本发明属于植物分子育种学领域，具体涉及一种野生亚麻种子总dna提取方法。
背景技术：
目前植物总dna提取方法有ctab法，sds法，高盐低ph值法等。亚麻总dna提取常用方法为高盐低ph法，该方法常以茎叶为提取原材料。由于野生亚麻种子发芽率低，人工条件育苗获得幼茎需要5个月时间，如果提取原料为多年生野生种，那么获得所需的提取材料会更加困难，提取工作也受时间的限制。因此利用种子提取dna的方法便可以打破这种限制。由于野生亚麻种皮上的果胶质远大于茎叶，故而提取难度较茎叶大。故本专利在前人研究基础之上，着重解决利用野生亚麻种子提取总dna，既达到高浓度、高纯度、大量提取的目的，又能克服提取时间的限制，满足分子生物学实验的需要。
技术实现要素：
本发明目的是提供了一种野生亚麻种子总dna提取方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种野生亚麻种子总dna提取方法，包括如下步骤：
步骤1、用液氮将研钵和杵预冷，取0.25g野生亚麻种子置于研钵中，迅速研磨至粉末状，之后向研钵中加入65℃的提取缓冲液10ml，在水浴锅中继续研磨至充分混匀，得到野生亚麻种子匀浆；
步骤2、将步骤1制得的野生亚麻种子匀浆用尼龙网兜过滤；
步骤3、将步骤2过滤后的滤液用1.5ml离心管分装，每个离心管内滤液容积为0.6ml，65℃水浴10min，水浴的同时轻轻摇动离心管，水浴后将离心管冷却至室温后，以转速10000r/min，离心10分钟，离心后取上清液待用；
步骤4、将步骤3得到的上清液加入0.33体积的5mol/l的醋酸钾溶液，混匀后置于0℃冰浴保持30min，以转速10000r/min，离心10分钟，离心后取上清液待用；
步骤5、将步骤4得到的上清液加入0.6倍体积的预冷异丙醇，混匀后的溶液在-20℃条件下静置2h得到的混合物，利用微提取器吸取悬浮物，使之与管底部果胶质分离，留悬浮物待用；
步骤6、将步骤5得到的沉淀物用无水乙醇洗涤2次后，自然晾干后，加50μl超纯水混匀后在-20℃条件下静置8～10h，得到的溶液中加人300μl超纯水稀释，稀释后加5μlrna酶，混匀后置于水浴锅中37℃水浴1h，得到溶液待用；
步骤7、将步骤6得到的溶液加入0.6倍体积的预冷异丙醇，混匀后在-20℃条件下静置2h，得到的混合物，利用微提取器吸取悬浮物，使之与管底部果胶质分离，留悬浮物待用；
步骤8、将步骤7得到的沉淀物用无水乙醇洗涤2次后，自然晾干后，加25～50μl超纯水混匀后，得到野生亚麻种子总dna，置于-80℃保存；
步骤9、将步骤8得到的野生亚麻种子总dna利用琼脂糖检测条带完整性及纯度，分光光度计检测浓度。
本发明所述的野生亚麻种子总dna提取方法，步骤1中所述的提取缓冲液的配方为每1000ml缓冲液中含有100mmol醋酸钠、50mmol乙二胺四乙酸二钠、500mmol氯化钠、2％聚乙烯吡咯烷酮、1.4％十二烷基磺酸钠。
本发明所述的野生亚麻种子总dna提取方法，步骤2中的尼龙网兜过滤用纱布过滤代替。尼龙网兜过滤可用纱布代替，但会影响产量，如果不要求大量提取，可以用纱布替代。
本发明所述的野生亚麻种子总dna提取方法，步骤3中的水浴锅中放置浮漂。
本发明所述的野生亚麻种子总dna提取方法，步骤4中醋酸钾溶液的ph值为4.8。
