本发明涉及一种利用离体动物角膜模型多参数检测眼刺激性的方法。
背景技术：
：人类的眼睛可能会接触到化妆品、药品、农药和环境污染物等一种或多种物质，对这些外源物质的主观接触或意外暴露可能造成人群的健康风险。因此，评估可能接触物质的潜在眼刺激性对保障人群健康具有重要意义。19世纪30年代，由于允许未经检测含有对苯二胺的睫毛产品在美国市场售卖，导致消费者使用此类产品引起眼部过敏、角膜溃疡和失明等不良反应。这一公共危害事件促使美国食品药品和化妆品监督管理局(fda)在1938年采取行动，强制要求检测眼部接触产品的安全性。对于眼刺激性的毒理学评价，金标准采用的是1944年draize提出的兔眼刺激体内实验。一直以来，虽然兔眼实验被认为是评估眼刺激或腐蚀性的唯一标准方法，但其科学性和合理性备受质疑。传统动物实验的缺点包括：方法的主观性、动物与人体反应的差异、周期长、通量低、使用活体动物造成动物痛苦死亡等。随着国际动物福利运动的兴起和新技术的发展，50多年前国外最先提出了以"减少(reduction)"、"替代(replacement)"和"优化(refinement)"为核心内容的“3r原则”，并在此基础上大力开展动物实验替代方法的研究。特别是近20年，以体外替代技术为核心的试验方法，逐渐被许多国家和地区的监管部门所接收和认可。如欧盟化妆品指令《2003/15/ec》和法规《1223/2009/ec》对于化妆品动物实验的禁止，欧盟新化学品法规reach(化学品的注册、评估、许可和限制)鼓励动物试验替代方法的开发和应用。美国替代方法研究评价中心(iccvam)提出的一系列非动物测试方法等。全球范围内多个地区和国家通过法规禁止/部分禁止或限制动物试验的进行。尤其是在化妆品领域，2013年欧盟范围内全面禁止销售从原料到成品经过动物试验的化妆品。用非活体动物的试验系统进行眼刺激性评价是动物试验替代技术的关键领域之一。体外替代试验是根据体内眼损伤发生的机理开发的，目前开发中的眼刺激替代方法，其实验系统可分为细胞系统、器官型系统、人工角膜等，其中，器官型系统主要有鸡胚绒毛膜尿囊膜和离体角膜。离体角膜来源于废弃的动物眼球组织，不需要额外动物来源，天然角膜与人体角膜接近，离体角膜在短期内可以维持正常生理活性，可以模拟人角膜暴露。牛角膜浑浊度渗透性试验(tg437)经过oecd认可，作为替代传统动物试验评价急性眼刺激性的方法之一，用于分类和标示，其数据广泛被接受。然而实际中可能接触到多种外源化学物，且重复接触，例如药物、大气污染物等，国际上尚未认可多次眼刺激性体外方法。目前基于离体角膜的多参数重复暴露眼刺激性体外预测/评价方法未见相关专利和文献报道。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题，就是提供一种利用离体动物角膜模型多参数检测眼刺激性的方法，该方法具有快速、通量高、不使用活体动物等优点，可以对一种/多种物质多重/多次暴露眼刺激性进行快速评价/预测，且能广泛应用。解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案来实现的。一种利用离体动物角膜模型多参数检测眼刺激性的方法，其特征是含以下步骤：s1，离体动物眼球的获取s1-1，离体动物眼球来源于动物屠宰场，眼球的摘取应在动物死亡4h内进行；s1-2，采用剪刀或类似器械从眼眶进入，切断与眼球连接的组织，完整取处眼球，摘取眼球的过程中不能接触或损伤眼球组织及眼球表面的角膜；s1-3，将摘取下的眼球完全浸泡于含100iu/ml青霉素和100iu/ml链霉素、且4℃预冷的无菌hbss缓冲液，于7h内进行检测；s2，离体角膜的制备s2-1，离体角膜指健康动物离体眼球分离的角膜，无肉眼可见的损伤或病变；s2-2，分离角膜前肉眼检查角膜完整性，丢弃有划痕、色素沉着、白班、混浊、机械损伤或异常者；s2-3，源于牛眼球的角膜直接分离，猪眼球应浸入含1％的聚维酮碘溶液2min，用无菌pbs冲洗，浸入含有0.1％庆大霉素的pbs15min消毒后进行角膜分离操作；s2-4，角膜分离应在洁净的环境下进行，紫外灯照射房间至少30min；s2-5，角膜外周保留2-3mm巩膜，以手术刀做切口，环切下角膜，夹住巩膜，用镊子剥除角膜内皮的玻璃体和虹膜附属组织，操作中不得直接接触角膜上皮或内皮组织；s2-6，将角膜内皮朝上置于无菌32±1℃预热hbss缓冲液中清洗1-2次，去除附属残留组织；s2-7，将角膜上皮朝上，放置于角膜固定器的后室部分；稳定放上前室部分，以螺丝固定前后室，期间避免移动前室，以免造成角膜损伤；s2-8，角膜固定器的后室和前室分别依次填充无菌不含酚红的mem培养基，水平置于培养箱(32±1℃，rh70±10％)中孵育1～2h，以恢复角膜正常生理活性；s3，受试物和对照组暴露s3-1，角膜孵育后，更换前后室培养基，依前后室顺序将液体抽出，依次向后室和前室重新加入新鲜培养基，用角膜浊度仪测量并记录每个角膜初始浊度值，根据浊度值进行角膜分组；s3-2，每个角膜加入1±0.5ml(g)受试物，并确保受试物完全覆盖角膜；液体受试物直接从前室上方小孔加入，粘稠或固体受试物打开前室玻璃片，将受试物加入角膜表面；s3-3，多参数暴露条件：根据受试物的不同，选择不同的暴露参数，所有阳性对照、阴性对照和溶剂对照均采用与受试物相同的暴露条件；s3-4，竖直放置角膜固定器，使受试物与角膜充分接触，返回培养箱暴露；暴露结束后进行冲洗，以完全去除受试物，冲洗之后返回培养箱进行后孵育，后孵育结束后更换前后室培养基，再次测量并记录每个相应的角膜浊度值；s4，收集后室培养基，保存用于酶活性和/或炎性因子测定；s5，去除前室培养基，加入1ml荧光素钠溶液，继续孵育90分钟；收集后室所有液体，混匀后取液体360μl在490nm波长下读取吸光度值；s6，评价指标的测量a.