PGC‑1α基因过表达慢病毒载体、PGC‑1α慢病毒及构建方法和应用与流程

本发明属于分子生物学的技术领域，更具体地，涉及一种pgc-1α基因过表达慢病毒载体、pgc-1α慢病毒及构建方法和应用。

背景技术：

过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1(peroxisomeproliferator-activatedreceptor-γcoactivator-1alpha,pgc-1α)是一种多功能的辅激活因子，能够协同激活一些核受体和转录因子，在线粒体的生物合成、能量代谢、糖脂代谢等多条代谢通路中起作用。在小鼠模型，通过增益功能和功能缺失使pgc-1α在骨骼肌结构和功能上的生物学作用被逐步揭示，骨骼肌超表达pgc-1α的转基因小鼠中，快酵解型股肌和跖肌中ⅰ型肌纤维的含量增加；同时利用快慢肌纤维特异的启动子，发现pgc-1α作为钙调磷酸酶(calcineruin，can)信号通路的靶基因与肌细胞增强因子(myocyteenhancerfactor-2，mef2)蛋白协同激活慢肌纤维相关基因的转录。这些发现暗示，pgc-1α可能是调控肌纤维类型转换的关键因子并可以组合肌纤维转化过程的多条信号通路，但其调控肌纤维类型转化的具体机制仍有待进一步揭示。

通过分子技术，实现目的基因在宿主细胞中的过表达是研究该基因功能的一种重要手段。将外源基因导入真核细胞的方式有两种：瞬时转染与稳定转染。瞬时转染是将重组dna导入细胞以获得目的基因的暂时的表达，转染的dna不必整合进宿主的染色体；稳定或持久的转染能够将目的基因整合到基因组dna并指导适量蛋白合成，整合效率高，可使外源基因在宿主细胞中长期表达，具有更好的稳定性。相对于细胞系，原代细胞体外培养和转染难度均增加。目前尚无外源基因在鸡原代成肌细胞中可长效稳定表达的研究报道。

技术实现要素：

为解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种可用于转染鸡原代成肌细胞的pgc-1α基因过表达慢病毒载体、pgc-1α慢病毒及构建方法和应用。

本发明的技术技术方案如下：

本发明提供了一种pgc-1α基因过表达慢病毒载体，所述载体以慢病毒载体lv5为基础进行构建，并整合有鸡pgc-1α基因的cds序列，鸡pgc-1α基因的cds序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了一种pgc-1α基因过表达慢病毒载体的构建方法，该方法包括以下步骤：

(1)pcr扩增鸡pgc-1α基因的cds序列，得到pgc-1α基因片段；

(2)使用限制性内切酶酶切pgc-1α基因片段和慢病毒载体lv5，然后用连接酶连接酶切后的pgc-1α基因片段和慢病毒载体lv5，得到重组连接产物；

(3)将重组连接产物转化感受态细胞，并进行鉴定，鉴定为阳性结果且序列正确的为构建成功的pgc-1α基因过表达慢病毒载体。

进一步地，步骤(1)中，pcr扩增所用引物对序列如seqidno:2和seqidno:3所示。

进一步地，步骤(2)中，使用notⅰ和nsiⅰ限制性内切酶对pgc-1α基因片段和慢病毒载体lv5进行双酶切。

进一步地，步骤(2)中，使用t4dna连接酶连接酶切后的pgc-1α基因片段和慢病毒载体lv5。

进一步地，步骤(3)中的感受态细胞为大肠杆菌dh5α。

本发明还提供了一种pgc-1α慢病毒的构建方法，使用包装质粒对所述pgc-1α基因过表达慢病毒载体进行包装，通过共转染293t细胞，得到pgc-1α慢病毒。

进一步地，所述包装质粒为pgag/pol、prev和pvsv-g。

本发明还提供了一种应用所述pgc-1α慢病毒的构建方法构建得到的pgc-1α慢病毒。

本发明还提供了一种所述pgc-1α基因过表达慢病毒载体或所述的pgc-1α慢病毒在鸡成肌细胞中过表达pgc-1α基因研究中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了一种pgc-1α基因过表达慢病毒载体及pgc-1α慢病毒，其构建方法简单，阳性率高；pgc-1α慢病毒能够转染鸡成肌细胞，转染效率高，且可长效稳定在鸡原代成肌细胞中过表达pgc-1α基因。本发明的pgc-1α慢病毒转染入鸡成肌细胞中后，能显著促进鸡成肌细胞中慢肌肌球蛋白重链sm基因、生肌调节因子myod、myog基因以及骨骼肌特异性转录因子pax7基因的表达，同时显著抑制了快白肌肌球蛋白重链fwm基因的表达。

