一种基于OCTS技术的淋系白血病CAR‑T治疗载体及其构建方法和应用与流程

本发明属于医学生物领域，具体涉及一种载体，尤其涉及一种基于octs技术的淋系白血病car-t治疗载体。此外，本发明还涉及该载体的构建方法和应用。
背景技术：
：肿瘤免疫治疗的理论基础是免疫系统具有识别肿瘤相关抗原、调控机体攻击肿瘤细胞(高度特异性的细胞溶解)的能力。1950年代，burnet和thomas提出了“免疫监视”理论，认为机体中经常会出现的突变的肿瘤细胞可被免疫系统所识别而清除，为肿瘤免疫治疗奠定了理论基础[burnetfm.immunologicalaspectsofmalignantdisease.lancet,1967；1:1171-4]。随后，各种肿瘤免疫疗法包括细胞因子疗法、单克隆抗体疗法、过继免疫疗法、疫苗疗法等相继应用于临床。2013年一种更先进的肿瘤免疫疗法---car-t疗法成功用于临床，并表现了前所未有的临床疗效。car-t，全称是chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，嵌合抗原受体t细胞免疫疗法。该疗法是通过转基因的手段，将启动子、抗原识别区、共刺激因子、效应区等共同组成的嵌合分子，导入t细胞基因组内，从而使t细胞对靶细胞的识别、信号转导、杀伤等功能融为一体，实现了对靶细胞的特异性杀伤[eleanorj.cheadle,etal.cartcells:drivingtheroadfromthelaboratorytotheclinic.immunologicalreviews2014.vol.257:91–106]。car-t疗法在临床上最领先的有诺华的clt019，采用clt019治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者，六个月的肿瘤无进展生存率达到67％，其中最长的应答时间达到两年多。总部位于中国上海的上海优卡迪生物医药科技有限公司与医院合作，截止到2017年2月，共治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者36例，其中完全24例，缓解比例达到66.6％。这是抗癌研究的颠覆性突破。car-t细胞疗法可能是最有可能治愈癌症的手段之一，并被《science》杂志评为2013年度十大科技突破之首。car-t目前在治疗b-淋巴细胞白血病等几种类型的血液肿瘤方面疗效显著，但是也存在一些局限性，目前一个嵌合抗原受体只能识别一种抗原靶标，肿瘤细胞是个复杂的群体，含有相应抗原的肿瘤细胞被清除以后，不含相应抗原的肿瘤细胞会迅速增殖，一段时间后导致肿瘤复发。那么要使car-t识别能同时识别两种抗原，就有两个方案可选：一是将两组嵌合抗原受体构建进入一个慢病毒转基因载体，一次性将两组嵌合抗原受体转导进入原代t淋巴细胞；二是用两个慢病毒转基因载体分两次转导，将两组嵌合抗原受体分别转导进入原代t淋巴细胞。方案一的缺点在于占用慢病毒转基因载体的宝贵容量，不利于装载其它功能元件；转基因载体包装效率低；基因转导效率非常低，很难转导进入原代t淋巴细胞内。方案二的缺点在于需要经过两次转导，两次转导的综合效率较低，转导周期时间长，原代细胞容易衰老，导致增殖能力衰退，杀伤功能下降，影响肿瘤清除疗效。人b-lymphocyteantigencd19，又称为cd19，是一种由人cd19基因编码的蛋白质。cd19主要表达在滤泡树突状细胞和b细胞表面。cd19在造血干细胞表面不表达，它存在于pro-bcell到memorybcell的发育阶段，消失于浆细胞(plasmacell)表面。cd19在大多数b细胞恶性肿瘤表面表达，包括慢性淋巴细胞白血病(cll)，b急性淋巴细胞白血病(b-all)，弥漫大b细胞淋巴瘤(dlbcl)，滤泡性淋巴瘤(fl)套细胞淋巴瘤(mcl)。因此，cd19是一个良好的肿瘤细胞免疫治疗的靶点[scheuermannrh,racilae.cd19antigeninleukemiaandlymphomadiagnosisandimmunotherapy.leukemia&lymphoma.1995,18(5-6):385–97.]。cd22是主要在成熟b淋巴细胞表达的ⅰ型跨膜蛋白，在b细胞信号传导中起重要作用。cd22作为b细胞受体(bcr)的一个共受体，通过抗原引起cd22与bcr交联，触发cd22磷酸化，主要使下游信号蛋白去磷酸化和失活，抑制bcr信号传导。cd22普遍存在于正常b细胞和b细胞恶性肿瘤中。cd20作为一种信号转导复合物的成分对b淋巴细胞的生长有调节作用，并且cd20特异性表达在prebcell到maturebcell的分化阶段，尤其是大多数淋巴瘤细胞表面(mohamed-rachidboulasselandahmedgalal.immunotherapyforb-cellneoplasmsusingtcellsexpressingchimericantigenreceptors.sultanqaboosuniversitymedj,august2012,vol.12,iss.3,pp.273-285.)。cd30属于肿瘤坏死因子受体家族，在淋巴细胞的凋亡和增殖中起重要作用，几乎在所有的霍奇金淋巴瘤和部分非霍奇金淋巴瘤表面都有表达，目前在临床作为霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤诊断的重要标志(carlosa.ramos,etal.chimerict-cellsfortherapyofcd30+hodgkinandnon-hodgkinlymphomas(hl&nhl).biologyofbloodandmarrowtransplantation,2016,22(3):s145-s146.)。cd123是人白介素3受体的alpha链，在大多数的急性髓系白血病(aml)细胞和很多造血细胞表面均有表达，cd123是一个非常好的免疫治疗靶点，因为即使在cd123表达很少的细胞里，它的表达会随时间增长逐渐增强，并且急性髓系白血病很可能是由于处于白血病前期的造血干细胞经过克隆演化而来，以cd123为靶点，则可以起到清髓的作用(saargill,carlh.juneetal.preclinicaltargetingofhumanacutemyeloidleukemiaandmyeloablationusingchimericantigenreceptor-modifiedtcells.blood.2014；123(15):2343-2354.)。il-6受体(il-6r)由一个il6受体亚单位和两个gp130信号转导亚单位组成，主要分布于肝细胞、中性粒细胞、单核、巨噬细胞以及淋巴细胞表面；另外还有一种可溶性受体(sil-6r)，这种受体缺乏跨膜成分和胞质成分，在信号转导中，活化的sil-6r与膜结合gp130亚单位结合，发挥其作用[rosejs,schellerj,elsong,etal.interleukin-6biologyiscoordinatedbymembrane-boundandsolublereceptors:roleinin-flammationandcancer.jleukocbiol,2006,80:227-236]。car-t细胞治疗中的细胞因子风暴(crs)就与il-6信号通路的过度活化相关，阻断封闭il-6r，有利于阻断il-6信号通路的过度激活，从而控制crs反应。目前，尚未有克服上述缺点针对cd19以及选自cd22、cd20、cd30、cd123中的任意一种抗原组成的双抗原的car-t治疗的相关报道。技术实现要素：本发明要解决的技术问题之一是提供一种基于octs技术的淋系白血病car-t治疗载体。首先，其仅需要一次转导，转导效率高，不影响car-t治疗的疗效；其次，其不占用慢病毒转基因载体的宝贵容量，利于装载其它功能元件。第三，能有效封闭il6r，阻断il6信号通路，防止炎症因子风暴(crs)升级。本发明要解决的技术问题之二是提供该载体的构建方法。