肉眼观察，受试物暴露后，观察角膜颜色、状态或有无上皮脱落，记录并作为附加评价的参考；b.浑浊度(op值)，角膜在受试物暴露前和暴露后浊度的变化，反应受试物对角膜的刺激性；c.渗透性(do490)，受试物暴露后，通过荧光素钠定量，评估角膜上皮完整性；d.炎性物质的释放，ldh活性、il-6或il-8等细胞因子定量检测一个或多个炎性物质含量，并与做统计学分析，用于样品精细分析；e.组织学检测，完成试验后的角膜固定在固定液中，进行组织学评估，作为附加评价参考。s7，预测模型1)角膜体外评分＝校正op值+15×校正od4902)细分类模型：组织学评分，炎性物质释放刺激性体外评分刺激性预测≤3无刺激性＞3，≤15微弱刺激性＞15，≤55轻刺激性＞55严重刺激性/腐蚀性所述上述步骤中，涉及的所有操作器械经过无菌处理，所述的培养、暴露和孵育均处于无菌培养箱中，温度为32±1℃，湿度70±10％。所述步骤s1中所述的动物离体眼球组织为牛眼球、猪眼球、羊眼球或兔眼球，不考虑动物的性别，动物的年龄范围在12个月至60个月内；年龄和品种尽可能接近或一致，如能获取此类信息对于有助于评估角膜均一性和差异性。所述步骤s1中所述的hbss缓冲液，粉剂购自sigma公司，每升添加0.35g分析纯的碳酸氢钠，使用18mω*cm的超纯水配制，充分混匀后调节ph7.2-ph7.3，0.22μm滤膜过滤除菌，加入青霉素100iu/ml和链霉素100iu/ml，4℃保存4周。所述步骤s2中所述的角膜固定器为角膜浊度仪配件，与角膜浊度仪一同使用(适用于牛角膜固定)，如是猪角膜、羊角膜或其他动物角膜，需配合使用与其相适应的角膜固定器；其他特制的角膜固定器需要符合传统角膜固定器中暴露面积和后室容积比例，浊度仪通用；角膜固定器分为前室和后室两部分，中间以角膜分隔。所述步骤s2中所述的mem培养基为细胞培养用mem培养基，购自sigma公司，同时需要含酚红和不含酚红两种，每升添加2.2g的分析纯碳酸氢钠和0.292gl-谷氨酰胺(购自sigma公司)，使用超纯水配制，充分混匀后调节ph7.2-ph7.3，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃可保存4周，使用前加入1％胎牛血清(购自gibco公司)，32±1℃预热；含酚红mem培养基只在冲洗步骤使用，其余均采用不含酚红mem培养基。所述步骤s2和s6中所述的角膜浊度仪为专门用于检测角膜混浊度的仪器，如德国basf生产的opacitometer3.0和法国riom生产的op-kit，通过光通量的改变反应角膜浊度的变化。操作方法为：打开仪器，让光源稳定5分钟，根据仪器说明书进行调整和校正，放入角膜固定器，直接读取角膜浊度值(op值)，其中opacitometer3.0读取的是照度值(i)，需要根据仪器说明将数据转化为op值。获取角膜基础浊度后，根据仪器说明弃去不合要求的角膜。每次测量角膜浊度值前均需要用新鲜培养更换前后室中旧培养基，操作时避免产生气泡，以免影响试验。所述步骤s3中所述角膜分组，根据角膜基础浊度值，选取浊度值最低的至少3个角膜作为阴性对照，其余的角膜按浊度顺序排序进行分组，每个样品或对照需要至少3个平行。所述步骤s3中所述的受试物或对照组，每个角膜加入1±0.5ml(g)受试物或对照组。一般情况下，受试物均采样原样/原液进行测试，也可采用应用浓度或浓缩液进行，具体可以根据实际需要选择合适的浓度(＞0，≤100％)。阴性对照采用超纯水、生理盐水(0.9％氯化钠溶液)或mem培养基，阳性对照采用1-5％十二烷基硫酸钠(或称月桂醇硫酸钠，sls，cas：151-21-3)，溶于超纯水或无水乙醇(cas：64-17-5，分析纯)。使用前均需要32±1℃预热。所述步骤s3中所述暴露时间和后孵育时间的选择：a.一般情况下，受试物均采样原样/原液进行测试，也可采用应用液或浓缩液进行，具体根据实际需要选择合适的受试物浓度(＞0，≤100％)。b.液体受试物暴露时间5-30min，后孵育时间90-240min，时间的选择需根据实际情况进行；固体受试物暴露时间90-240min，后孵育时间0-240min，时间的选择需根据实际情况进行；所有阳性对照、阴性对照和溶剂对照均采用于受试物相同的暴露条件；c.长期或反复使用或接触眼睛的受试物，选择暴露时间为30min，后孵育时间120分钟；d.按顺序成套使用的一组受试物，选择暴露时间为第一种物质作用10min，去除受试物后再孵育30min，再更换第二种物质作用10min，去除受试物后再孵育30min，再更换第三种受试物质作用10min，依次类推，直至完成所有一组物的暴露；所述步骤s3中的暴露后冲洗，其具体步骤如下：对于液体受试物，通过上方加样孔注入约5ml含酚红mem，竖直方向上晃动固定器，去除含受试物培养基，观察记录颜色变化，重复此步骤至少3次，直至肉眼可见受试物无残留，再用不含酚红mem冲洗至少1次，直至去除含酚红培养基。