水稻普通核不育系的创制方法和应用与流程

本发明属于水稻育种技术领域，具体涉及一种水稻普通核不育系的创制方法和应用。

背景技术：

水稻是全世界重要的粮食作物，世界上约有50％的人口以水稻为主食，大米也是加工许多食品的原材料。“三系法”和“两系法”是当前水稻杂交优势利用的主要途径，但是“三系法”的问题在于受严格的恢保关系制约，可以利用的亲本资源有限；“两系法”在制种安全性问题上存在较大的风险，限制了这两种途径全面开发水稻杂种优势的潜力。

普通核不育具有来源广泛、无恢保关系限制、败育彻底且育性不受环境影响、单隐性基因控制易于转育等特点，是理想的杂种优势利用资源，但普通核不育的繁殖问题是制约普通核不育发展的重要问题。水稻工程核不育体系的创制研究，建设“第三代杂交水稻”应用体系。“第三代杂交水稻”技术就是拟通过基因工程手段解决普通核不育的繁殖问题的技术方法。主要的技术方法有spt技术、工程核不育技术。“第三代杂交水稻”是基于普通核不育资源的一种杂种优势利用方式。杂种优势利用水平的提高，可以有更多的水稻资源被用于作为杂交稻的父母本，为选育高产、优质、高抗等综合性状优良的品种提供了更好的平台。

普通核不育资源主要来源于人工诱变和自然突变，属于非定向突变，然后从不定向的突变中，经过大量的筛选，获得具有感兴趣目的性状的材料。应用中遇到的问题是：构建“第三代杂交水稻”体系所需要的普通核不育资源，需要已经被基因克隆的普通核不育基因(即基础研究比较透彻的基因)在基因组层面上定点改变基因的表达，从而改变目的性状，这些突变体来源的材料通常不是育种家当前最期待直接利用的材料(基础研究的材料在生产中已经不是最好最新的材料)，所以要将这些材料用于生产中，还必须通过回交转育等方式，是一个耗时较长、工作量较大的一项工作。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种水稻普通核不育系的创制方法和应用，采用基因编辑的技术，让普通的可育材料，变成普通核不育系，再由普通核不育系通过杂交产生可持续恢复育性的方法，极大程度上拓宽了“第三代杂交水稻”不育系资源的来源。

为解决上述问题，一方面，本发明在于提供一种水稻普通核不育系的创制方法，其具体步骤如下：

1)通过基因编辑技术使水稻普通可育株系msms的育性基因表达水平降低或消失，获得水稻普通核不育材料，自交后获得含有不育性状且不含基因编辑载体的新的水稻普通核不育系msms；

2)构建工程核不育中间父本载体，将该载体导入水稻普通核不育系msms，获得转基因苗；种植转基因苗，收获t0代种子，种植t0代种子，获得t1代植株，pcr检测，以获得含有目的基因的拟可育中间父本材料，收获t1代种子；

3)种植t1代种子，pcr检测，获得不含筛选标记基因的可育中间父本材料msms^ms-l；

4)以水稻普通核不育系msms为母本，以可育中间父本材料msms^ms-l为父本，杂交，产生混合种子；

5)对混合种子进行荧光分选，分选出不含荧光的种子msms，实现水稻普通核不育系的繁殖，用于与可育恢复系水稻msms进行杂交制种，产生的f1代杂交种子msms，用于大田生产；分选出含荧光的种子msms^ms-l继续用于繁殖不含荧光的种子msms。

进一步地，本发明提供一种水稻普通核不育系的创制方法，所述步骤1)中，选择普通可育株系msms作为受体，利用基因编辑crispr-cas9的方法，定点突变普通可育株系msms的雄性不育基因的靶标序列，培育、测序、筛选，得到普通核不育株系msms。