本发明所述的野生亚麻种子总dna提取方法，步骤5中混匀后的溶液在室温下静置8～10h后得到混合物。
本发明所述的野生亚麻种子总dna提取方法，步骤5中的混合物在室温下以转速10000r/min，离心10分钟，得到沉淀物待用。步骤5中的混合物中没有沉淀出现，则采用离心分离的方法得到沉淀物，用来代替微提取器吸取沉淀。
本发明所述的野生亚麻种子总dna提取方法，步骤7中的混合物在室温下以转速10000r/min，离心10分钟，得到沉淀物待用。步骤7中的混合物中没有沉淀出现，则采用离心分离的方法得到沉淀物，用来代替微提取器吸取沉淀。
本发明所述的野生亚麻种子总dna提取方法，经液氮研磨之后，再用缓冲液研磨，使dna充分溶于缓冲液中而不被破坏，有益效果是加大了dna的产率。而经过过滤的dna提取缓冲液在提取初期就先去掉一部分果胶质，直接降低了dna的粘稠度。本发明步骤简单，实验试剂无毒，提取量大，解决了无法获得或者获取茎叶材料困难的难题，打破dna提取在时间上限制，只要有种子且需要dna时，随时可以提取。
附图说明
附图1为具体实施方式一野生亚麻种子总dna提取的电泳检测对比图。
具体实施方式
具体实施方式一：
一种野生亚麻种子总dna提取方法，包括如下步骤：
步骤1、用液氮将研钵和杵预冷，取0.25g野生亚麻种子置于研钵中，迅速研磨至粉末状，之后向研钵中加入65℃的提取缓冲液10ml，在水浴锅中继续研磨至充分混匀，得到野生亚麻种子匀浆；
步骤2、将步骤1制得的野生亚麻种子匀浆用尼龙网兜过滤；
步骤3、将步骤2过滤后的滤液用1.5ml离心管分装，每个离心管内滤液容积为0.6ml，65℃水浴10min，水浴的同时轻轻摇动离心管，水浴后将离心管冷却至室温后，以转速10000r/min，离心10分钟，离心后取上清液待用；
步骤4、将步骤3得到的上清液加入0.33体积的5mol/l的醋酸钾溶液，混匀后置于0℃冰浴保持30min，以转速10000r/min，离心10分钟，离心后取上清液待用；
步骤5、将步骤4得到的上清液加入0.6倍体积的预冷异丙醇，混匀后的溶液在-20℃条件下静置2h得到的混合物，利用微提取器吸取悬浮物，使之与管底部果胶质分离，留悬浮物待用；
步骤6、将步骤5得到的沉淀物用无水乙醇洗涤2次后，自然晾干后，加50μl超纯水混匀后在-20℃条件下静置8h，得到的溶液中加人300μl超纯水稀释，稀释后加5μlrna酶，混匀后置于水浴锅中37℃水浴1h，得到溶液待用；
步骤7、将步骤6得到的溶液加入0.6倍体积的预冷异丙醇，混匀后在-20℃条件下静置2h，得到的混合物，利用微提取器吸取悬浮物，使之与管底部果胶质分离，留悬浮物待用；
步骤8、将步骤7得到的沉淀物用无水乙醇洗涤2次后，自然晾干后，加25μl超纯水混匀后，得到野生亚麻种子总dna，置于-80℃保存；
步骤9、将步骤8得到的野生亚麻种子总dna利用琼脂糖检测条带完整性及纯度，分光光度计检测浓度。
本实施方式所述的野生亚麻种子总dna提取方法，步骤1中所述的提取缓冲液的配方为每1000ml缓冲液中含有100mmol醋酸钠、50mmol乙二胺四乙酸二钠、500mmol氯化钠、2％聚乙烯吡咯烷酮、1.4％十二烷基磺酸钠。
本实施方式所述的野生亚麻种子总dna提取方法，步骤3中的水浴锅中放置浮漂。
本实施方式所述的野生亚麻种子总dna提取方法，步骤4中醋酸钾溶液的ph值为4.8。