本发明要解决的技术问题之三是提供该载体的应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：在本发明的一方面，提供一种基于octs技术的淋系白血病car-t治疗载体，包括慢病毒骨架质粒、人ef1α启动子、octs嵌合受体结构域和il6r单链抗体；所述慢病毒骨架质粒包括：用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因ampr序列，如seqidno.1所示；用于质粒复制的原核复制子pucori序列，如seqidno.2所示；用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子sv40ori序列，如seqidno.3所示；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；zsgreen1绿色荧光蛋白，如seqidno.11所示；ires核糖体结合序列，如seqidno.12所示；用于增强转基因的表达效率的ewpre增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，如seqidno.13所示；所述人ef1α启动子的序列如seqidno.14所示；所述octs嵌合受体结构域包括：如seqidno.15所示的cd8leader嵌合受体信号肽、两组单链抗体：第一组选自以下四组单链抗体的任意一组：如seqidno.18所示的cd20单链抗体轻链vl、如seqidno.19所示的cd20单链抗体重链vh；如seqidno.20所示的cd22单链抗体轻链vl、如seqidno.21所示的cd22单链抗体重链vh；如seqidno.22所示的cd30单链抗体轻链vl、如seqidno.23所示的cd30单链抗体重链vh；如seqidno.24所示的cd123单链抗体轻链vl、如seqidno.25所示的cd123单链抗体重链vh；第二组为如seqidno.16所示的cd19单链抗体轻链vl以及如seqidno.17所示的cd19单链抗体重链vh；如seqidno.26所示的抗体内铰链inner-linker、如seqidno.27所示的单链抗体间铰链inter-linker、如seqidno.28所示的cd8hinge嵌合受体铰链、如seqidno.29所示的cd8transmembrane嵌合受体跨膜区、如seqidno.32所示的tcr嵌合受体t细胞激活域以及嵌合受体共刺激因子区域；所述嵌合受体共刺激因子区域选自4-1bb、icos、cd27、ox40、cd28、myd88、il1r1、cd70、tnfrsf19l、tnfrsf27、tnfrsf1od、tnfrsf13b、tnfrsf18、cd134等肿瘤坏死因子超家族(tumornecrosisfactorreceptorsuperfamily，tnfrsf)中的任意一种或多种的组合。所述慢病毒包装顺式元件可以采用第二代慢病毒载体，也可以采用第三代慢病毒载体。所述慢病毒包装顺式元件采用第二代慢病毒载体包括：如seqidno.5所示的慢病毒5terminalltr、如seqidno.6所示的慢病毒3terminalself-inactivatingltr、如seqidno.7所示的gag顺式元件、如seqidno.8所示的rre顺式元件、如seqidno.9所示的env顺式元件、如seqidno.10所示的cppt顺式元件。所述慢病毒包装顺式元件采用第三代慢病毒载体包括：如seqidno.5所示的慢病毒5terminalltr、如seqidno.6所示的慢病毒3terminalself-inactivatingltr、如seqidno.7所示的gag顺式元件、如seqidno.8所示的rre顺式元件、如seqidno.9所示的env顺式元件、如seqidno.10所示的cppt顺式元件，以及如seqidno.4所示的rsv启动子。本发明优选采用第三代慢病毒载体。优选的，所述两组单链抗体采用串联连接方式或者转角连接方式；如图4所示：当两组单链抗体为cd20单链抗体和cd19单链抗体时，所述串联连接方式具体为：cd20单链抗体轻链vl与cd19单链抗体轻链vl采用单链抗体间铰链inter-linker连接，cd20单链抗体轻链vl与cd20单链抗体重链vh采用抗体内铰链inner-linker连接，cd19单链抗体轻链vl与cd19单链抗体重链vh采用抗体内铰链inner-linker连接，即pocts2019s(见图4a、图4c)；所述转角连接方式具体为：cd19单链抗体轻链vl与cd19单链抗体重链vh采用抗体内铰链inner-linker连接，cd20单链抗体轻链vl与cd19单链抗体重链vh采用单链抗体间铰链inter-linker连接，cd20单链抗体重链vh与cd19单链抗体轻链vl采用单链抗体间铰链inter-linker连接，即pocts2019t(见图4b、图4c)；当两组单链抗体为cd30单链抗体和cd19单链抗体时，所述串联连接方式具体为：cd30单链抗体轻链vl与cd19单链抗体轻链vl采用单链抗体间铰链inter-linker连接，cd30单链抗体轻链vl与cd30单链抗体重链vh采用抗体内铰链inner-linker连接，cd19单链抗体轻链vl与cd19单链抗体重链vh采用抗体内铰链inner-linker连接，即pocts3019s(见图4a、图4c)；所述转角连接方式具体为：cd19单链抗体轻链vl与cd19单链抗体重链vh采用抗体内铰链inner-linker连接，cd30单链抗体轻链vl与cd19单链抗体重链vh采用单链抗体间铰链inter-linker连接，cd30单链抗体重链vh与cd19单链抗体轻链vl采用单链抗体间铰链inter-linker连接，即pocts3019t(见图4b、图4c)；当两组单链抗体为cd22单链抗体和cd19单链抗体时，所述串联连接方式具体为：cd22单链抗体轻链vl与cd19单链抗体轻链vl采用单链抗体间铰链inter-linker连接，cd22单链抗体轻链vl与cd22单链抗体重链vh采用抗体内铰链inner-linker连接，cd19单链抗体轻链vl与cd19单链抗体重链vh采用抗体内铰链inner-linker连接，即pocts2219s(见图4a、图4c)；所述转角连接方式具体为：cd19单链抗体轻链vl与cd19单链抗体重链vh采用抗体内铰链inner-linker连接，cd22单链抗体轻链vl与cd19单链抗体重链vh采用单链抗体间铰链inter-linker连接，cd22单链抗体重链vh与cd19单链抗体轻链vl采用单链抗体间铰链inter-linker连接，即pocts2219t(见图4b、图4c)；当两组单链抗体为cd123单链抗体和cd19单链抗体时，所述串联连接方式具体为：cd123单链抗体轻链vl与cd19单链抗体轻链vl采用单链抗体间铰链inter-linker连接，cd123单链抗体轻链vl与cd123单链抗体重链vh采用抗体内铰链inner-linker连接，cd19单链抗体轻链vl与cd19单链抗体重链vh采用抗体内铰链inner-linker连接，即pocts12319s(见图4a、图4c)；所述转角连接方式具体为：cd19单链抗体轻链vl与cd19单链抗体重链vh采用抗体内铰链inner-linker连接，cd123单链抗体轻链vl与cd19单链抗体重链vh采用单链抗体间铰链inter-linker连接，cd123单链抗体重链vh与cd19单链抗体轻链vl采用单链抗体间铰链inter-linker连接，即pocts12319t(见图4b、图4c)。优选的，所述il6r单链抗体的序列如seqidno.33所示。优选的，所述ewpre增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件有6个核苷酸的增强突变，具体为：g.396g>a、g.397c>t、g.398t>c、g.399g>a、g.400a>t、g.411a>t。优选的，由所述人ef1α启动子启动整个octs结构基因表达，所述cd8leader嵌合受体信号肽位于octs编码序列的n端，用于引导octs蛋白定位于细胞膜；所述两组单链抗体组合成双抗原识别区，用于识别相应靶抗原；所述cd8hinge嵌合受体铰链用于将scfv锚定于细胞膜外侧；所述cd8transmembrane嵌合受体跨膜区用于将整个嵌合受体固定于细胞膜上；所述cd28嵌合受体共刺激因子用于刺激t淋巴细胞体外激活和体内肿瘤细胞杀伤作用；所述cd134嵌合受体共刺激因子用于促进t淋巴细胞增殖和因子分泌，增强肿瘤免疫，有利于记忆t细胞的长期存活；所述tcr嵌合受体t细胞激活域用于激活下游信号通路的表达；所述il6r单链抗体分泌到细胞外，封闭il6r，阻断il6信号通路，防止炎症因子风暴升级；当抗原识别区域与靶抗原结合时，信号通过嵌合受体传递至细胞内，从而产生t细胞增殖、细胞因子分泌增加、抗细胞凋亡蛋白分泌增加、细胞死亡延迟、裂解靶细胞等一系列生物学效应。优选的，所述嵌合受体共刺激因子区域采用如seqidno.30所示的cd28嵌合受体共刺激因子以及如seqidno.31所示的cd134嵌合受体共刺激因子组合。优选的，所述cd19单链抗体轻链vl、cd19单链抗体重链vh、cd20单链抗体轻链vl、cd20单链抗体重链vh、cd30单链抗体轻链vl、cd30单链抗体重链vh、cd123单链抗体轻链vl、cd123单链抗体重链vh、il6r单链抗体均经过人源化改造。