更进一步地，本发明提供一种水稻普通核不育系的创制方法，步骤1)中所述靶标序列如seqidno.2所示。

进一步地，本发明提供一种水稻普通核不育系的创制方法，步骤2)所述的中间父本载体为包含可育基因和分选基因的水稻双元表达载体。

更进一步地，本发明提供一种水稻普通核不育系的创制方法，步骤2)所述的中间父本载体中包含的分选基因为红色荧光蛋白dsred。

进一步地，本发明提供一种水稻普通核不育系的创制方法，所述步骤1)中的育性基因为cyp703a3。

进一步地，本发明提供一种水稻普通核不育系的创制方法，所述步骤2)中构建工程核不育中间父本载体的过程如下：

以普通可育株系msms提取的基因组dna作为模板，设计并合成特异性引物：

9311gdnaf(其序列如seqidno.7所示)：gggatgggtgtttgactctg；

9311gdnar(其序列如seqidno.8所示)：cctgtgctcactcggaag；

扩增出如seqidno.9所示的大小为4429bp的基因组序列片段后，以该基因组序列片段构建“育性恢复基因-分选基因”的工程核不育中间父本载体。

进一步地，本发明提供一种水稻普通核不育系的创制方法，所述工程核不育中间父本载体构建过程为：通过in-fusion转化体系将扩增调控后如seqidno.9所示的dna片段插入到含有分选基因红色荧光蛋白dsred的载体中；获得水稻双元表达载体pcambia1300-dsred-cyp703a3，其基因序列如seqidno.10所示。

进一步地，本发明提供一种水稻普通核不育系的创制方法，所述拟可育中间父本材料创制过程如下：将水稻双元表达载体pcambia1300-dsred-cyp703a3导入根癌农杆菌中得到互补根癌农杆菌eha105转化体，通过与水稻普通核不育系msms的细胞或组织接触，从而使编码不育基因的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上，获得转基因苗；种植转基因苗，收获t0代种子，种植t0代种子，获得t1代植株，pcr检测，获得拟可育中间父本材料。

另一方面，本发明提供一种水稻普通核不育系的水稻双元表达载体，其核苷酸序列如seqidno.10所示。

另一方面，本发明提供一种本发明所述的水稻普通核不育系的创制方法用于水稻普通核不育系的育性恢复的应用。

本发明列举的雄性可育基因为cyp703a3基因，其碱基序列如seqidno.1所示。

cyp703a3的靶基因序列如seqidno.2所示，进行突变后得到如seqidno.3所示或如seqidno.4所示的突变序列基因cyp703a3-a。

进一步地，本发明列举的水稻品种为籼稻品种9311。

cyp703a3基因属于cytochromep450家族，基因功能非常保守，在所有水稻品种中都有这个基因，因此本发明所适用的范围为所有水稻品种。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供一种水稻普通核不育系的创制方法和应用，通过应用普通可育的育种材料创制为不育系，再由不育系与中间父本材料杂交，将混合种子通过分选基因表达性状分选后，得到大量不含转基因成分的不育系种子，实现了普通核不育系的繁殖。利用普通核不育系与恢复系制种，得到杂交种子，该育种程序简单，将生产中综合农艺性状优良的育种材料或品系直接创制为不育系，可以节省大量回交转育的时间(具体表现为将回交选育不育系的时间由3～5年缩短为6个月内)，且不改变受体材料其它背景基因，将普通核不育的不育性状快速导入可育材料中，大幅度的缩短育种周期。

本发明着眼点是在杂种优势的利用，利用雄性育性基因及其蛋白参与调控水稻雄性育性的特点，及利用转基因技术控制水稻雄性生殖发育，通过突变该蛋白序列或抑制该蛋白的表达产生新的水稻雄性不育株系，全面拓展不育系的材料范围，提升杂种优势的利用水平，为选育高产、优质、高抗等综合性状优良的品种提供了更好的技术方法，在农业生产上具有十分重要的应用。

本发明所获得的水稻突变体在营养期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后雄性生殖发育异常，花粉败育，得到完全不育的植株，在杂交水稻构建和农业生产上具有十分重要的应用。

附图说明

图1为水稻普通核不育系在水稻制种中的应用的杂交流程图；

图2为基因突变位点的图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等分子克隆：实验室手册(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

所述cyp703a3基因的核苷酸如seqidno.1所示序列，其编码的氨基酸如seqidno.11所示序列，其cds区如seqidno.12所示序列。

实施例1创制水稻普通核不育系cyp703a3-a

1.从已克隆的基因资源中，获得雄性不育基因序列

genebank上获得目的水稻雄性不育基因cyp703a3，其基因序列如seqidno.1所示；选取的靶序列如seqidno.2所示。

2.通过crispr-cas9的手段降低水稻品种中cyp703a3蛋白的表达水平

以普通可育材料(基因型为msms)籼稻9311作为受体，通过农杆菌eha105-bgko5的介导，利用常规的水稻转基因操作方法，在转基因群体中，选择表型为不育的单株，对靶标序列进行一代测序，得到不育单株cyp703a3-a(基因型为msms)。

为了对cyp703a3蛋白进行应用，构建了cyp703a3基因crispr-cas9的载体cyp703a3-bgko5(载体来自百格公司，货号bgko5)，并转化野生型9311植株，以降低cyp703a3蛋白的表达，从而达到将野生型水稻9311变成不育系的目的。

