提高DNB双末端测序质量的方法和DNB双末端测序方法和试剂盒与流程

本发明涉及测序技术领域，尤其涉及基于dna纳米球(dnb)的基因测序技术领域，特别涉及一种提高dnb双末端测序质量的方法和dnb双末端测序方法和试剂盒。

背景技术：

滚环扩增(rollingcircleamplification，rca)是借鉴自然界中环状病原微生物dna分子的滚环复制方式而建立的一种恒温核酸扩增技术，美国completegenomicsinc.(简称cg)利用rca技术开发了基于dna纳米球(dnananoball,dnb)的基因测序平台，并将其商业化。2012年华大基因收购cg，开始利用cg专利技术研发新一代双末端测序技术，基于rca原理的dnb技术再次取得重要突破，成为领域关注热点。

与其他二代测序技术相比较，dnb测序技术具有以下几个优势：dnb通过增加待测dna的拷贝数而增强了信号强度，从而提高测序准确度；不同于pcr指数扩增，滚环扩增技术的扩增错误不会累积；dnb与芯片上活化位点的大小相同，每个位点只固定一个dnb，保证信号点之间不产生相互干扰；这些优势也将意味着dnb测序技术在未来测序方向有重要意义。

dnb双末端测序目前主要是基于多重置换扩增法，如图1所示，主要流程包括：基因组dna首先经过片段化处理，再加上接头序列，并环化形成单链环状dna，随后使用滚环扩增技术可将单链环状dna扩增2-3个数量级，所产生的扩增产物称为dna纳米球，最终dna纳米球经过dnb装载技术固定在阵列化的硅芯片上，通过联合探针锚定聚合技术(cpas)进行第一链(forwardstrand)测序，在具备链置换功能的高保真聚合酶的作用下，形成第二链(reversestrand)，并通过dna分子锚，进行第二链的测序，具有合成快、准确度高等优点。

基于多重置换扩增法的dnb双末端测序，随着一链测序读长的增加，一链和模板链的结合能力大大增强，而且dnb本身结构等复杂因素，单纯利用高保真聚合酶很难把一链置换完成，无法直接用变性剂洗脱，对二链模板的合成有负面影响，从而影响了二链的测序读长和质量。

技术实现要素：

本发明提供一种提高dnb双末端测序质量的方法和dnb双末端测序方法和试剂盒，本发明的方法利用user酶能使尿嘧啶位置产生单核苷酸缺口的特性，在一链合成过程中引入部分dutp，通过user酶切割使得一链片段化，有效减少一链和模板链的结合能力，然后洗脱和消化一链以减小一链对二链测序质量的影响，有效提高dnb双末端测序数据质量和读长。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种提高dnb双末端测序质量的方法，包括：对dna纳米球进行一链合成测序时，使用部分dutp代替dttp进行联合探针锚定聚合测序；在上述一链合成测序完成后，使用user酶消化一链上的尿嘧啶，然后使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链。

进一步地，上述dutp占dutp和dttp总量的1％～99％，优选50％～75％。

进一步地，上述dutp占dutp和dttp总量的50％。

进一步地，上述变性剂是甲酰胺。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种dnb双末端测序方法，包括：对dna纳米球进行一链合成测序时，先杂交一链测序引物，然后在dntp混合物中引入部分dutp代替dttp进行联合探针锚定聚合测序，使得一链部分dttp位点被dutp取代；在上述一链合成测序完成后，使用user酶消化一链上的尿嘧啶，产生部分核苷酸缺口，使得一链片段化；然后使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链，并通过检测信号来确保一链完全去除；最后通过聚合和链置换的作用生成二链，从而进行双末端测序。