本实施方式所述的野生亚麻种子总dna提取方法，附图1为本实施方式野生亚麻种子总dna提取的电泳检测对比图，其中第1泳道为15000bp的dnamarker，第2、3、4泳道为本方法茎叶提取，第5、6、7、8为本方法种子提取，第9、10、11、泳道为3％ctab法。图1电泳图是dna提取液经过稀释5倍之后上样获得的。从电泳图上可以看出种子总dna的提取量最大，条带清晰无杂质，提取dna长度位于maker之上，提取的dna较完整，rna添加量适合，无污染，达到分子生物学要求，茎叶的提取量较低，条带比较模糊，未达到分子生物学要求。3％ctab法没有检测出条带。
具体实施方式二：
一种野生亚麻种子总dna提取方法，包括如下步骤：
步骤1、用液氮将研钵和杵预冷，取0.25g野生亚麻种子置于研钵中，迅速研磨至粉末状，之后向研钵中加入65℃的提取缓冲液10ml，在水浴锅中继续研磨至充分混匀，得到野生亚麻种子匀浆；
步骤2、将步骤1制得的野生亚麻种子匀浆用纱布过滤；
步骤3、将步骤2过滤后的滤液用1.5ml离心管分装，每个离心管内滤液容积为0.6ml，65℃水浴10min，水浴的同时轻轻摇动离心管，水浴后将离心管冷却至室温后，以转速10000r/min，离心10分钟，离心后取上清液待用；
步骤4、将步骤3得到的上清液加入0.33体积的5mol/l的醋酸钾溶液，混匀后置于0℃冰浴保持30min，以转速10000r/min，离心10分钟，离心后取上清液待用；
步骤5、将步骤4得到的上清液加入0.6倍体积的预冷异丙醇，混匀后的溶液在室温下静置2h后得到的混合物，在室温下以转速10000r/min，离心10分钟，得到的沉淀物待用；
步骤6、将步骤5得到的沉淀物用无水乙醇洗涤2次后，自然晾干后，加50μl超纯水混匀后在-20℃条件下静置8h，得到的溶液中加人300μl超纯水稀释，稀释后加5μlrna酶，混匀后置于水浴锅中37℃水浴1h，得到溶液待用；
步骤7、将步骤6得到的溶液加入0.6倍体积的预冷异丙醇，混匀后在-20℃条件下静置2h，得到的混合物，在室温下以转速10000r/min，离心10分钟，得到的沉淀物待用；
步骤8、将步骤7得到的沉淀物用无水乙醇洗涤2次后，自然晾干后，加50μl超纯水混匀后，得到野生亚麻种子总dna，置于-80℃保存；
步骤9、将步骤8得到的野生亚麻种子总dna利用琼脂糖检测条带完整性及纯度，分光光度计检测浓度。
本实施方式所述的野生亚麻种子总dna提取方法，步骤1中所述的提取缓冲液的配方为每1000ml缓冲液中含有100mmol醋酸钠、50mmol乙二胺四乙酸二钠、500mmol氯化钠、2％聚乙烯吡咯烷酮、1.4％十二烷基磺酸钠。
本实施方式所述的野生亚麻种子总dna提取方法，步骤3中的水浴锅中放置浮漂。
本实施方式所述的野生亚麻种子总dna提取方法，步骤4中醋酸钾溶液的ph值为4.8。
本实施方式所述的野生亚麻种子总dna提取方法，表1列举了不同方法提取dna的分光光度计检测结果。
表1不同方式提取dna分光光度计检测结果对比表
从表1中明确看出，利用种子提取的dna浓度达到217ng/ul，浓度远远大于其他方法，该方法od260/od280为1.808，接近理论值1.80，表明提取的dna没有蛋白质污染，满足分子生物学的实验需要。