对于固体受试物，需再次打开加样玻璃窗，加入约5ml含酚红mem进行清洗，清洗步骤如同液体受试物清洗步骤，最后需要将玻璃窗安装回固定器中。所述步骤s4中的酶活性/细胞因子包括：乳酸脱氢酶(ldh)、il-1α、tgf-α、fgf等所述步骤s5中的荧光素钠溶液，分为4％(适用于液体受试物)和5％(适用于固体受试物)两种。荧光素钠(cas：518-47-8)，购自sigma公司，使用无菌不含ca2+、mg2+的dpbs(购自gibco公司)配制，充分混匀，4℃避光可保存8周，使用前32±1℃预热。所述步骤s4中的肉眼观察包括直接观察和采用裂隙灯辅助，作为附加评价指标；直接观察时需要记录暴露前后所观察到特征，采用图像记录或文字描述；采用裂隙灯检查时，将其调为亮度为中等的裂隙光，调整角度和宽度，角膜上皮检查时光源角度45°，角膜基质和内皮检查时，裂隙宽度2mm，对角膜进行检查，记录所检查到的结果。所述步骤s4中的渗透性评价指标，去除角膜固定器前室液体，加入1ml荧光素钠溶液，荧光素钠透过角膜上皮渗透进入角膜固定器后室，反映角膜上皮完整性，混匀并取360μl后室液体，使用酶标仪或96孔读板机，在490nm波长下读取吸光度值(od490)。所述步骤s4中的酶活性和细胞因子检测，收集后室液体，采用elisa法或其他检测方法定量检测相应指标，操作根据相应说明书进行，反应角膜在受试物作用下产生炎性反应的程度。所述步骤s4中的组织学评价指标，是指将角膜固定在4％多聚甲醛或中性福尔马林溶液中，4℃固定至少24小时；按常规梯度乙醇脱水、二甲苯中透明、石蜡包埋，切片厚度为4～7μm，h-e染色，中性树胶封片；显微镜观察：分别对角膜上皮、基质和内皮进行组织学评价，并作图像记录和文字描述，评价指标可以角膜全层厚度、上皮厚度和完整性、基质厚度和水肿情况，以及内皮厚度，作为附加评价指标。所述步骤s5中的角膜体外评分＝校正op值+15×校正od490；校正op值＝op变化值-阴性对照op值；op变化值＝暴露后op值-基础op值；校正od490＝角膜od490-阴性对照od490。所述步骤s5中的角膜炎性物质的释放，定量检测后，采用合适的统计学方法进行分析。本方法同时适用于多种物理状态的受试物，挥发性物质有可能削弱其刺激性预测，暂不适用于气体和气溶胶物质；膏霜类、蜡状或半固体等均视为液体处理。本发明具有如下有益效果：(1)本发明使用离体动物角膜组织，其结构接近人体角膜，结果可信，重复性好，预测能力良好；(2)本发明角膜来源与废弃动物眼球组织，无需使用活体动物，符合3rs原则；(3)本发明采用多参数指标，为多重/多次暴露眼刺激性预测提供更多证据；(4)本发明建立的方法可以代替活体动物试验，直接用于化学品、日化品、药品等成品、配方或原料多重/多次暴露下眼刺激预测/评价，适用于配方的比较，原料筛选和产品评估等；(5)本发明定量检测酶活性和/或细胞因子，具有灵敏度高，通量高等特点，适用于不同受试物的精细比较；(6)本发明利用附加组织学评价，可用于分析受试物刺激性程度和机制等方面的研究。附图说明图1是角膜固定器示意图。具体实施方式本发明的利用离体动物角膜模型多参数检测眼刺激性的方法，含以下步骤：s1，离体动物眼球的获取s1-1，离体动物眼球来源于动物屠宰场，眼球的摘取应在动物死亡4h内进行；s1-2，采用剪刀或类似器械从眼眶进入，切断与眼球连接的组织，完整取处眼球，摘取眼球的过程中不能接触或损伤眼球组织及眼球表面的角膜；s1-3，将摘取下的眼球完全浸泡于含100iu/ml青霉素和100iu/ml链霉素、且4℃预冷的无菌hbss缓冲液，于7h内进行检测；s2，离体角膜的制备s2-1，离体角膜指健康动物离体眼球分离的角膜，无肉眼可见的损伤或病变；s2-2，分离角膜前肉眼检查角膜完整性，丢弃有划痕、色素沉着、白班、混浊、机械损伤或异常者；s2-3，源于牛眼球的角膜直接分离，猪眼球应浸入含1％的聚维酮碘溶液2min，用无菌pbs冲洗，浸入含有0.1％庆大霉素的pbs15min消毒后进行角膜分离操作；s2-4，角膜分离应在洁净的环境下进行，紫外灯照射房间至少30min；s2-5，角膜外周保留2-3mm巩膜，以手术刀做切口，环切下角膜，夹住巩膜，用镊子剥除角膜内皮的玻璃体和虹膜附属组织，操作中不得直接接触角膜上皮或内皮组织；s2-6，将角膜内皮朝上置于无菌32±1℃预热hbss缓冲液中清洗1-2次，去除附属残留组织；s2-7，将角膜上皮朝上，放置于角膜固定器的后室部分；稳定放上前室部分，以螺丝固定前后室，期间避免移动前室，以免造成角膜损伤；s2-8，角膜固定器的后室和前室分别依次填充无菌不含酚红的mem培养基，水平置于培养箱(32±1℃，rh70±10％)中孵育1～2h，以恢复角膜正常生理活性；s3，受试物和对照组暴露s3-1，角膜孵育后，更换前后室培养基，依前后室顺序将液体抽出，依次向后室和前室重新加入新鲜培养基，用角膜浊度仪测量并记录每个角膜初始浊度值，根据浊度值进行角膜分组；s3-2，每个角膜加入1±0.5ml(g)受试物，并确保受试物完全覆盖角膜；液体受试物直接从前室上方小孔加入，粘稠或固体受试物打开前室玻璃片，将受试物加入角膜表面；s3-3，多参数暴露条件：根据受试物的不同，选择不同的暴露参数，所有阳性对照、阴性对照和溶剂对照均采用与受试物相同的暴露条件；s3-4，竖直放置角膜固定器，使受试物与角膜充分接触，返回培养箱暴露；暴露结束后进行冲洗，以完全去除受试物，冲洗之后返回培养箱进行后孵育，后孵育结束后更换前后室培养基，再次测量并记录每个相应的角膜浊度值；s4，收集后室培养基，保存用于酶活性和/或炎性因子测定；s5，去除前室培养基，加入1ml荧光素钠溶液，继续孵育90分钟；收集后室所有液体，混匀后取液体360μl在490nm波长下读取吸光度值；s6，评价指标的测量a.