在本发明的第二方面，提供一种上述基于octs技术的淋系白血病car-t治疗载体的构建方法，包括以下步骤：(1)将如seqidno.1所示的含氨苄青霉素抗性基因ampr序列、如seqidno.2所示的原核复制子pucori序列、如seqidno.3所示的病毒复制子sv40ori序列、用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件、如seqidno.11所示的zsgreen1绿色荧光蛋白、如seqidno.12所示的ires核糖体结合序列、如seqidno.13所示的ewpre增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件存储于慢病毒骨架质粒上；(2)将如seqidno.14所示的人ef1α启动子、所述octs嵌合受体结构域以及如seqidno.33所示的il6r单链抗体组合成octs嵌合受体设计方案，经过酶切、连接、重组反应克隆至慢病毒骨架质粒中，得到第三代octs设计的重组慢病毒质粒；(3)将得到的重组慢病毒质粒分别与慢病毒包装质粒ppac-gp、ppac-r以及膜蛋白质粒penv-g共同转染hek293t/17细胞，在hek293t/17细胞中进行基因转录表达后，包装成功重组慢病毒载体会释放到细胞培养上清中，收集包含的重组慢病毒载体的上清液；(4)将得到的重组慢病毒上清采用抽滤、吸附、洗脱的柱纯化方式进行纯化，分别得到重组慢病毒载体。优选的，步骤(4)中，所述抽滤步骤要控制上清体积在200ml～2000ml，控制真空度在-0.5mpa～-0.9mpa，防止由于堵孔带来的载体损失；所述吸附步骤要控制溶液的ph值在6～8，防止ph的变化导致载体失活；所述洗脱步骤要控制洗脱液的离子强度在0.5m～1.0m，防止离子强度的变化导致洗脱不完全或者载体失活。在本发明的第三方面，提供所述的载体在制备治疗淋系白血病的药物中的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明所采用的octs-car-t技术，是在目前传统car-t细胞治疗的基础上，通过对嵌合抗原受体(car)结构的优化改造，使得嵌合抗原受体能够识别两种抗原，大大拓展了car-t细胞的识别范围，针对肿瘤群体的清除更彻底，疗效更持久；避免分批培养car-t细胞，大大节约成本；避免患者多次回输不同靶向car-t细胞，节约了患者的经济支出，降低复发的几率，间接提高患者生存质量。仅需要一次转导，转导效率高，不影响car-t治疗的疗效；不占用慢病毒转基因载体的宝贵容量，利于装载其它功能元件，转基因载体包装效率高，基因转导效率高。octs的全称是onecarwithtwoscfvs，通过串联octs(seriesocts)或者转角octs(turnocts)的连接方式，将两段scfv与整合成一个嵌合分子(如图1所示)，赋予t淋巴细胞hla非依赖的方式识别两种肿瘤抗原的能力，相对于传统的car-t细胞能够识别更广泛的目标，进一步扩大了肿瘤细胞的清除范围。octs的基础设计中包括两个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，taa)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scfv段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区，两个胞内信号转导区和一个效应元件区。scfv区域对于octs的特异性、有效性以及基因改造t细胞自身的安全性来说是关键的决定因素。随着octs-car-t的即将进入临床研究阶段标志着car-t细胞治疗即将进入2.0时代。本发明所采用的载体骨架可以应用于第三代慢病毒载体结构上，也可以应用于第二代慢病毒载体结构上。第二代和第三代慢病毒载体在结构上的区别如图2b所示。本发明优选第三代慢病毒载体(如图2a所示)，3’sinltr去除了u3区域，消除了慢病毒载体自我复制的可能性，大大提高了安全性；增加了cppt和wpre元件，提高了转导效率和转基因的表达效率；采用rsv启动子保证了慢病毒载体包装时核心rna的持续高效转录；采用人自身的ef1α启动子，使car基因能够在人体内长时间持续表达。本发明所述的cd19单链抗体轻链vl、cd19单链抗体重链vh、cd20单链抗体轻链vl、cd20单链抗体重链vh、cd22单链抗体轻链vl、cd22单链抗体重链vh、cd30单链抗体轻链vl、cd30单链抗体重链vh、cd123单链抗体轻链vl、cd123单链抗体重链vh、il6r单链抗体均经过人源化改造，能有有效减少体内人抗鼠抗(humananti-mouseantibodies，hama)的产生，延长scfv的半衰期和作用效果，增加octs-car-t细胞的存在时间。本发明中使用的共刺激因子的一种或若干种组合，能够增加转导后细胞的增殖速率、存活时间、杀伤效率、免疫记忆等特性。本发明采用的octs-car-t细胞由gmp级别的车间生产后，可用于人体临床实验。本发明的重组慢病毒载体可以实现在人t淋巴细胞上表达cd19、cd20、cd22、cd30、cd123等组合的双靶向嵌合抗原受体，引导并激活t淋巴细胞对cd19、cd20、cd22、cd30、cd123等阳性细胞的杀伤作用，在临床上可用于治疗b淋巴细胞白血病、b淋巴瘤的治疗。本发明通过重组慢病毒载体骨架、octs结构域、白介素-6受体(il6r)的singlechainantibody(单链抗体)构建形成重组慢病毒载体，该方式得到的重组慢病毒载体可以实现在人t淋巴细胞内表达il-6r的单链抗体，能有效封闭il6r，阻断il-6信号通路，临床上可用于缓解细胞因子释放综合症(cytokinereleasesyndrome，crs)，保障细胞治疗过程中患者的生命安全。可见，本发明所述的octs-car-t细胞将给肿瘤细胞治疗提供可靠的保障。附图说明图1是本发明所述的octs嵌合受体的示意图，包含了串联octs(seriesocts)和转角octs(turnocts)示意图；图2本发明所述的慢病毒载体结构示意图；其中图2a是本发明采用的第三代慢病毒载体结构示意图，图2b是第二代和第三代慢病毒载体结构比较示意图；图3为本发明实施例1中构建本发明所述的重组慢病毒载体的构建流程图。其中，(a)图是慢病毒骨架质粒plenti-3gbasic的结构示意图；(b)图是8个octs质粒的示意图；(c)图是ppac-gp质粒的结构示意图；(d)图是ppac-r质粒的结构示意图；(e)图是penv-g包装质粒的结构示意图；图4是本发明实施例1中octs结构的元件顺序示意图，其中，a图是串联octs(seriesocts)的结构示意图，b图是转角octs(turnocts)的结构示意图，c图是octs结构的质粒编号(octssymbol)的列表示意图；图5是本发明实施例1中重组慢病毒质粒pocts12319s、pocts2219s、pocts2019s、pocts3019s、pocts12319t、pocts2219t、pocts2019t、pocts3019t的酶切预测及酶切琼脂糖凝胶电泳图；其中图5a是pocts12319s的酶切预测示意图，图5b是pocts12319s的酶切琼脂糖凝胶电泳图；图5c是pocts2219s的酶切预测示意图，图5d是pocts2219s的酶切琼脂糖凝胶电泳图；图5e是pocts2019s的酶切预测示意图，图5f是pocts2019s的酶切琼脂糖凝胶电泳图；图5g是pocts3019s的酶切预测示意图，图5h是pocts3019s的酶切琼脂糖凝胶电泳图；图5i是pocts12319t的酶切预测示意图，图5j是pocts12319t的酶切琼脂糖凝胶电泳图；图5k是pocts2219t的酶切预测示意图，图5l是pocts2219t的酶切琼脂糖凝胶电泳图；图5m是pocts2019t的酶切预测示意图，图5n是pocts2019t的酶切琼脂糖凝胶电泳图；图5o是pocts3019t的酶切预测示意图，图5p是pocts3019t的酶切琼脂糖凝胶电泳图；图5a中的lane1是1kbdnaladdermarker：条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；图5a中的lane2是pocts12319s的bamhi酶切预测：条带从上到下依次为：11384bp、818bp；图5b中的lane1是1kbdnaladdermarker的电泳结果；图5b中的lane2是pocts12319s的bamhi酶切电泳结果；图5c中的lane1是1kbdnaladdermarker：条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；图5c中的lane2是pocts2219s的kpni酶切预测：条带从上到下依次为：7824bp、4322bp；图5d中的lane1是1kbdnaladdermarker的电泳结果；图5d中的lane2是pocts2219s的kpni酶切电泳结果；图5e中的lane1是1kbdnaladdermarker：条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；图5e中的lane2是pocts2019s的apali酶切预测：条带从上到下依次为：4883bp、3931bp、1726bp、1246bp、497bp；图5flane1是1kbdnaladdermarker的电泳结果；图5flane2是pocts2019s的apali酶切电泳结果；图5g中的lane1是1kbdnaladdermarker：条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；图5g中的lane2是pocts3