进一步地，上述dutp占dutp和dttp总量的1％～99％，优选50％～75％。

进一步地，上述dutp占dutp和dttp总量的50％。

进一步地，上述变性剂是甲酰胺。

根据本发明的第三方面，本发明提供一种dnb双末端测序所使用的试剂盒，包括：用于制备dna纳米球的试剂成分、一链测序引物、至少包括dutp在内的dntp、user酶、聚合酶、变性剂或外切酶中的至少一种，以及说明书，其中上述说明书包括dnb双末端测序方法；上述方法包括：对dna纳米球进行一链合成测序时，先杂交一链测序引物，然后在dntp混合物中引入部分dutp代替dttp进行联合探针锚定聚合测序，使得一链部分dttp位点被dutp取代；在上述一链合成测序完成后，使用user酶消化一链上的尿嘧啶，产生部分核苷酸缺口，使得一链片段化；然后使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链，并通过检测信号来确保一链完全去除；最后通过聚合和链置换的作用生成二链，从而进行双末端测序。

进一步地，上述dutp占dutp和dttp总量的1％～99％，优选50％～75％，更优选50％。

本发明的方法在进行一链合成测序时引入dutp，然后通过user酶的切割，使得一链片段化，并结合变性剂或外切酶达到完全去除一链的目的，降低一链对二链的负面影响，从而提高dnb双末端测序的读长和质量。

附图说明

图1为现有技术中dnb双末端测序的原理示意图；

图2为本发明实施例的dnb双末端测序的原理示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

如图1所示，现有技术中dnb双末端测序的主要流程包括：基因组dna首先经过片段化处理，再加上接头序列，并环化形成单链环状dna，随后使用滚环扩增技术可将单链环状dna扩增2-3个数量级，所产生的扩增产物称为dna纳米球，最终dna纳米球经过dnb装载技术固定在阵列化的硅芯片上，(a)通过联合探针锚定聚合(cpas)进行(b)第一链(forwardstrand)测序，(c)在具备链置换功能的高保真聚合酶的作用下，形成第二链(reversestrand)，(d)并通过dna分子锚，进行第二链的测序，具有合成快、准确度高等优点。

但是，现有技术中的基于多重置换扩增法的dnb双末端测序，随着一链测序读长的增加，一链和模板链的结合能力大大增强，而且dnb本身结构等复杂因素，单纯利用高保真聚合酶很难把一链置换完成，无法直接用变性剂洗脱，对二链模板的合成有负面影响，从而影响了二链的测序读长和质量。

针对现有技术中的问题，本发明提供一种新的dnb双末端测序方法，如图2所示，包括：对dna纳米球进行一链合成测序时，(a)先杂交一链测序引物，(b)然后在dntp混合物中引入部分dutp代替dttp进行联合探针锚定聚合测序，使得一链部分dttp位点被dutp取代；(c)在上述一链合成测序完成后，使用user酶消化一链上的尿嘧啶，产生部分核苷酸缺口，使得一链片段化；(d)然后使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链，并通过检测信号来确保一链完全去除；(e)最后通过聚合和链置换的作用生成二链，(f)从而进行双末端测序。

在本发明的方法中，dna纳米球可以按照cg公司的滚环扩增技术制备。本发明的dnb双末端测序方法相对于现有技术中dnb双末端测序方法，其不同点主要在于：对dna纳米球进行一链合成测序时，使用部分dutp(脱氧尿苷三磷酸)代替dttp(脱氧胸苷三磷酸)，之后使用user酶消化一链上的尿嘧啶。

本发明中使用的user酶，可以以采用例如neb公司的user^tm(尿嘧啶-特异性切除试剂)酶，其在尿嘧啶位置产生一个单核苷酸缺口。该user酶是尿嘧啶dna糖基化酶(udg)和dna糖基化酶-裂解酶endoⅷ的混合物。udg催化尿嘧啶碱基的切割，形成一个脱碱基(脱嘧啶)位点，但保持磷酸二酯骨架结构完整。endoⅷ的裂解酶活力使脱碱基位点3'和5'端的磷酸二酯键断裂，释放无碱基的脱氧核糖。