设计并合成cyp703a3突变位点检测引物：

cyp703a3crisprup(seqidno.5)：tgtgtggcggcgccggcgacgcactg

cyp703a3crisprdown(seqidno.6)：aaaccagtgcgtcgccggcgccgcca

对构建含有水稻cyp703a3基因靶序列的cyp703a3-bgko5质粒进行测序，测序正确确定构建成功。

将含有cyp703a3-bgko5质粒，转化成含cyp703a3-bgko5的根癌农杆菌在含有kan(50μg/μl)的yeb平板上划线，获的单菌落。挑单菌落接种到3ml含抗生素的yeb液体培养基中，于28℃振荡培养过夜，第2天按1％接种量转接入50ml含抗生素的yeb液体培养基中，200rpm继续振荡培养至od600为0.4至0.6左右后，将新鲜的根癌农杆菌菌液于5000rpm、离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的aam液体培养基中，此时获得可用于转化水稻各种受体的材料。

采用常规的根癌农杆菌转化方法转化籼稻品种9311的幼胚愈伤。取授粉后12-15天的籼稻品种9311未成熟种子经70％乙醇浸泡1分钟后，于次氯酸钠溶液中(与水1∶3混合，加2-3滴吐温20)消毒90分钟以上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和镊子挑出幼胚并转入到n6d2培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，4天后可用于转化。将幼胚愈伤浸泡入新鲜的aam根癌农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到n6d2c培养基上，于26℃共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮，使用浓度为100μm。3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入含有25mg/l潮霉素的选择培养基上进行选择培养。7-12天后将抗性愈伤组织转到含有50mg/lhyg的选择培养基上继续筛选。10-12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上培养一周左右，再移至分化培养基上分化(12小时光照/天)。再生的小苗在1/2ms0h培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室营养液栽培。

转化植株提取叶片总dna，利用cyp703a3突变位点检测引物，即cyp703a3crisprup(如seqidno.5所示)和cyp703a3crisprdown(如seqidno.6所示)，经pcr进一步鉴定转化植株。测序检测靶位点基因序列，如果发生纯合突变则为有效的基因敲除植株cyp703a3-a(基因型为msms)，得到水稻雄性不育系cyp703a3-a能实现完全不育。不育单株cyp703a3-a中两条同源染色体均发生了插入，一个插入碱基a，一个插入碱基g，不育单株为含两个不同的等位突变基因，后代表型一致为不育。具体如seqidno.3所示或如seqidno.4所示的核苷酸。如图2所示，在箭头所示位点插入了a碱基或g碱基。

3创制具有荧光分选基因的cyp703a3中间父本材料cyp703a3-b

构建工程核不育中间父本载体pcambia1300-dsred-cyp703a3，导入cyp703a3-a，转基因群体中选择可育株cyp703a3-b(基因型为msms^ms-l)。

从野生型9311幼苗叶片中提取基因组dna作为模板，设计并合成特异性引物：

9311gdnaf(其序列如seqidno.7所示)：gggatgggtgtttgactctg

9311gdnar(其序列如seqidno.8所示)：cctgtgctcactcggaag

扩增出如seqidno.9所示的大小为4429bp的基因组序列片段；

通过大连宝生物公司的in-fusion转化体系将扩增如seqidno.9所示的dna片段插入到含有分选基因红色荧光蛋白dsred的用于转化水稻双元载体pcambia1300-dsred中；测序验证正确，获得水稻双元表达载体pcambia1300-dsred-cyp703a3，其基因序列如seqidno.10所示；

将上述步骤所得载体通过电击导入根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105得到cyp703a3互补根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105转化体，使用遗传转化手段转化突变体cyp703a3-a营养生殖生长期的幼穗愈伤，从而使编码如seqidno.10所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上，获得转基因苗；种植转基因苗，收获t0代种子，种植t0代种子，获得t1代植株；pcr检测，以获得含有目的基因的拟可育单株材料，收获t1代种子；种植t1代种子，pcr检测，获得不含筛选标记基因的可育中间父本材料cyp703a3-b(基因型为msms^ms-l)。

4普通核不育系的创制及其繁殖方法

具体流程如图1所示。以不育单株获得的cyp703a3-a做母本，可育单株cyp703a3-b为父本，杂交，产生混合种子。

利用美亚光电定制的荧光色选机ak-1，对混合种子进行荧光分选，选择不含荧光的种子cyp703a3-a(基因型为msms)，实现了普通核不育cyp703a3-a的繁殖。

利用cyp703a3-a与恢复性(基因型为msms)杂交制种，生产f1代杂交种子，用于大田生产。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。