肉眼观察，受试物暴露后，观察角膜颜色、状态或有无上皮脱落，记录并作为附加评价的参考；b.浑浊度(op值)，角膜在受试物暴露前和暴露后浊度的变化，反应受试物对角膜的刺激性；c.渗透性(do490)，受试物暴露后，通过荧光素钠定量，评估角膜上皮完整性；d.炎性物质的释放，ldh活性、il-6或il-8等细胞因子定量检测一个或多个炎性物质含量，并与做统计学分析，用于样品精细分析；e.组织学检测，完成试验后的角膜固定在固定液中，进行组织学评估，作为附加评价参考。s7，预测模型1)角膜体外评分＝校正op值+15×校正od4902)细分类模型：组织学评分，炎性物质释放刺激性体外评分刺激性预测≤3无刺激性＞3，≤15微弱刺激性＞15，≤55轻刺激性＞55严重刺激性/腐蚀性所述上述步骤中，涉及的所有操作器械经过无菌处理，所述的培养、暴露和孵育均处于无菌培养箱中，温度为32±1℃，湿度70±10％。所述步骤s1中所述的动物离体眼球组织为牛眼球、猪眼球、羊眼球或兔眼球，不考虑动物的性别，动物的年龄范围在12个月至60个月内；年龄和品种尽可能接近或一致，如能获取此类信息对于有助于评估角膜均一性和差异性。所述步骤s1中所述的hbss缓冲液，粉剂购自sigma公司，每升添加0.35g分析纯的碳酸氢钠，使用18mω*cm的超纯水配制，充分混匀后调节ph7.2-ph7.3，0.22μm滤膜过滤除菌，加入青霉素100iu/ml和链霉素100iu/ml，4℃保存4周。所述步骤s2中所述的角膜固定器为角膜浊度仪配件，与角膜浊度仪一同使用(适用于牛角膜固定)，如是猪角膜、羊角膜或其他动物角膜，需配合使用与其相适应的角膜固定器；其他特制的角膜固定器需要符合传统角膜固定器中暴露面积和后室容积比例，浊度仪通用；角膜固定器分为前室和后室两部分，中间以角膜分隔。所述步骤s2中所述的mem培养基为细胞培养用mem培养基，购自sigma公司，同时需要含酚红和不含酚红两种，每升添加2.2g的分析纯碳酸氢钠和0.292gl-谷氨酰胺(购自sigma公司)，使用超纯水配制，充分混匀后调节ph7.2-ph7.3，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃可保存4周，使用前加入1％胎牛血清(购自gibco公司)，32±1℃预热；含酚红mem培养基只在冲洗步骤使用，其余均采用不含酚红mem培养基。所述步骤s2和s6中所述的角膜浊度仪为专门用于检测角膜混浊度的仪器，如德国basf生产的opacitometer3.0和法国riom生产的op-kit，通过光通量的改变反应角膜浊度的变化。操作方法为：打开仪器，让光源稳定5分钟，根据仪器说明书进行调整和校正，放入角膜固定器，直接读取角膜浊度值(op值)，其中opacitometer3.0读取的是照度值(i)，需要根据仪器说明将数据转化为op值。获取角膜基础浊度后，根据仪器说明弃去不合要求的角膜。每次测量角膜浊度值前均需要用新鲜培养更换前后室中旧培养基，操作时避免产生气泡，以免影响试验。所述步骤s3中所述角膜分组，根据角膜基础浊度值，选取浊度值最低的至少3个角膜作为阴性对照，其余的角膜按浊度顺序排序进行分组，每个样品或对照需要至少3个平行。所述步骤s3中所述的受试物或对照组，每个角膜加入1±0.5ml(g)受试物或对照组。一般情况下，受试物均采样原样/原液进行测试，也可采用应用浓度或浓缩液进行，具体可以根据实际需要选择合适的浓度(＞0，≤100％)。阴性对照采用超纯水、生理盐水(0.9％氯化钠溶液)或mem培养基，阳性对照采用1-5％十二烷基硫酸钠(或称月桂醇硫酸钠，sls，cas：151-21-3)，溶于超纯水或无水乙醇(cas：64-17-5，分析纯)。使用前均需要32±1℃预热。所述步骤s3中所述暴露时间和后孵育时间的选择：a.一般情况下，受试物均采样原样/原液进行测试，也可采用应用液或浓缩液进行，具体根据实际需要选择合适的受试物浓度(＞0，≤100％)。b.液体受试物暴露时间5-30min，后孵育时间90-240min，时间的选择需根据实际情况进行；固体受试物暴露时间90-240min，后孵育时间0-240min，时间的选择需根据实际情况进行；所有阳性对照、阴性对照和溶剂对照均采用于受试物相同的暴露条件；c.长期或反复使用或接触眼睛的受试物，选择暴露时间为30min，后孵育时间120分钟；d.按顺序成套使用的一组受试物，选择暴露时间为第一种物质作用10min，去除受试物后再孵育30min，再更换第二种物质作用10min，去除受试物后再孵育30min，再更换第三种受试物质作用10min，依次类推，直至完成所有一组物的暴露；所述步骤s3中的暴露后冲洗，其具体步骤如下：对于液体受试物，通过上方加样孔注入约5ml含酚红mem，竖直方向上晃动固定器，去除含受试物培养基，观察记录颜色变化，重复此步骤至少3次，直至肉眼可见受试物无残留，再用不含酚红mem冲洗至少1次，直至去除含酚红培养基。