在本发明的方法中，dutp的用量可以在较大的范围内变化均有效，例如dutp占dutp和dttp总量的1％～99％，优选50％～75％，更优选50％。

使用user酶消化一链上的尿嘧啶之后，可以使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链，或者先后使用外切酶和变性剂处理，以完全去除一链，降低一链对二链的负面影响，从而提高dnb双末端测序的读长和质量。在本发明的实施例中，以甲酰胺作为变性剂。然而，本发明并不排除使用其它变性剂的情况。

相应地，本发明还提供一种dnb双末端测序所使用的试剂盒，包括：用于制备dna纳米球的试剂成分、一链测序引物、至少包括dutp在内的dntp、user酶、聚合酶、变性剂或外切酶中的至少一种，以及说明书，其中说明书包括dnb双末端测序方法；该方法包括：对dna纳米球进行一链合成测序时，先杂交一链测序引物，然后在dntp混合物中引入部分dutp代替dttp进行联合探针锚定聚合测序，使得一链部分dttp位点被dutp取代；在上述一链合成测序完成后，使用user酶消化一链上的尿嘧啶，产生部分核苷酸缺口，使得一链片段化；然后使用变性剂洗脱一链或使用外切酶消化一链，并通过检测信号来确保一链完全去除；最后通过聚合和链置换的作用生成二链，从而进行双末端测序。

需要说明的是，本发明的试剂盒优选包括用于制备dna纳米球的试剂成分、一链测序引物、至少包括dutp在内的dntp、user酶、聚合酶、变性剂和外切酶所有组分，构成一个完整的试剂盒。然而，本发明也不排除那种仅包括上述成分中的一种或多种的情况。上述成分中，用于制备dna纳米球的试剂成分可以采用cg公司的试剂成分；至少包括dutp在内的dntp是指单独的dutp成分，或者含有dutp以及其它脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)的混合物。

下面通过具体案例的方式进一步说明本发明。下面的案例仅仅是为了说明的目的，而并非限制本发明的范围。

实施例

以bgiseq500平台为例，展示本发明的方法和得到的测试效果。本实施例的dnb双末端测序的方法，包括如下步骤：

(1)参照bgiseq500文库制备的操作说明书，构建单链环状dna文库。

(2)参照bgiseq500测序仪的操作说明书，将dna纳米球(dnb)装载到阵列化的硅芯片上。

(3)对dnb进行一链合成测序，主要包括以下步骤：先杂交一链测序引物，引物序列为5’-gctcacatcaggccattaggctacgagactt-3’(seqidno：1)；然后在dntp混合物中引入部分dutp代替dttp进行联合探针锚定聚合测序，使得一链部分dttp位点被dutp取代，本实施例中采用的dutp占dutp和dttp总量分别为0％、25％、50％、75％；在上述一链合成测序完成后，使用user酶消化一链上的尿嘧啶，产生部分核苷酸缺口，使得一链片段化；然后使用变性剂(甲酰胺)洗脱一链或使用外切酶消化一链，并通过检测信号来确保一链完全去除，具体检测信号的方法参考bgiseq500测序仪说明书，得到的信号值；最后通过聚合和链置换的作用生成二链，再加入互补链的测序引物，引物序列为5’-cctaagaccaagctaggtccgactt-3’(seqidno：2)从而进行双末端测序，并比较不同测试条件的二链信号值。

测试中发现，当增加dutp占dutp和dttp总量时，随着dutp的占比增加，一链完成后残留的信号降低，即一链去除地越干净，结果如表1所示，在dutp占dutp和dttp总量为50％和75％时，几乎完全去除，得到的信号值与背景值相近。而二链的合成信号随着dutp的占比增加而有明显上升的趋势，结果如表2所示，在dutp占dutp和dttp总量为50％时表现为最佳。

表1bgiseq500测序仪检测到的一链完成去除后的信号值

表2bgiseq500测序仪检测到的二链信号值

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

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