附图说明

图1是本发明实施例1中的慢病毒载体lv5的图谱；

图2是本发明实施例1中的pgc-1α基因过表达慢病毒载体的图谱。

图3是本发明实施例1中pgc-1α基因过表达慢病毒载体的酶切鉴定结果；

图4是本发明实施例4中荧光定量pcr检测鸡成肌细胞感染pgc-1α慢病毒后细胞中pgc-1α基因mrna含量；

图5是本发明实施例4中荧光定量pcr检测鸡成肌细胞感染pgc-1α慢病毒后细胞中sm基因mrna含量；

图6是本发明实施例4中荧光定量pcr检测鸡成肌细胞感染pgc-1α慢病毒后细胞中fwm基因mrna含量；

图7是本发明实施例4中荧光定量pcr检测鸡成肌细胞感染pgc-1α慢病毒后细胞中myod基因mrna含量；

图8是本发明实施例4中荧光定量pcr检测鸡成肌细胞感染pgc-1α慢病毒后细胞中myog基因mrna含量；

图9是本发明实施例4中荧光定量pcr检测鸡成肌细胞感染pgc-1α慢病毒后细胞中pax7基因mrna含量；

图10是本发明本发明实施例4中westernblot检测鸡成肌细胞感染pgc-1α慢病毒后细胞中pgc-1α基因的蛋白质表达含量。

具体实施方式

下面结合实施例和说明书附图对本发明进行详细地解释说明。

本发明提供了一种可用于转染鸡原代成肌细胞的pgc-1α基因过表达慢病毒载体，所述载体以慢病毒载体lv5为基础进行构建，并整合有鸡pgc-1α基因的cds序列，鸡pgc-1α基因的cds序列如seqidno.1所示。

慢病毒裁体lv5是基于hiv1构建的慢病毒基因过表达载体，采用efla启动子启动目的基因的表达。efla启动子来源于人类靶向延长因子la(efia)基因，可在多种细胞中稳走表达。载体中荧光gfp基因具有独立的启动子cmv。既保留了gfp的作用，也避免了融合标签蛋白对目的基因功能产生影响。慢病毒裁体lv5能够表达绿色荧光蛋白，能够准确追踪载体进入细胞内的位置，并且能够了解不同环境下pgc-1α基因的强弱表达，使pgc-1α基因基因研究更直观。

慢病毒裁体lv5能够连接重组连接鸡pgc-1α基因的cds序列(编码序列)，鸡pgc-1α基因的cds序列(seqidno.1)如下所示：

atggcgtgggacatgtgcaaccaggactctgtatggagtgacatcgagtgtgctgctctggttggtgaagaccagcctctttgcccagatctcccagaacttgacctctccgaactagacgtgaacgacctggatgcagacagcttcctgggggggctcaagtggtacagcgaccagtctgaggtcatctccagccagtacagcaatgagcctgccaacatctttgagaaaatagatgaagagaatgaggcaaacttgctagcagttctcactgagacactggacagcatccctgtggatgaggatggattgccttcatttgatgcactgacagatggagatgtgaccaatgaacatgacgccagcccttccccgatgcccgacggcacccctccgccccaggaggcagaagagccgtctctactcaagaagctcttgctggctccagccaacactcagctaaattacaatgaatgcagtggtctcagcacacaaaaccatgcgaacacaaatcacaggatcagaacaagccctgtggttgttaagactgagaattcgtggagcaataaagcgaagagcatttgtcaacaacaaaagccacaaagacgtccctgctctgaacttctcaaatatctgactacgaacgatgaccctcctcagaccaaaccagcagagaacaggaacagcagcaaagagaaatgcacctccaaaaggaagccccatctgcagtctcagacaaaccacctgcaagccaaaccaacaagtttatcacttccattgacacctgagtctccaaatgatcccaagggttccccatttgagaacaagactattgaacaaaccttaagtgtggaactctctggaactgcaggcctaactccacctacgacccctcctcataaagccaaccaagataatcctttcaggacttcacctaagccgaagtcatcatgcaagactgttgcaccaccttcaaaaaagccccgttatagtgagtcttccggttctcaaggaaacaaccctgtcaagaagggtccagaacagactgagctgtatgcacagcttagcaagactacagcactgtccagtggacatgaggagagaaagacaaaacggcccagtttgcggctgtttggtgaccatgactattgtcaatctgtgaattcaaagtcggaaatccacattaaaatatcccaggaacttcaggactccagacaactagaatttaaggattcttcacctgggtggcagtgtcagatttgttcttctctagaacaagaccagtatttcaagaaagagactttacagacaagtaagcagggatcccaaggtaataacagaaaacagctccaagaccaggaaattcgggctgaactgaataagcattttggtcaccccagccaagctgtttttgatgaagaagcagataagaccggtgaactaagggacagtgattacagtaatgaacaattttccaaactacctatgtttataaattcaggactagcaatggatggtctctttgatgacagtgaagatgaaagtgataaactatgctacccttgggatggcacacaatcctattcattatttgacgtatcgccttcttgctcttcttttaactctccatgcagagattcagtatctccacccaaatccttattttctcaaagatcccaaaggacacgctctagatcaaggtcctttcctcaacgcaggtcttgttcccgttctccatattcccgatcgagatcaaggtcaccctgtagtagatcctcttcaagatcttgtcactgttatgagtccagccactgtagacaccgagcacaccgaagttctccctcacgtgcaagatcgcgatccagatcaccgtacagtcgcagacccagatatgacagctatgaggaatatcagcatgaaaggctgaagagggaagaataccgcaaagagtatgaaaaacgggaatctgaaagggccaaacaaagggagagacagaggcagaaagcaattgaagagcgtcgtgtgatttacgtgggtaaaatcagacctgacacaacccgaaaagatctgagggaccggtttgaagtttttggtgaaatcgaggagtgcacagtaaatttgcgggatgatggagacagctatggtttcatcacctaccgctatacttgtgatgcctttgctgctcttgagaatggatacactttacgcaggtcaaacgagcctgactttgagctgtacttttgtggacgcaagcagttttgcaagtctaactatgcagacctagattcaaactcagatgattttgatcctgcttccactaaaagcaagtatgactccatggattttgatagtttacttaaagaggcacagcggagcctgcgcaggtaa