对于固体受试物，需再次打开加样玻璃窗，加入约5ml含酚红mem进行清洗，清洗步骤如同液体受试物清洗步骤，最后需要将玻璃窗安装回固定器中。所述步骤s4中的酶活性/细胞因子包括：乳酸脱氢酶(ldh)、il-1α、tgf-α、fgf等所述步骤s5中的荧光素钠溶液，分为4％(适用于液体受试物)和5％(适用于固体受试物)两种。荧光素钠(cas：518-47-8)，购自sigma公司，使用无菌不含ca2+、mg2+的dpbs(购自gibco公司)配制，充分混匀，4℃避光可保存8周，使用前32±1℃预热。所述步骤s4中的肉眼观察包括直接观察和采用裂隙灯辅助，作为附加评价指标；直接观察时需要记录暴露前后所观察到特征，采用图像记录或文字描述；采用裂隙灯检查时，将其调为亮度为中等的裂隙光，调整角度和宽度，角膜上皮检查时光源角度45°，角膜基质和内皮检查时，裂隙宽度2mm，对角膜进行检查，记录所检查到的结果。所述步骤s4中的渗透性评价指标，去除角膜固定器前室液体，加入1ml荧光素钠溶液，荧光素钠透过角膜上皮渗透进入角膜固定器后室，反映角膜上皮完整性，混匀并取360μl后室液体，使用酶标仪或96孔读板机，在490nm波长下读取吸光度值(od490)。所述步骤s4中的酶活性和细胞因子检测，收集后室液体，采用elisa法或其他检测方法定量检测相应指标，操作根据相应说明书进行，反应角膜在受试物作用下产生炎性反应的程度。所述步骤s4中的组织学评价指标，是指将角膜固定在4％多聚甲醛或中性福尔马林溶液中，4℃固定至少24小时；按常规梯度乙醇脱水、二甲苯中透明、石蜡包埋，切片厚度为4～7μm，h-e染色，中性树胶封片；显微镜观察：分别对角膜上皮、基质和内皮进行组织学评价，并作图像记录和文字描述，评价指标可以角膜全层厚度、上皮厚度和完整性、基质厚度和水肿情况，以及内皮厚度，作为附加评价指标。所述步骤s5中的角膜体外评分＝校正op值+15×校正od490；校正op值＝op变化值-阴性对照op值；op变化值＝暴露后op值-基础op值；校正od490＝角膜od490-阴性对照od490。所述步骤s5中的角膜炎性物质的释放，定量检测后，采用合适的统计学方法进行分析。本方法同时适用于多种物理状态的受试物，挥发性物质有可能削弱其刺激性预测，暂不适用于气体和气溶胶物质；膏霜类、蜡状或半固体等均视为液体处理。具体实施例1基于牛角膜检测某化妆品套装多重暴露下眼刺激性预测1、实验材料的准备1.1溶液的配制1.1.1hbss溶液：hbss粉剂1包(购自sigma)，加入0.35g碳酸氢钠(国产分析纯)，加入1l超纯水，充分混匀，用盐酸调节ph值到7.2-7.3，0.22μm滤膜过滤除菌，加入青霉素(100iu/ml)和链霉素(100iu/ml)，4℃冰箱可保存4周。1.1.2mem培养基：mem培养基粉剂1包(购自sigma)，加入2.2g碳酸氢钠(国产分析纯)和0.292gl-谷氨酰胺(购自sigma)，加入1l超纯水，充分混匀，用盐酸调节ph值到7.2-7.3，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃冰箱可保存4周。含酚红和不含酚红配制方法相同。使用前加入1％胎牛血清(购自gibco)。1.1.3荧光素钠溶液：准确称取荧光素钠0.10g(购自sigma)，加入25mldpbs溶液(购自gibco)，配制成0.4％荧光素钠溶液。准确称取荧光素钠0.125g，加入25mldpbs溶液，配制成0.4％荧光素钠溶液。4℃避光条件下可保存8周。1.2试验器械的准备所有取牛眼球的器械和分离角膜的器械都需要经过无菌处理。1.3受试物和对照组的准备1.3.1受试物准备：受试物为市售某化妆品公司生产的基础护肤套装，含有洁面乳、柔肤水和乳液。根据说明书，产品使用顺序和方法为先用洁面乳清洁脸部3分钟，用清水清洗，擦干后取适量柔肤水轻拍脸上，接着均匀涂抹乳液。将受试物分为a(洁面乳)、b(柔肤水)、c(乳液)、d(a+b)、e(a+c)、f(b+c)和g(a+b+c)七组。1.3.2阴性对照组：超纯水。1.3.3阳性对照组：无水乙醇。1.4离体牛眼球的获取1.4.1将1lhbss溶液装于2.5l广口瓶中，4℃冷藏，保温箱运输至屠宰场。摘取牛眼器械置于不锈钢盒子中运输。1.4.2本次牛眼由屠宰场经培训的工作人员摘取，并立即放入冰冷hbss中，完成后运输回实验室。2试验过程2.1离体角膜的制备2.1.1检查眼球，弃去任何肉眼可见损伤或病变的眼球。2.1.2以手术刀在角膜外2-3mm孔膜处做一小切口，剪刀环切下角膜，外周保留2-3mm巩膜，夹住巩膜，以镊子轻轻剥离玻璃体和虹膜。2.1.3将角膜内皮朝上置于hbss溶液中进行清洗，洗去残旧的附属组织。2.1.4将角膜上皮朝上置于角膜固定器后室，放上并固定前室。2.1.5固定之后，先后室再前室的顺序加入mem培养基，排空气泡。再次检查角膜有无异常，弃去任何异常角膜。2.1.6将角膜固定器水平放置，置于培养箱中孵育1.5h。