的快速检测及鉴别诊断pcr方法。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明采用了如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种能够准确、快速、稳定、特异性和灵敏性高的检测禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的引物组，其特征在于，包括：特异性扩增禽大肠杆菌phoa基因的引物对ecphoa-f和ecphoa-r；特异性扩增鸡伤寒沙门菌glgc基因的引物对sgglgc-f和sgglgc-r；特异性扩增鸡伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌spec基因的引物对sgpspec-f和sgpspec-r；特异性扩增肠炎沙门菌sdfⅰ基因的引物对sesdfⅰ-f和sesdfⅰ-r；特异性扩增鼠伤寒沙门菌stm4495基因的引物对ststm4495-f和ststm4495-r，

各个引物的核苷酸序列分别为：

ecphoa-f，5’-ggcaatacactcactatgcgctg-3’,

ecphoa-r，5’-aggattcgcagcatgatcctg-3’；

sgglgc-f，5’-cgtcgctataaagcggaatatgtc-3’，

sgglgc-r，5’-ccttttcaaaacatacgcgagtag-3’；

sgpspec-f，5’-gttgccgtaccggtcgtaacg-3’，

sgpspec-r，5’-ttcctgacgggcatcgacggc-3’；

sesdfⅰ-f，5’-gatgtggttggttcgtcactg-3’，

sesdfⅰ-r，5’-gcgagacctcaaacttactcag-3’；

ststm4495-f，5’-cagcggtatgatgcggtagt-3’，

ststm4495-r，5’-tcaccggtggacatgcctgc-3’。

本发明提供的引物组，还具有这样的特征：引物对ecphoa-f和ecphoa-r用于扩增的目的片段的大小为761bp；引物对sgglgc-f和sgglgc-r用于扩增的目的片段的大小为83bp；引物对sgpspec-f和sgpspec-r用于扩增的目的片段的大小为249bp；引物对sesdfⅰ-f和sesdfⅰ-r用于扩增的目的片段的大小为409bp；引物对ststm4495-f和ststm4495-r用于扩增的目的片段大小为569bp。

本发明的另一个目的是提供一种五重pcr检测试剂盒，用于检测禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌，其特征在于，包括：用于建立pcr反应体系的2×pcr预混液和引物组，其中，pcr反应体系用于引物组中的各个引物对进行特异性扩增，引物组上述的引物组。

本发明提供的五重pcr检测试剂盒，还具有这样的特征：其中，2×pcrpremix的体积为12.5μl，在引物组中，引物对ecphoa-f和ecphoa-r的体积各为0.5μl，引物对sgglgc-f和sgglgc-r的体积各为0.2μl，引物对sgpspec-f和sgpspec-r的体积各为0.3μl，引物对sesdfⅰ-f和sesdfⅰ-r的体积各为0.4μl、引物对ststm4495-f和ststm4495-r的体积各为0.5μl。

本发明的再一个目的是提供一种检测禽大肠杆菌、鸡伤寒门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌的五重pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，基于待检测细菌制备得到pcr模板；步骤2，制备特异性引物组，采用权利要求1或2中任意一项的引物组制备得到特异性引物组；步骤3，进行pcr扩增反应，基于步骤1得到的pcr模板，采用步骤2得到的特异性引物组建立得到包括的引物组的pcr反应体系，然后采用该pcr反应体系在预定pcr反应参数条件下进行pcr扩增反应得到pcr扩增产物；步骤4，进行电泳检测，对扩增产物进行电泳检测得到电泳结果，根据电泳结果判定是否出现禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌或鼠伤寒沙门菌。

本发明提供的五重pcr检测方法，还具有这样的特征：步骤1中得到的pcr模板为待检测细菌的菌液，具体过程为：将待检测细菌的菌株接种至lb液体培养基，在温度为37℃的条件下培养至od600＝1.0，得到的菌液即为pcr模板。

本发明提供的五重pcr检测方法，还具有这样的特征：步骤1中得到的pcr模板为细菌粗提dna，具体过程为：将待检测细菌的菌株接种至lb液体培养基，在温度为37℃的条件下培养至od600＝1.0，得到菌液，然后将1ml该菌液在10000-12000r/min下离心1-2min，去上清，加0.1-0.5ml灭菌超纯水重悬，煮沸5-10min，然后在10000-12000r/min下离心3-5min，得到的上清即为细菌粗提dna。

本发明提供的五重pcr检测方法，还具有这样的特征：步骤3的pcr反应体系包括：12.5μl的2×pcrpremix，1.0μl的模板、7.7μl的超纯水，和引物组，在引物组中，引物对ecphoa-f和ecphoa-r的体积各为0.5μl，引物对sgglgc-f和sgglgc-r的体积各为0.2μl，引物对sgpspec-f和sgpspec-r的体积各为0.3μl，引物对sesdfⅰ-f和sesdfⅰ-r的体积各位0.4μl、引物对ststm4495-f和ststm4495-r的体积各为0.5μl。