019s的bamhi酶切预测：条带从上到下依次为：10268bp、1197bp、818bp；图5h中的lane1是1kbdnaladdermarker的电泳结果；图5h中的lane2是pocts3019s的bamhi酶切电泳结果；图5i中的lane1是1kbdnaladdermarker：条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；图5i中的lane2是pocts12319t的sali酶切预测：条带从上到下依次为：6934bp、5389bp；图5j中的lane1是1kbdnaladdermarker的电泳结果；图5j中的lane2是pocts12319t的sali酶切电泳结果；图5k中的lane1是1kbdnaladdermarker：条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；图5k中的lane2是pocts2219t的ecori酶切预测：条带从上到下依次为：10626bp、1399bp、311bp；图5l中的lane1是1kbdnaladdermarker的电泳结果；图5l中的lane2是pocts2219t的ecori酶切电泳结果；图5m中的lane1是1kbdnaladdermarker：条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；图5m中的lane2是pocts2019t的psti酶切预测：条带从上到下依次为：9231bp、2554bp、617bp；图5n中的lane1是1kbdnaladdermarker的电泳结果；图5n中的lane2是pocts2019t的psti酶切电泳结果；图5o中的lane1是1kbdnaladdermarker：条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；图5o中的lane2是pocts3019t的sacii酶切预测：条带从上到下依次为：11652bp、887bp；图5p中的lane1是1kbdnaladdermarker的电泳结果；图5p中的lane2是pocts3019t的sacii酶切电泳结果；图6是本发明实施例1中重组慢病毒载体的滴度检测结果示意图；图7为本发明实施例1中所述的octs-car-t细胞构建的步骤流程图，包含分离培养、激活、基因转导、octs-car-t细胞鉴定等阶段；图8是本发明实施例2中octs-car-t细胞的支原体检测结果示意图，其中，lane1为dl2000marker，从上到下条带条带从上到下依次为：2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；lane2为阳性对照；lane3为阴性对照；lane4为pbs；lane5为裂解液；lane6为octs12319s-car-t细胞；lane7为octs2219s-car-t细胞；lane8为octs2019s-car-t细胞；lane9为octs3019s-car-t细胞；lane10为octs12319t-car-t细胞；lane11为octs2219t-car-t细胞；lane12为octs2019t-car-t细胞；lane13为octs3019t-car-t细胞；图9为本发明实施例2中流式检测octs-car-t细胞的转导效率以及免疫分型结果示意图；其中，图9a表示octs12319s-car-t细胞的转导效率结果；图9b表示octs12319s-car-t细胞的免疫分型结果；图9c表示octs2219s-car-t细胞的转导效率结果；图9d表示octs2219s-car-t细胞的免疫分型结果；图9e表示octs2019s-car-t细胞的转导效率结果；图9f表示octs2019s-car-t细胞的免疫分型结果；图9g表示octs3019s-car-t细胞的转导效率结果；图9h表示octs3019s-car-t细胞的免疫分型结果；图9i表示octs12319t-car-t细胞的转导效率结果；图9j表示octs12319t-car-t细胞的免疫分型结果；图9k表示octs2219t-car-t细胞的转导效率结果；图9l表示octs2219t-car-t细胞的免疫分型结果；图9m表示octs2019t-car-t细胞的转导效率结果；图9n表示octs2019t-car-t细胞的免疫分型结果；图9o表示octs3019t-car-t细胞的转导效率结果；图9p表示octs3019t-car-t细胞的免疫分型结果；图10为本发明实施例3中不同效靶比条件下，octs-car-t细胞对靶细胞杀伤效率柱状图；其中，图10a表示octs12319s-car-t细胞和octs12319t-car-t细胞对不同靶细胞的杀伤结果；图10b表示octs2219s-car-t细胞和octs2219t-car-t细胞对不同靶细胞的杀伤结果；图10c表示octs2019s-car-t细胞和octs2019t-car-t细胞对不同靶细胞的杀伤结果；图10d表示octs3019s-car-t细胞和octs3019t-car-t细胞对不同靶细胞的杀伤结果。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。材料1、慢病毒骨架质粒plenti-3gbasic，慢病毒包装质粒ppac-gp、ppac-r以及膜蛋白质粒penv-g，hek293t/17细胞，同源重组酶，oligoannealingbuffer，支原体检测试剂盒，内毒素检测试剂盒，cd19+k562、cd20+k562、cd22+k562、cd30+k562、cd123+k562、cd19+cd123+k562、cd19+cd20+k562、cd19+cd22+k562、cd19+cd30+k562、k562细胞购自世翱(上海)生物医药科技有限公司；慢病毒骨架质粒plenti-3gbasic的具体制备方法已经公开在发明名称为“一种基于复制缺陷性重组慢病毒的car-t转基因载体及其构建方法和应用”，专利申请号为201610008360.5的专利申请说明书中；2、人新鲜外周血由健康供者提供；3、octs12319s、octs2219s、octs2019s、octs3019s、octs12319t、octs2219t、octs2019t、octs3019tdna序列组合由上海优卡迪公司设计(参见图4c)，交给上海捷瑞生物工程有限公司合成，并以寡核苷酸干粉或者质粒形式保存；4、工具酶clai、psti、sacii、sali、ecori、bamhi、apali、kpni、t4dna连接酶均购自neb公司；5、0.22μm-0.8μmpes滤器购自millipore公司；6、d-pbs(-)、0.4％台盼蓝、筛网、各类型细胞培养皿、培养袋、培养板均购自corning公司；7、opti-mem、pen-srep、hepes、fbs、aim-v、rpmi1640、dmem、lipofectamine3000购自invitrogen公司；8、biotinylatedproteinl购自genescript公司；9、ldh检测试剂盒购自promega公司；10、ficoll淋巴细胞分离液购自ge公司；11、20％人血白蛋白注射液购自杰特贝林公司；12、cryopremium冻存液、分选缓冲液来自上海优卡迪公司；13、ril-2，ril-7，，ril-15，ril-21购自peprotech公司；14、cd3单克隆抗体，cd28单克隆抗体，cd3/cd28磁珠cd4/cd8磁珠购自德国miltenyi公司；15、冷冻离心机(美国thermoscientific公司；16、facs流式细胞仪购自thermo公司；17、荧光倒置显微镜购自olympus公司；18、cd4-fitc、cd8-apc购自biolegend公司；19、0.9％生理盐水购自今迈公司；20、proteinlmagneticbeads购自biovision公司；21、primestar、retronectin购自takara公司；22、phycoerythrin(pe)-conjugatedstreptavidin购自bdbioscience公司；23、质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自mn公司；24、感受态细胞top10购自tiangen公司；25、nacl、kcl、na2hpo4.12h2o、kh2po4、trypsin、edta、cacl2、naoh、peg6000均购自上海生工；26、dneasy试剂盒购自上海捷瑞公司；27、sa-hrp购自上海翊圣公司；28、引物：根据引物设计原则设计扩增dna片段和靶位点所需的引物，该引物由上海生物公司合成，具体为：ef1α-f：5’-attcaaaattttatcgatgctccggtgcccgtcagt-3’(seqidno.34)ef1α-r：5’-tcacgacacctgaaatggaaga-3’(seqidno.35)octs-f：catttcaggtgtcgtgaggatccgccaccatggcgctgccggtgac(seqidno.36)octs-r：ggggagggagaggggcttagcgcggcggcagcg(seqidno.37)ires-f：gcccctctccctccccc(seqidno.38)ires-r：attatcatcgtgtttttcaaaggaa(seqidno.39)il6rscab-f：aaaacacgatgataatgccaccatgaactccttctccacaagcg(seqidno.40)il6rscab-r：aatccagaggttgattgtcgacgaattctcatttgcccgggctcag(seqidno.41)wpre-qpcr-f：5’-cctttccgggactttcgcttt-3’(seqidno.42)wpre-qpcr-r：5’-gcagaatccaggtggcaaca-3’(seqidno.43)actin-qpcr-f：5’-catgtacgttgctatccaggc-3’(seqidno.44)actin-qpcr-r：5’-ctccttaatgtcacgcacgat-3’(seqidno.45)29、本发明中，所述seqidno.1，seqidno.2，seqidno.3，seqidno.4，seqidno.5，seqidno.6，seqidno.7，seqidno.8，seqidno.9，seqidno.10，seqidno.11，seqidno12，seqidno.13，seqidno.14，seqidno.15，seqidno.16，seqidno.17，seqidno.18，seqidno.19，seqidno.20，seqidno.21，seqidno.22，seqidno.23，seqidno.24，seqidno.25，seqidno.26，seqidno.27，seqidno.28，seqidno.29，seqidno.30，seqidno.31，seqidno.32，seqidno.33所示dna片段由上海捷瑞生物工程有限公司根据本发明人提供的序列合成。实施例1octs-car-t细胞构建一、重组慢病毒载体lvocts12319s、lvocts2219s、lvocts2019s、lvocts3019s、lvocts12319t、lvocts2219t、lvocts2019t、lvocts3019t的构建、纯化、检测方法。参见图3，本发明所述重组慢病毒载体的构建方法如下：1、将人ef1α启动子(seqidno.14)、octs结构【如seqidno.15所示的cd8leader嵌合受体信号肽、两组单链抗体：第一组选自以下四组单链抗体的任意一组：如seqidno.18所示的cd20单链抗体轻链vl、如seqidno.19所示的cd20单链抗体重链vh；如seqidno.20所示的cd22单链抗体轻链vl、如seqidno.21所示的cd22单链抗体重链vh；如seqidno.22所示的cd30单链抗体轻链vl、如seqidno.23所示的cd30单链抗体重链vh；如seqidno.24所示的cd123单链抗体轻链vl、如seqidno.25所示的cd123单链抗体重链vh；第二组为如seqidno.16所示的cd19单链抗体轻链vl以及如seqidno.17所示的cd19单链抗体重链vh；如seqidno.26所示的抗体内铰链inner-linker、如seqidno.27所示的单链抗体间铰链inter-linker、如seqidno.28所示的cd8hinge嵌合受体铰链、如seqidno.29所示的cd8transmembrane嵌合受体跨膜区、如seqidno.30所示的cd28嵌合受体共刺激因子、如seqidno.31所示的cd134嵌合受体共刺激因子、如seqidno.32所示的tcr嵌合受体t细胞激活域。octs12319s、octs2219s、octs2019s、octs3019s、octs12319t、octs2219t、octs2019t、octs3019t，结构详见图4】、il6r单链抗体(seqidno.33)组合成octs嵌合受体设计方案，经过酶切、连接、重组反应克隆至慢病毒骨架质粒plenti-3gbasic中，分别得到重组慢病毒质粒pocts12319s、pocts2219s、pocts2019s、pocts3019s、pocts12319t、pocts2219t、pocts2019t、pocts3019t，元件顺序和编号如图4c所示。(1)将慢病毒骨架质粒plenti-3gbasic使用clai和ecori限制性内切酶进行双酶切，产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认5823bp的片段v1，并割胶回收置于eppendorf管内，用mn公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；1、溶胶按200μlnti/100mggel比例加入溶胶液，50℃水浴放置5-10分钟。2、结合dna11000g离心30秒，弃去滤液。3、洗膜加入700μlnt3，11000g离心30秒，弃去滤液。4、洗膜重复第三步一次5、晾干11000g离心1分钟，换新的收集管，室温放置1分钟。6、洗脱dna加入15-30μlne，室温放置1分钟，11000g离心1分钟，收集滤液。表1琼脂糖凝胶回收步骤(2)用引物ef1α-f和ef1α-r以合成的人ef1α启动子(seqidno.14)为模板，使用表2中的体系，pcr循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃2min)*35cycle，72℃10min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认1208bp的片段a，并割胶回收置于eppendorf管内，用mn公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；试剂体积(μl)h2o32.55×buffer(withmg2+)10dntp(各2.5mm)4primer1(+)(10μm)1primer2(－)(10μm)1template1primestar0.5表250μlpcr反应体系(3)用引物octs-f和octs-r以合成的octs12319s为模板，使用表2中的体系，pcr循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2363bp的片段b，并割胶回收置于eppendorf管内，用mn公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；(4)用引物octs-f和octs-r以合成的octs2219s为模板，使用表2中的体系，pcr循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2369bp的片段c，并割胶回收置于eppendorf管内，用mn公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；(5)用引物octs-f和octs-r以合成的octs2019s为模板，使用表2中的体系，pcr循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2381bp的片段d，并割胶回收置于eppendorf管内，用mn公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；(6)用引物octs-f和octs-r以合成的octs3019s为模板，使用表2中的体系，pcr循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2381bp的片段e，并割胶回收置于eppendorf管内，用mn公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；(7)用引物octs-f和octs-r以合成的octs12319t为模板，使用表2中的体系，pcr循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2390bp的片段f，并割胶回收置于eppendorf管内，用mn公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；(8)用引物octs-f和octs-r以合成的octs2219t为模板，使用表2中的体系，pcr循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2399bp的片段g，并割胶回收置于eppendorf管内，用mn公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；(9)用引物octs-f和octs-r以合成的octs2019t为模板，使用表2中的体系，pcr循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