2.2浊度测量和分组2.2.1取出角膜固定器，按前室后室的顺序抽出mem培养基，按后室前室的顺序加入新鲜mem培养基，排空气泡。2.2.2打开opacitometer3.0浊度仪，按照说明书进行调整并使用3个标准滤光片进行仪器检测。放入一个含有mem培养基但不含角膜的固定器，记录数值(i0)，单位lux，作为空白值。将每个角膜放入，记录相应的数值(i)。2.2.3根据仪器说明书上提供的公式，对每个角膜浊度值进行判断，弃去不符合要求的角膜。2.2.4将角膜顺序按i的大小排序，选取数值最大的9个角膜作为阴性对照组(nc1-3)，其余的角膜依次分为受试物组a、b、c、d、e、f、g和阳性对照组(pc1-3)，每组3个角膜，贴好标签。2.3受试物暴露2.3.1去除前室所有液体。分别从加样孔中加入0.75ml不同受试物进行暴露：2.3.1.1单独暴露：分别加入a、b和c受试物，竖直放置，返回培养箱中，时间为10min，暴露结束，直接进入冲洗步骤。2.3.1.2双重暴露：d和e组各自加入a受试物，f组加入b受试物，竖直放置，返回培养箱中，时间为10min，结束后进行冲洗步骤，完成后d组加入b受试物，e和f组各种加入c受试物。竖直放置，再次返回培养箱中，时间为10min，暴露结束，直接进入冲洗步骤。2.3.1.3三重暴露：g组加入受试物a，竖直放置，返回培养箱中，时间为10min，结束后进行冲洗步骤；第二次加入b受试物，竖直放置，再次返回培养箱中，时间为10min，结束后进行冲洗步骤；第三次加入c受试物，竖直放置，最后一次返回培养箱中，时间为10min，至此暴露结束，直接进入冲洗步骤。2.4冲洗2.4.1吸弃受试物，加样孔加入约5ml含酚红mem培养基，竖直方向晃动固定器，使液体充分接触角膜，吸弃液体，重复此步骤至少3次，直至受试物无肉眼可见残留。2.4.2最后一次吸弃含酚红mem培养基，加入不含酚红mem培养基，清洗至少1次，直至完全去除含酚红mem培养基。2.4.3再次检查有无受试物残留，如有，继续2.4.2冲洗，如无，需要多重暴露的受试物返回暴露步骤，或者冲洗结束进入后孵育。2.5后孵育冲洗完成后，前室重新填充新鲜mem培养基，返回培养箱进行后孵育，时间240min。2.6浊度测量2.6.1后孵育完成后，用新鲜mem培养基更换前后室液体，先前室再后室的顺序吸弃液体，填充液体时顺序为先后室再前室。2.6.2打开opacitometer3.0浊度仪，依次放入各组角膜，记录相应数值。2.7荧光素钠渗透吸弃前室液体，加入1ml0.4％荧光素钠溶液，竖直放置，在培养箱中孵育90min。2.8吸光度测量2.8.1收集后室全部液体，充分混匀，取360μl后室液体，置于96孔板中，做好标记。2.8.2打开酶标仪，放入96孔板，选择检测波长490nm，读取相应吸光度值(od490)。3数据分析3.1浊度值的换算根据仪器说明书，op值转换公式如下：3.2体外评分的计算op变化值＝暴露后op值-暴露前op值校正op值＝op变化值-平均阴性对照op值校正od490＝受试物od490-平均阴性对照od490体外评分＝校正op值-校正od4903.3体外评分结果和眼刺激性预测3.4肉眼观察结果pc组暴露后可见角膜浑浊或变白，nc组和受试物组各角膜均肉眼可见无明显变化，角膜呈透明状。4.结论4.1在本次试验条件下，a、b和c组在标准暴露时间下，眼刺激性预测为无刺激性。4.2在本次试验条件下，d、e和f组在双重暴露下，d组预测为微弱刺激性，e和f组预测为无刺激性。4.3在本次试验条件下，g组在三重暴露下预测为微弱刺激性。实施例2基于牛角膜检测某品牌眼药水多次暴露下眼刺激性预测1、实验材料的准备1.1溶液的配制1.1.1hbss溶液：hbss粉剂1包(购自sigma)，加入0.35g碳酸氢钠(国产分析纯)，加入1l超纯水，充分混匀，用盐酸调节ph值到7.2-7.3，0.22μm滤膜过滤除菌，加入青霉素(100iu/ml)和链霉素(100iu/ml)，4℃冰箱可保存4周。1.1.2mem培养基：mem培养基粉剂1包(购自sigma)，加入2.2g碳酸氢钠(国产分析纯)和0.292gl-谷氨酰胺(购自sigma)，加入1l超纯水，充分混匀，用盐酸调节ph值到7.2-7.3，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃冰箱可保存4周。含酚红和不含酚红配制方法相同。使用前加入1％胎牛血清(购自gibco)。1.1.3荧光素钠溶液：准确称取荧光素钠0.10g(购自sigma)，加入25mldpbs溶液(购自gibco)，配制成0.4％荧光素钠溶液。准确称取荧光素钠0.125g，加入25mldpbs溶液，配制成0.4％荧光素钠溶液。4℃避光条件下可保存8周。1.1.4ldh检测试剂盒(elisa)购自南京建成生物工程研究所。1.2试验器械的准备所有取牛眼球的器械和分离角膜的器械都需要经过无菌处理。1.3受试物和对照组的准备1.3.1受试物准备：受试物为市售某品牌眼药水，共3种眼药水，均为乙类otc，无色透明液体，分别标记受试物abc。1.3.2阴性对照组：超纯水。1.3.3阳性对照组：1.5％sls1.4离体牛眼球的获取1.4.1将1lhbss溶液装于2.5l广口瓶中，4℃冷藏，保温箱运输至屠宰场。摘取牛眼器械置于不锈钢盒子中运输。