本发明提供的五重pcr检测方法，还具有这样的特征：制备特异性引物组时，引物组中使用的各个引物的浓度为10pm，将使用的各个引物的稀释液置于-20℃保存后再用。

本发明提供的五重pcr检测方法，还具有这样的特征：预定pcr反应参数条件为95℃预变性5min；95℃下30s，57℃下30s，72℃下50s，进行35个循环；72℃，10min。

本发明提供的五重pcr检测方法，还具有这样的特征：步骤4的具体过程为，取10μlpcr扩增产物，点样于2.0％琼脂糖凝胶电泳板孔中，在80-100v电压下，电泳30-40min，于凝胶成像系统下拍照得到电泳结果，对电泳结果进行判定的前提条件为阴性对照无任何条带出现，当电泳结果出现761bp条带判定为禽大肠杆菌，当电泳结果出现83bp和249bp条带判定为鸡伤寒沙门菌，当电泳结果出现249bp条带判定为鸡白痢沙门菌，当电泳结果出现409bp条带判定为肠炎沙门菌，当电泳结果出现569bp条带判定为鼠伤寒沙门菌。

本发明还提供了一种根据上述的引物组在制备用于检测禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的五重pcr检测试剂盒中的应用。

发明作用与效果

本发明提供的用于检测禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的多重pcr引物组、包括该引物组的五重pcr检测试剂盒以及利用该引物组的五重pcr检测方法，由于其中的引物组的特异性强，灵敏性高，同时，该引物组具有良好的重复性，所以本发明提供的包括采用上述引物组的五重pcr检测方法或含有上述引物组的五重pcr检测试剂盒对禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的检测具有灵敏、特异、快速和稳定的优点，为快速检测与鉴定禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌提供了有效的手段，同时该引物组还可以在制备用于检测禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的五重pcr检测试剂盒中的应用。

附图说明

图1为实施例1的pcr扩增产物的电泳结果；

图2为评价例1中特异性评价的试验结果；

图3为评价例2中以细菌菌液为模板的敏感性评价的试验结果；

图4为评价例2以细菌基因组dna为模板的敏感性评价的试验结果。

具体实施方式

以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。

实施中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1五重pcr检测方法

本实施例采用用于多重pcr检测禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的引物组对禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌进行检测，具体包括以下步骤：

步骤1，基于待检测细菌制备得到pcr模板

将待检细菌菌株接种至lb液体培养基，在温度为37℃的条件下培养至od600＝1.0，即得到可以用做pcr模板的菌液。

步骤2，制备特异性引物组

制备用于多重pcr检测禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的引物组：以其中的各个引物组的浓度为10pm，对该浓度的引物的稀释液置于-20℃保存备用，避免反复冻融，

上述引物组包括以下引物对：

特异性扩增禽大肠杆菌phoa基因的引物对ecphoa-f和ecphoa-r；特异性扩增鸡伤寒沙门菌glgc基因的引物对sgglgc-f和sgglgc-r；特异性扩增鸡伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌spec基因的引物对sgpspec-f和sgpspec-r；特异性扩增肠炎沙门菌sdfⅰ基因的引物对sesdfⅰ-f和sesdfⅰ-r；特异性扩增鼠伤寒沙门菌stm4495基因的引物对ststm4495-f和ststm4495-r，

各个引物的核苷酸序列分别为：

ecphoa-f，5’-ggcaatacactcactatgcgctg-3’,

ecphoa-r，5’-aggattcgcagcatgatcctg-3’；

sgglgc-f，5’-cgtcgctataaagcggaatatgtc-3’，

sgglgc-r，5’-ccttttcaaaacatacgcgagtag-3’；

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sgpspec-r，5’-ttcctgacgggcatcgacggc-3’；

sesdfⅰ-f，5’-gatgtggttggttcgtcactg-3’，

sesdfⅰ-r，5’-gcgagacctcaaacttactcag-3’；

ststm4495-f，5’-cagcggtatgatgcggtagt-3’，

ststm4495-r，5’-tcaccggtggacatgcctgc-3’。

其中，引物对ecphoa-f和ecphoa-r用于扩增的目的片段的大小为761bp；引物对sgglgc-f和sgglgc-r用于扩增的目的片段的大小为83bp；引物对sgpspec-f和sgpspec-r用于扩增的目的片段的大小为249bp；引物对sesdfⅰ-f和sesdfⅰ-r用于扩增的目的片段的大小为409bp；引物对ststm4495-f和ststm4495-r用于扩增的目的片段大小为569bp。