2411bp的片段h，并割胶回收置于eppendorf管内，用mn公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；(10)用引物octs-f和octs-r以合成的octs3019t为模板，使用表2中的体系，pcr循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2424bp的片段i，并割胶回收置于eppendorf管内，用mn公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；(11)用引物ires-f和ires-r以合成的ires核糖体结合序列(seqidno.12)为模板，使用表2中的体系，pcr循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认575bp的片段j，并割胶回收置于eppendorf管内，用mn公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；(12)用引物il6rscab-f和il6rscab-r以合成的il6r单链抗体(seqidno.33)为模板，使用表2中的体系，pcr循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认1569bp的片段k，并割胶回收置于eppendorf管内，用mn公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；(16)将重组慢病毒质粒dna片段组合(见表3)以5μl总体积且摩尔比1:1:1:1的比例加入eppendorf管内，加入同源重组酶反应液15μl，混匀后在42℃孵育30分钟，转移至冰上放置2-3分钟，将反应液加入50μltop10中，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟，将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟，每管加900μllb培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏，取100μl的转化菌液涂布于amplb琼脂平板上，倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。表3重组慢病毒质粒dna片段组合挑取克隆进行菌落pcr鉴定，鉴定正确的克隆即为重组慢病毒质粒pocts12319s、pocts2219s、pocts2019s、pocts3019s、pocts12319t、pocts2219t、pocts2019t、pocts3019t，对正确的克隆进行酶切鉴定(见图5)，并送测序复核结果。2、重组慢病毒载体lvocts12319s、lvocts2219s、lvocts2019s、lvocts3019s、lvocts12319t、lvocts2219t、lvocts2019t、lvocts3019t的包装。(1)完全培养基：取出预热好的新鲜培养基，加入10％fbs+5mlpen-srep，上下颠倒混匀即可；(2)1xpbs溶液：称量nacl8g，kcl0.2，na2hpo4.12h2o3.58g，kh2po40.24g置于1000ml烧杯中，加入900mlmilli-qgrade超纯水溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，121℃高温湿热灭菌20min；(3)0.25％trypsin溶液:称量trypsin2.5g，edta0.19729g置于1000ml烧杯中，加入900ml1xpbs溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，0.22μm过滤除菌，长期使用可保存至-20℃冰箱；(4)0.5mcacl2溶液：称量36.75gcacl2用400mlmilli-qgrade超纯水溶解；用milli-qgrade超纯水将总体积定容至500ml，混匀；0.22μm过滤除菌，分装保存到50ml离心管中，每管45ml左右，4℃保存。(5)2xhbs溶液：称量4.09gnacl，0.269gna2hpo4，5.96ghepes，用400mlmilli-qgrade超纯水溶解；校准ph仪后，用2mnaoh溶液将hbs溶液的ph调到7.05。调整每瓶hbs的ph消耗2mnaoh为3ml左右；(6)从液氮罐中取出冻存的hek293t/17细胞，迅速转移到37℃水浴中，1～2min后转移到超净台中，无菌操作将冻存管中的液体全部转移至10cm2培养皿中，补足含10％fbs的dmem至8ml/10cm2dish，24h后显微镜观察细胞，细胞汇合的程度大于80％进行传代；(7)选择细胞状态良好、无污染的hek293t/17细胞，每2-6个培养皿为一组，将细胞胰酶消化后，用电动移液器吸取4-12ml完全培养基，向每个消化后的培养皿中加2ml，避免培养皿变干；使用1ml移液器将所有细胞吹打成单细胞悬液，转移到培养基瓶中；(8)将上述2-6个培养皿中的剩余细胞转移到培养基瓶中，并用培养基再冲洗一便培养皿；(9)盖紧培养基瓶盖，上下颠倒10次左右充分混匀细胞悬液，将细胞传到8-24个10cm2培养皿中，每皿的细胞密度应当约4×106个/10ml完全培养基左右。如果细胞密度和预期的相差较大，则需要对细胞进行计数，然后按照4×106个/皿的量接种；(10)每6个培养皿整理为一摞，注意保持上下皿之间的配合。将培养皿左右，前后晃动数次，使细胞充分铺开，然后放入5％co2培养箱。剩余细胞做同样处理；(11)检查所传代细胞，细胞汇合度应当为70-80％，轮廓饱满，贴壁良好，在细胞培养皿中均匀分布；(12)为细胞换液，将培养基替换为新鲜完全培养基,每皿9ml，并将培养箱的co2浓度设定值提高到8％；(13)按照n+0.5配dna/cacl2溶液。每皿hek293t/17细胞转染质粒量按照下列比例使用：重组慢病毒质粒(20μg),ppac-gp(15μg)，ppac-r(10μg),penv-g(7.5μg)。取一个新的5ml离心管，加入0.5mcacl2：0.25ml，重组慢病毒质粒20μg：ppac-gp15μg：ppac-r10μg：penv-g7.5μg，补充超纯水至0.5ml盖上盖子，充分混匀；(14)另取一支5ml离心管，加入0.5mldna/cacl2溶液。打开涡旋振荡器，一只手拿住5ml离心管的上端，使管底接触振荡头，使液体在管壁上散开流动，另一只手拿一把1ml移液枪，吸取0.5ml2×hbs溶液，缓慢滴加进入离心管，控制流速，以半分钟滴完为宜。2×hbs加入后，继续振荡5秒钟，停止振荡，可直接加入需要转染的细胞中；(15)取一皿细胞，将离心管中的1ml钙转液滴加进去，尽可能使钙转试剂分布到整个培养皿中；(16)钙转液加入后，在皿盖上做好标记，将培养皿放还到另一个5％co2培养箱中。确保培养皿水平放置，每摞培养皿不要超过6个。在5％co2培养箱中放置(6–8h)；(17)将第一个培养箱的co2浓度设定值调回到5％；(18)24小时后，检查细胞状态。细胞汇合度应当为80–85％左右，状态良好。将培养基吸走，更换10ml新鲜的dmem完全培养基；(19)48小时后，观察转染效率。绝大多数细胞仍然是贴壁的。可以看到超过95％细胞都会带有绿色荧光。将同一个病毒包装上清液收集到一起，并向培养皿中继续添加10ml新鲜培养基；(20)72小时后，再次将同一个病毒上清液收集到一起，两次收集的病毒可以放在一起，丢弃培养皿；此时收集的上清里包含了重组慢病毒载体lvocts12319s、lvocts2219s、lvocts2019s、lvocts3019s、lvocts12319t、lvocts2219t、lvocts2019t、lvocts3019t。3、离子交换色谱法纯化重组慢病毒载体；(1)将收集的上清液使用thermo真空泵，经0.22μm-0.8μm的pes滤器抽滤，除去杂质；(2)按1:1～1:10的比例往上清中加入1.5mnacl250mmtris-hcl(ph6-8)；(3)将2个离子交换柱串联放置，用4ml1mnaoh、4ml1mnacl、5ml0.15mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)溶液依次过柱；(4)将步骤2中获得的溶液通过蠕动泵以1-10ml/min的速度给离子交换柱上样；(5)全部上清液过柱后，使用10ml0.15mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)溶液清洗一遍；(6)根据上样量使用1-5ml1.5mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)进行洗脱，收集洗脱液；(7)将洗脱液分成25到50μl一管，冻存到-80℃冰箱，进行长期保存；4、重组慢病毒载体滴度测定；(1)取24孔板接种293t细胞。