1.4.2本次牛眼由屠宰场经培训的工作人员摘取，并立即放入冰冷hbss中，完成后运输回实验室。2试验过程2.1离体角膜的制备2.1.1检查眼球，弃去任何肉眼可见损伤或病变的眼球。2.1.2以手术刀在角膜外2-3mm孔膜处做一小切口，剪刀环切下角膜，外周保留2-3mm巩膜，夹住巩膜，以镊子轻轻剥离玻璃体和虹膜。2.1.3将角膜内皮朝上置于hbss溶液中进行清洗，洗去残旧的附属组织。2.1.4将角膜上皮朝上置于角膜固定器后室，放上并固定前室。2.1.5固定之后，先后室再前室的顺序加入mem培养基，排空气泡。再次检查角膜有无异常，弃去任何异常角膜。2.1.6将角膜固定器水平放置，置于培养箱中孵育1.5h。2.2浊度测量和分组2.2.1取出角膜固定器，按前室后室的顺序抽出mem培养基，按后室前室的顺序加入新鲜mem培养基，排空气泡。2.2.2打开opacitometer3.0浊度仪，按照说明书进行调整并使用3个标准滤光片进行仪器检测。放入一个含有mem培养基但不含角膜的固定器，记录数值(i0)，单位lux，作为空白值。将每个角膜放入，记录相应的数值(i)。2.2.3根据仪器说明书上提供的公式，对每个角膜浊度值进行判断，弃去不符合要求的角膜。2.2.4将角膜顺序按i的大小排序，选取数值最大的9个角膜作为阴性对照组(nc1-nc3)，其余的角膜依次分为受试物组a1-a3、b1-b3、c1-c3和阳性对照组(pc1-3)每组3个角膜，贴好标签。2.3受试物暴露2.3.1去除前室所有液体。分别从加样孔中加入0.75ml不同受试物进行暴露：2.3.1.1单次暴露：分别加入a、b和c受试物，竖直放置，返回培养箱中，时间为30±3min，暴露结束，直接进入冲洗步骤。2.3.1.2多次暴露：分别加入a、b和c受试物，竖直放置，返回培养箱中，时间为30min，结束后进行冲洗步骤，重复上述步骤2次，合计暴露两次，至此暴露结束，直接进入冲洗步骤。2.3.1.3多次暴露：分别加入a、b和c受试物，竖直放置，返回培养箱中，时间为30min，结束后进行冲洗步骤，重复上述步骤2次，合计暴露三次，至此暴露结束，直接进入冲洗步骤。2.4冲洗2.4.1吸弃受试物，加样孔加入约5ml含酚红mem培养基，竖直方向晃动固定器，使液体充分接触角膜，吸弃液体，重复此步骤至少3次，直至受试物无肉眼可见残留。2.4.2最后一次吸弃含酚红mem培养基，加入不含酚红mem培养基，清洗至少1次，直至完全去除含酚红mem培养基。2.4.3再次检查有无受试物残留，如有，继续2.4.2冲洗，如无，需要多重暴露的受试物返回暴露步骤，或者冲洗结束进入后孵育。2.5后孵育冲洗完成后，前室重新填充新鲜mem培养基，返回培养箱进行后孵育，时间120min。2.6浊度测量2.6.1后孵育完成后，用新鲜mem培养基更换前后室液体，先前室再后室的顺序吸弃液体，填充液体时顺序为先后室再前室。2.6.2打开opacitometer3.0浊度仪，依次放入各组角膜，记录相应数值。2.7荧光素钠渗透吸弃前室液体，加入1ml0.4％荧光素钠溶液，竖直放置，在培养箱中孵育90min。2.8吸光度测量2.8.1收集后室全部液体，充分混匀，取360μl后室液体，置于96孔板中，做好标记。2.8.2打开酶标仪，放入96孔板，选择检测波长490nm，读取相应吸光度值。2.9ldh释放量取2.8.1收集到的后室液体，用南京建成生物工程研究所的ldh试剂盒，根据说明书操作，用酶标仪在450nm处读取吸光度值(od450)。3数据分析3.1浊度值的换算根据仪器说明书，op值转换公式如下：3.2体外评分的计算op变化值＝暴露后op值-暴露前op值校正op值＝op变化值-平均阴性对照op值校正od490＝受试物od490-平均阴性对照od490体外评分＝校正op值-校正od4903.3体外评分结果和眼刺激性预测3.4肉眼观察结果pc组暴露后可见角膜浑浊或变白，nc组和受试物组各角膜均肉眼可见无明显变化，角膜呈透明状。3.5ldh释放量4.结论4.1在本次试验条件下，a1、b1和c1组在单次暴露规定暴露时间下，眼刺激性预测为无刺激性。4.2在本次试验条件下，a2、b2、c2、a3、b3和c3组在多次暴露规定暴露时间下，眼刺激性预测为无刺激性。4.3在本次试验条件下，经统计学分析，c组在不同暴露条件下ldh含量百分比高于相应的a和b组，提示c组可能对角膜细胞产生微弱的作用，多次暴露下c组在眼刺激安全性上可能略差于a和b组。实施例3基于牛角膜检测某品牌隐形眼睛护理液多次暴露下眼刺激性预测1、实验材料的准备1.1溶液的配制1.1.1hbss溶液：hbss粉剂1包(购自sigma)，加入0.35g碳酸氢钠(国产分析纯)，加入1l超纯水，充分混匀，用盐酸调节ph值到7.2-7.3，0.22μm滤膜过滤除菌，加入青霉素(100iu/ml)和链霉素(100iu/ml)，4℃冰箱可保存4周。1.1.2mem培养基：mem培养基粉剂1包(购自sigma)，加入2.2g碳酸氢钠(国产分析纯)和0.292gl-谷氨酰胺(购自sigma)，加入1l超纯水，充分混匀，用盐酸调节ph值到7.2-7.3，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃冰箱可保存4周。含酚红和不含酚红配制方法相同。使用前加入1％胎牛血清(购自gibco)。