步骤3，进行pcr扩增反应

基于步骤1中得到的pcr模板，采用步骤2中的特异性引物组建立得到包括的引物组的pcr反应体系：取pcr管，分别加2×pcrpremix12.5μl、引物ecphoa-f/ecphoa-r各0.5μl、引物sgglgc-f/sgglgc-r各0.2μl、引物sgpspec-f/sgpspec-r各0.3μl、引物sesdfⅰ-f/sesdfⅰ-r各0.4μl、引物ststm4495-f/ststm4495-r各0.5μl、模板1.0μl、超纯水7.7μl，混匀，得到25μl的pcr反应体系。

然后采用上述pcr反应体系在预定pcr反应参数条件下进行pcr扩增反应得到pcr扩增产物：预定pcr反应参数条件为95℃预变性5min；95℃30s，57℃30s，72℃50s，进行35个循环；72℃，10min。

步骤4，进行电泳检测，

对步骤3中得到的扩增产物进行电泳检测得到电泳结果，根据电泳结果判定是否出现禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌或鼠伤寒沙门菌：

取10μlpcr扩增产物，点样于2.0％琼脂糖凝胶电泳板孔中，在80-100v电压下，电泳30-40min，于凝胶成像系统下拍照得到电泳结果，对电泳结果进行判定的前提条件为阴性对照无任何条带出现：

当电泳结果出现761bp条带判定为禽大肠杆菌，

当电泳结果出现83bp和249bp条带判定为鸡伤寒沙门菌，

当电泳结果出现249bp条带判定为鸡白痢沙门菌，

当电泳结果出现409bp条带判定为肠炎沙门菌，

当电泳结果出现569bp条带判定为鼠伤寒沙门菌。

图1为实施例1的pcr扩增产物的电泳结果。

如图1所示，泳道1为禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌五重pcr产物；泳道2为鸡伤寒沙门菌(83bp和249bp)；泳道3为鸡白痢沙门菌(249bp)；泳道4为肠炎沙门菌(409bp)；泳道5为鼠伤寒沙门菌(569bp)；泳道6为禽大肠杆菌(761bp)；泳道7为阴性对照。

实施例2五重pcr检测试剂盒进行检测

本实施例，与实施例1的步骤一致，不同的是本实施例直接采用包括实施例1中提到的引物组的五重pcr检测试剂盒来建立上述pcr反应体系。

此时的五重pcr检测试剂盒的组成包括2×pcrpremix和引物组，其中2×pcrpremix的体积为12.5μl，引物组中引物对ecphoa-f和ecphoa-r的体积各为0.5μl，引物对sgglgc-f和sgglgc-r的体积各为0.2μl，引物对sgpspec-f和sgpspec-r的体积各为0.3μl，引物对sesdfⅰ-f和sesdfⅰ-r的体积各为0.4μl、引物对ststm4495-f和ststm4495-r的体积各为0.5μl。

评价例1特异性评价

本实施例以实施例2的五重pcr检测试剂盒为例对实施例1和实施例2中的引物组进行了特异性检测的：

选取鸭疫里默氏杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌pa14、猪链球菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、单增李斯特菌、禽巴氏杆菌、禽致病性大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、禽支原体、鼠伤寒沙门菌、禽波氏菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门菌(cvcc1805)、鸡毒支原体等细菌按照五重pcr检测试剂盒使用说明操作进行pcr，产物于2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

图2为评价例1中特异性评价的实验结果。

如图2所示，泳道m：dnamaker；泳道1：五重pcr；泳道2：血清1型鸭疫里默氏杆菌ch3；泳道3：金黄色葡萄球菌(cvcc543)；泳道4：铜绿假单胞菌pa14；泳道5：猪链球菌；泳道6：血清2型鸭疫里默氏杆菌yb2；泳道7：鼠伤寒沙门菌sat52；泳道8：血清10型鸭疫里默氏杆菌hxb2；泳道9：鸡伤寒沙门菌；泳道10：单增李斯特菌10403s；泳道11：禽巴氏杆菌(cvcc493)；泳道12：禽致病性大肠杆菌；泳道13、鸭疫里默氏杆菌(wg4)；泳道14：鸡白痢沙门菌(cvcc519)；泳道15：禽支原体(cvcc274)；泳道16：鼠伤寒沙门菌sl1344；泳道17：禽波氏菌(ipdh591-77)；泳道18：金黄色葡萄球菌(cvcc543)；泳道19：肠炎沙门菌(cvcc1805)；泳道20：鸡毒支原体(cvcc1651)；泳道21：阴性对照。