每孔细胞为5×104个，所加培养基体积为500ul,不同种类的细胞生长速度有所差异，进行病毒感染时的细胞融合率为40％-60％；(2)准备3个无菌ep管，在每个管中加入90ul的新鲜完全培养基(高糖dmem+10％fbs)接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为n；(3)取待测定的病毒原液10ul加入到第一个管中，轻轻混匀后，取10ul加入到第二个管中，然后依次操作直到最后一管；在每管中加入410ul完全培养基(高糖dmem+10％fbs),终体积为500ul；(4)感染开始后20小时，除去培养上清，更换为500μl完全培养基(高糖dmem+10％fbs)，5％co2继续培养48小时；(5)72小时后，观察荧光表达情况，正常情况下，荧光细胞数随稀释倍数增加而相应减少,并拍照；(6)用0.2ml0.25％胰酶-edta溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。用培养基吹洗整个细胞面，离心收集细胞。按照dneasy试剂盒的说明抽提基因组dna。每个样品管中加入200μl洗脱液洗下dna并定量；(7)准备目的dna检测qpcrmix总管ⅰ(qpcr引物序列为seqidno.42---seqidno.43)：n＝numberofreactions.例如：总反应数为40，将1ml2×taqmanuniversalpcrmastermix，4μlforwardprimer，4μlreverseprimer，4μlprobe和788μlh2o混和。震荡后放在冰上；(8)准备内参dna检测qpcrmix管ⅱ(qpcr引物序列为seqidno.44---seqidno.45)：2×taqmanmastermix25μl×n10×rnasepprimer/probemix2.5μl×nh2o17.5μl×nn＝numberofreactions.例如：总反应数为40，将1ml2×taqmanuniversalpcrmastermix，100μl10×rnasepprimer/probemix和700μlh2o混和。震荡后放在冰上；(9)在预冷的96孔pcr板上完成pcr体系建立。从总管ⅰ中各取45μl加入到a-d各行的孔中，从总管ⅱ中各取45μl加入到e-g各行的孔中。(10)分别取5μl质粒标准品和待测样品基因组dna加入到a-d行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照(no-templatecontrol)。(11)分别取5μl基因组标准品和待测样品基因组dna加入到e-g行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照(no-templatecontrol)。(12)所使用定量pcr仪为abiprism7500定量系统。循环条件设定为：50℃2分钟，95℃10分钟，然后是95℃15秒，60℃1分钟的40个循环。数据分析：测得的dna样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。滴度(integrationunitsperml，iuml-1)的计算公式如下：iuml-1＝(c×n×d×1000)/v其中：c＝平均每基因组整合的病毒拷贝数n＝感染时细胞的数目(约为1×105)d＝病毒载体的稀释倍数v＝加入的稀释病毒的体积数(13)重组慢病毒载体lvocts12319s、lvocts2219s、lvocts2019s、lvocts3019s、lvocts12319t、lvocts2219t、lvocts2019t、lvocts3019t的滴度结果(如图6所示)；二、octs-car-t细胞构建参见图7，本发明所述octs-car-t细胞的构建方法如下：1、分离pbmc。(1)抽取健康供者新鲜外周血50ml；(2)将采血袋喷拭酒精两遍，并擦干。(3)用50ml注射器将袋中的血细胞吸出来移至新50ml管中。(4)400g，20℃离心10min。(5)将上层血浆移到新的50ml离心管中，56℃，30min灭活血浆，恢复至室温，2000g，离心30min，取上清到50ml离心管中待用。(6)用d-pbs(-)补至50ml，拧紧盖子，颠倒混匀。(7)取2个新50ml离心管，每管加入15mlficoll淋巴细胞分离液。(8)向每管ficoll上小心加入血细胞稀释液25ml。800g，20℃离心20min。(9)离心管中液体分为四层，从上至下分别为：黄色的血浆层(回收待用)、白膜层、无色透明的ficoll层、红黑色的混合细胞层。(10)小心吸取白膜层到新50ml离心管中，补加d-pbs(-)至50ml，颠倒混匀后500g，20℃离心10min。(11)加入25ml5％人血白蛋白并重悬细胞，400g，20℃离心10min。(12)弃上清，加入25ml5％人血白蛋白重悬细胞沉淀，并过70um筛网，计数。(13)取1份含1.25x108cells用于激活；剩余细胞悬液400g，20℃离心10min，加cryopremium并冻存。2、cd4/cd8阳性t细胞分选。(1)将获得的pbmc计数，以80ul/107cells的比例加入分选缓冲液，重悬细胞沉淀。(2)再以20ul/107cells的比例加入cd4/cd8磁珠，吹打混匀后放入4℃中孵育15min。(3)取出磁珠-细胞混合液，以2ml/107cells的比例加入分选缓冲液，颠倒混匀后，250g，4℃离心10min。(4)以500ul/108cells的比例加入分选缓冲液，重悬细胞沉淀。(5)用镊子夹取ls分离柱到磁力架上。(6)同时准备2个15ml离心管，分别标记：cd4-/cd8-细胞液(a管)、cd4+/cd8+细胞液(b管)。(7)用3ml分离缓冲液润洗ls,并用a管接缓冲液。(8)加入细胞-磁珠混合液，滴完后加入3ml缓冲液冲洗柱子(每次无液体残留时再加入新的液体)，总共三次，收集得到cd4/cd8-细胞。(9)ls分离柱与磁力架分离，用b管接细胞悬液，加入5ml缓冲液，将并用柱子内塞稍用力冲洗，收集为cd4+/cd8+细胞，取样计数。(10)按1x106/ml-4x106/ml的细胞密度用aim-v培养基重悬细胞沉淀，并加入2×105～1×106u/lifn-γ因子。3、t细胞激活。(1)提前一天将1×103ug/l～1×104ug/lcd3单克隆抗体和1×103ug/l～1×104ug/lcd28单克隆抗体加入24孔板，封口膜封口，4℃过夜包被。(2)取出包被的t75瓶，倒掉包被液，用d-pbs(-)洗涤一次，并将分选得到的细胞悬液接种到t75瓶中，摇匀，放入37℃、5％co2培养箱中培养。4、car基因转导及octs-car-t细胞诱导培养。(1)提前一天包被1×103ug/l～1×104ug/lretronectin于24孔板内，封口膜封口，4℃过夜包被。(2)往24孔板中，根据每孔5×105细胞量，按moi＝5～20的量，分别加入lvocts12319s、lvocts2219s、lvocts2019s、lvocts3019s、lvocts12319t、lvocts2219t、lvocts2019t、lvocts3019t慢病毒转基因载体，同时添加含2×105～5×105u/lril-2，5×103ng/l～1×104ng/lril-7，5×103ng/l～1×104ng/lril-15，5×103ng/l～1×104ng/lril-21和含10％自体血清的aim-v培养基37℃、5％co2继续培养。5、octs-car-t细胞体外扩增。(1)每2天等量补加含2×105～5×105u/lril-2，5×103ng/l～1×104ng/lril-7，5×103ng/l～1×104ng/lril-15，5×103ng/l～1×104ng/lril-21和含10％自体血清的aim-v培养基，使ph值维持在6.5～7.5之间，细胞密度维持在5×105～2×106/ml之间，37℃、5％co2继续培养10-14天。(2)第7天左右，冻存培养的octs-car-t细胞用于后续检测。实施例2octs-car-t细胞病原检测和表达检测。一、内毒素检测；(1)、内毒素工作标准品为15eu/支；(2)、鲎试剂灵敏度λ＝0.25eu/ml，0.5ml/管(3)、内毒素标准品稀释：取内毒素标准品一支，分别用bet水按比例稀释成4λ和2λ的溶解，封口膜封口，震荡溶解15min；稀释时每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30s；(4)、加样：取鲎试剂若干支，每支加入bet水0.5ml溶解，分装至若干支无内毒素试管中，每管0.1ml。其中2支为阴性对照管，加入bet水0.1ml；2支为阳性对照管，加入2λ浓度的内毒素工作标准品溶液0.1ml；2支为样品阳性对照管，加入0.1ml含2λ内毒素标准品的样品溶液(稀释20倍的待测样品1ml+4λ的内毒素标准品溶液1ml＝2ml含2λ内毒素标准品的稀释40倍样品)。