1.1.3荧光素钠溶液：准确称取荧光素钠0.10g(购自sigma)，加入25mldpbs溶液(购自gibco)，配制成0.4％荧光素钠溶液。准确称取荧光素钠0.125g，加入25mldpbs溶液，配制成0.4％荧光素钠溶液。4℃避光条件下可保存8周。1.1.4ldh检测试剂盒(elisa)购自南京建成生物工程研究所。1.2试验器械的准备所有取牛眼球的器械和分离角膜的器械都需要经过无菌处理。1.3受试物和对照组的准备1.3.1受试物准备：受试物为市售某3种品牌隐形眼睛护理液，无色透明液体，分别标记受试物abc。1.3.2阴性对照组：超纯水。1.3.3阳性对照组：3％sls1.4离体牛眼球的获取1.4.1将1lhbss溶液装于2.5l广口瓶中，4℃冷藏，保温箱运输至屠宰场。摘取牛眼器械置于不锈钢盒子中运输。1.4.2本次牛眼由屠宰场经培训的工作人员摘取，并立即放入冰冷hbss中，完成后运输回实验室。2试验过程2.1离体角膜的制备2.1.1检查眼球，弃去任何肉眼可见损伤或病变的眼球。2.1.2以手术刀在角膜外2-3mm孔膜处做一小切口，剪刀环切下角膜，外周保留2-3mm巩膜，夹住巩膜，以镊子轻轻剥离玻璃体和虹膜。2.1.3将角膜内皮朝上置于hbss溶液中进行清洗，洗去残旧的附属组织。2.1.4将角膜上皮朝上置于角膜固定器后室，放上并固定前室。2.1.5固定之后，先后室再前室的顺序加入mem培养基，排空气泡。再次检查角膜有无异常，弃去任何异常角膜。2.1.6将角膜固定器水平放置，置于培养箱中孵育1.5h。2.2浊度测量和分组2.2.1取出角膜固定器，按前室后室的顺序抽出mem培养基，按后室前室的顺序加入新鲜mem培养基，排空气泡。2.2.2打开opacitometer3.0浊度仪，按照说明书进行调整并使用3个标准滤光片进行仪器检测。放入一个含有mem培养基但不含角膜的固定器，记录数值(i0)，单位lux，作为空白值。将每个角膜放入，记录相应的数值(i)。2.2.3根据仪器说明书上提供的公式，对每个角膜浊度值进行判断，弃去不符合要求的角膜。2.2.4将角膜顺序按i的大小排序，选取数值最大的9个角膜作为阴性对照组(nc1-nc3)，其余的角膜依次分为受试物组a1-a3、b1-b3、c1-c3和阳性对照组(pc1-3)每组3个角膜，贴好标签。2.3受试物暴露2.3.1去除前室所有液体。分别从加样孔中加入0.75ml不同受试物进行暴露：2.3.1.1单次暴露：分别加入a、b和c受试物，竖直放置，返回培养箱中，时间为20min，暴露结束，直接进入冲洗步骤。2.3.1.2多次暴露：分别加入a、b和c受试物，竖直放置，返回培养箱中，时间为20min，结束后进行冲洗步骤，重复上述步骤2次，合计暴露两次，至此暴露结束，直接进入冲洗步骤。2.3.1.3多次暴露：分别加入a、b和c受试物，竖直放置，返回培养箱中，时间为20min，结束后进行冲洗步骤，重复上述步骤2次，合计暴露三次，至此暴露结束，直接进入冲洗步骤。2.4冲洗2.4.1吸弃受试物，加样孔加入约5ml含酚红mem培养基，竖直方向晃动固定器，使液体充分接触角膜，吸弃液体，重复此步骤至少3次，直至受试物无肉眼可见残留。2.4.2最后一次吸弃含酚红mem培养基，加入不含酚红mem培养基，清洗至少1次，直至完全去除含酚红mem培养基。2.4.3再次检查有无受试物残留，如有，继续2.4.2冲洗，如无，需要多重暴露的受试物返回暴露步骤，或者冲洗结束进入后孵育。2.5后孵育冲洗完成后，前室重新填充新鲜mem培养基，返回培养箱进行后孵育，时间120min。2.6浊度测量2.6.1后孵育完成后，用新鲜mem培养基更换前后室液体，先前室再后室的顺序吸弃液体，填充液体时顺序为先后室再前室。2.6.2打开opacitometer3.0浊度仪，依次放入各组角膜，记录相应数值。2.7荧光素钠渗透吸弃前室液体，加入1ml0.4％荧光素钠溶液，竖直放置，在培养箱中孵育90min。2.8吸光度测量2.8.1收集后室全部液体，充分混匀，取360μl后室液体，置于96孔板中，做好标记。2.8.2打开酶标仪，放入96孔板，选择检测波长490nm，读取相应吸光度值。2.9ldh释放量取2.8.1收集到的后室液体，用南京建成生物工程研究所的ldh试剂盒，根据说明书操作，用酶标仪在450nm处读取吸光度值(od450)。3数据分析3.1浊度值的换算根据仪器说明书，op值转换公式如下：3.2体外评分的计算op变化值＝暴露后op值-暴露前op值校正op值＝op变化值-平均阴性对照op值校正od490＝受试物od490-平均阴性对照od490体外评分＝校正op值-校正od4903.3体外评分结果和眼刺激性预测3.4肉眼观察结果pc组暴露后可见角膜浑浊或变白，nc组和受试物组各角膜均肉眼可见无明显变化，角膜呈透明状。3.5ldh释放量4.结论4.1在本次试验条件下，a1、b1和c1组在单次暴露规定暴露时间下，眼刺激性预测为无刺激性。4.2在本次试验条件下，a2、b2、c2、a3、b3和c3组在多次暴露规定暴露时间下，眼刺激性预测为无刺激性。4.3在本次试验条件下，经统计学分析，b和c组在不同暴露条件下ldh含量百分比高于相应的a组，提示b和c组可能对角膜细胞产生微弱的作用，仅从眼刺激安全性考虑，长期使用a受试物可能优于b和c受试物。当前第1页12