结果显示，以禽致病性大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌分别作为模板，可扩增到特异性条带；而对其他细菌等对照样品扩增，pcr结果均为阴性。说明实施例1和实施例2中的引物组的特异性较强，采用其建立的五重pcr检测方法或检测试剂盒可以准确、快速、稳定、特异性地将禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌与其它菌区别开来。

评价例2敏感性评价

本实施例以实施例2的五重pcr检测试剂盒为例对实施例1和实施例2中的引物组的敏感性进行了测评：

本实施例分别以倍比稀释的细菌培养物和细菌dna为模板进行pcr扩增。

(1)以细菌培养物为模板的敏感性试验

分别接种禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌至lb液体培养基中，37℃摇菌至od600＝1.0，各取1ml菌液12000r/min离心1min，去上清，灭菌超纯水洗3次，1ml灭菌超纯水重悬，分别制备菌液，浓度为10⁶cfu/μl、10⁵cfu/μl、10⁴cfu/μl、10³cfu/μl、10²cfu/μl、10cfu/μl。各吸取1μl加入pcr反应体系，按照五重pcr检测试剂盒操作说明进行pcr，根据试验结果测定上述引物组对禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的敏感性。

图3为评价例2中以细菌菌液为模板的灵敏股评价的实验结果。

如图3所示，结果分析如表1，表明采用上述引物组建立的pcr反应体系最低可以检测出1000cfu细菌。

表1以细菌菌液为模板的敏感性测评结果

(+：出现特异性条带；－:未出现特异性条带)

(2)以细菌基因组dna为模板的敏感性试验

分别接种禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌至lb液体培养基中，37℃摇菌至od600＝1.0，分别取其中1ml增菌液，按照试剂盒(天根生物技术有限公司)进行操作，提取细菌dna。分别稀释浓度为100ng/μl、50ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、500pg/μl、100pg/μl、10pg/μl。各吸取1μl加入pcr反应体系，按照五重pcr试剂盒操作说明进行pcr，根据试验结果测定上述引物组对禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的敏感性。

图4为评价例2以细菌基因组dna为模板的敏感性评价的实验结果。

如图4所示，结果分析如表2，表面本发明建立的禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的五重pcr检测试剂盒最低可以检测出100pg的禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌，而仅能检测出500pg的鸡白痢沙门菌。

表2以细菌基因组dna为模板的敏感性测评结果

(+：出现特异性条带；－:未出现特异性条带)

说明实施例1和实施例2中的引物组的敏感性较强，采用其建立的五重pcr检测方法或五重pcr检测试剂盒可以灵敏地将禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌与其它菌区别开来。

评价例3重复性评价

本实施例以实施例2的五重pcr检测试剂盒为例对制备的禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的五重pcr检测试剂盒的重复性进行了测评：

本实施例分别在不同时间、不同操作条件(包括pcr仪、操作人员)下对阳性模板进行检测，检测结果见表3。

表3重复性检测结果

(+：出现特异性条带；－:未出现特异性条带)

如表3所示，根据pcr检测结果，说明实施例1和实施例2中的引物组的重复性较强，采用其建立的五重pcr检测方法或五重pcr检测试剂盒可以重复性较好地将禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌与其它菌区别开来。

实施例1和实施例2的作用与效果

通过评价例1至评价例3可以看出，由于采用的引物组对实验室已保存的阳性菌株进行扩增，均可扩增到特异性条带，而其他细菌菌株等对照样品均未扩增到条带，说明该引物组的特异性强，而用采用该引物组检测不同稀释度的阳性样品，其最低检测敏感性可达到1000cfu细菌菌液及500pg细菌基因组dna，说明该该引物组的灵敏性高，同时，该引物组具有良好的重复性，说明其稳定性较强。所以实施例1和实施例2提供的包括采用上述引物组的五重pcr检测方法或含有上述引物组的五重pcr检测试剂盒对禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的检测具有灵敏、特异、快速和稳定的优点，为快速检测与鉴定禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌提供了有效的手段，同时该引物组还可以制备用于检测禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的五重pcr检测试剂盒。

另外，实施例1和实施例2中，步骤1中以培养的待检测细菌的菌液为制备得到的pcr模板，作为本发明，还可以继续对步骤1中的菌液进行提取得到细菌粗提dna为pcr模板，此时具体的过程为：将待检测细菌的菌株接种至lb液体培养基，在温度为37℃的条件下培养至od600＝1.0，得到菌液，然后将1ml该菌液在10000-12000r/min下离心1-2min，去上清，加0.1-0.5ml灭菌超纯水重悬，煮沸5-10min，然后在10000-12000r/min下离心3-5min，得到的上清即为细菌粗提dna。

本发明的范围不受具体实施方案的限制，实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。改进也落入所附权利要求书的范围之内。