样品管中加入0.1ml样品，稀释比例见表4，37±1℃水浴(或培养箱)保温60±1min；表4内毒素稀释比例及对应内毒素含量(5)、octs-car-t细胞的内毒素检测结果(如表5所示)，所有细胞的内毒素含量均小于2.5eu/ml，符合《中华人民共和国药典》中小于10eu/ml的标准；表5二、支原体检测；(1)在实验前三日，细胞样品用无抗生素培养基进行培养；(2)收集1ml细胞悬浮液(细胞数大于1*105)，置于1.5ml离心管中；(3)13000g离心1min，收集沉淀，弃去培养基；(4)加入500ulpbs用枪头吹吸或涡旋振荡，重悬沉淀。13000g离心5min；(5)步骤4重复一次；(6)加入50μlcelllysisbuffer，用枪头吹吸，充分混匀后,在55℃水浴中孵育20min；(7)将样品置于95℃中加热5min；(8)13000g离心5min后，取5μl上清作为模板，25μlpcr反应体系为：ddh206.5μl、mycomix1μl、2xtaqplusmixmaster(dyeplus)12.5μl、模板5μl；pcr循环条件为：95℃30sec，(95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec)*30cycle，72℃5min。(9)支原体检测结果显示(如图8所示)，octs-car-t细胞中均不含支原体。三、octs基因转导效率检测及免疫分型检测；(1)收集经病毒转导后的t细胞，用含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重悬细胞并调整为1×106/ml。(2)向离心管中加入含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液1ml并混匀，350g离心5min，弃上清。(3)重复步骤2一次。(4)用0.2ml的含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重悬细胞，并向离心管中加入1ul的1mg/ulproteinl，5ulcd4-fitc，5ulcd8-apc，混匀，4℃孵育45min。(5)向离心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液并混匀，350g离心5min，弃上清。(6)重复步骤5两次。(7)用0.2ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重悬细胞，并向离心管中加入0.2ulpe-sa，混匀，37℃避光孵育15min。(8)向离心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重并混匀，350g离心5min，弃上清。(9)用1mld-pbs(-)溶液重悬细胞沉淀，350g离心5min，弃上清。(10)重复步骤9两次。(11)用0.4mld-pbs(-)溶液重悬细胞沉淀，流式细胞仪进行检测。(12)octs基因转导效率及免疫分型检测的检测结果如图9所示，制备的octs-car-t细胞的感染效率大多数位于30％～40％之间，cd4阳性细胞和cd8阳性细胞的比例位于1∶3～3∶1之间，可以进行后续功能检测。实施例3octs-car-t细胞的功能检测。一、靶细胞杀伤效果评估。(1)分别培养靶细胞[cd19+k562、cd20+k562、cd22+k562、cd30+k562、cd123+k562、cd19+cd123+k562、cd19+cd20+k562、cd19+cd22+k562、cd19+cd30+k562、k562细胞]和效应细胞[octs-car-t细胞]；(2)收集靶细胞4x105cells和octs-car-t细胞2.8x106cells，800g，6min离心，弃上清；(3)用1mld-pbs(-)溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，800g，6min离心，弃上清；(4)重复步骤3一次；(5)用700ul培养基(aim-v培养基+1～10％fbs)重悬效应细胞，用2ml培养基(aim-v培养基+1～10％fbs)重悬靶细胞；(6)设置效靶比为1∶1、5∶1、10∶1的实验孔，效应细胞分别与单靶细胞和双靶细胞共孵育的分组情况如表6所示，并设置对照组(k562细胞)，每组3个复孔；表6效应细胞靶细胞1靶细胞2靶细胞3octs12319s-car-tcd123+k562cd19+k562cd19+cd123+k562octs2219s-car-tcd22+k562cd19+k562cd19+cd22+k562octs2019s-car-tcd20+k562cd19+k562cd19+cd20+k562octs3019s-car-tcd30+k562cd19+k562cd19+cd30+k562octs12319t-car-tcd123+k562cd19+k562cd19+cd123+k562octs2219t-car-tcd22+k562cd19+k562cd19+cd22+k562octs2019t-car-tcd20+k562cd19+k562cd19+cd20+k562octs3019t-car-tcd30+k562cd19+k562cd19+cd30+k562(7)250g，5min平板离心；(8)37℃，5％co2培养箱中培养4小时；(9)250g，5min平板离心；(10)取每个孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液(避光操作)；(11)避光孵育25min；(12)每孔加入50ul终止液；(13)酶标仪检测490nm吸光度；(14)将3个复孔取平均值；将所有实验孔、靶细胞孔和效应细胞孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值；将靶细胞最大值的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值。(15)将步骤14中获得的经过校正的值带入下面公式，计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比。结果如图10所示，octs-car-t对各自的单靶细胞和双靶细胞均有较好的杀伤效果，turnocts结构的car-t细胞对靶细胞的杀伤效率略高于seriesocts结构的car-t细胞；杀伤效率＝(实验孔-效应细胞孔-靶细胞孔)/(靶细胞最大孔-靶细胞孔)x100％(16)上述实验结果表明，通过对传统car结构中抗原识别区的改造形成的octs结构，能够显著提高octs-car-t细胞识别并杀伤靶细胞的范围，因此octs-car-t细胞将在未来的cd19阳性/cd22阳性/cd20阳性/cd123阳性/cd30阳性/cd19、cd22双阳性/cd19、cd20双阳性/cd19、cd123双阳性/cd19、cd30双阳性的b淋巴细胞白血病、b淋巴瘤等恶性肿瘤的细胞治疗中发挥巨大的作用。序列表<110>上海优卡迪生物医药科技有限公司<120>一种基于octs技术的淋系白血病car-t治疗载体及其构建方法和应用<130>hj17-13348<160>45<170>patentinversion3.5<210>1<211>861<212>dna<213>人工序列<400>1atgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcct60gtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgca120cgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgcccc180gaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcc240cgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttg300gttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaatta360tgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatc420ggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgcctt480gatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatg540cctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagct600tcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgc660tcggcccttccggctggctggtttattgctgataaa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