本发明还提供了一种用于转染鸡原代成肌细胞的pgc-1α基因过表达慢病毒载体的构建方法，该方法包括以下步骤：

(1)pcr扩增鸡pgc-1α基因的cds序列，得到pgc-1α基因片段；

(2)使用限制性内切酶酶切pgc-1α基因片段和慢病毒载体lv5，然后用连接酶连接酶切后的pgc-1α基因片段和慢病毒载体lv5，得到重组连接产物；

(3)将重组连接产物转化感受态细胞，并进行鉴定，鉴定为阳性结果且序列正确的为构建成功的pgc-1α基因过表达慢病毒载体。

进一步地，步骤(1)中，pcr扩增所用引物对序列如seqidno:2和seqidno:3所示。

进一步地，根据权利要求2所述的pgc-1α基因过表达慢病毒载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，使用notⅰ和nsiⅰ限制性内切酶对pgc-1α基因片段和慢病毒载体lv5进行双酶切。

进一步地，步骤(2)中，使用t4dna连接酶连接酶切后的pgc-1α基因片段和慢病毒载体lv5。

进一步地，步骤(3)中的感受态细胞为大肠杆菌dh5α。

本发明还提供了一种可用于转染鸡原代成肌细胞的pgc-1α慢病毒的构建方法，使用包装质粒对所述pgc-1α基因过表达慢病毒载体进行包装，通过共转染293t细胞，得到pgc-1α慢病毒。

pgc-1α基因过表达慢病毒载体使用包装质粒进行包装后，能够转染293t细胞，且转染效率高。

进一步地，所述包装质粒为pgag/pol、prev和pvsv-g。

本发明还提供了一种应用所述pgc-1α慢病毒的构建方法构建得到的pgc-1α慢病毒。

本发明还提供了一种所述pgc-1α基因过表达慢病毒载体或所述pgc-1α慢病毒在鸡成肌细胞中过表达pgc-1α基因研究中的应用。

pgc-1α慢病毒能够转染鸡原代成肌细胞，转染效率高，且可长效稳定在鸡原代成肌细胞中过表达pgc-1α基因。与常用的鼠成肌细胞c2c12细胞系来说，pgc-1α慢病毒转染鸡原代成肌细胞，更能真实反映pgc-1α基因在鸡骨骼肌中过表达的体内的状态。

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。在描述本下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件、实验手册中的条件。

实施例1

pgc-1α基因过表达慢病毒载体(lv5-pgc-1α)的构建方法，包括以下步骤：

(1)根据genbank中登录的鸡pgc-1α基因序列号nm_001006457.1，人工合成鸡pgc-1α基因的cds序列，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

(2)根据鸡pgc-1α基因的cds序列，设计上下游引物，引物序列如下：

pgc-1α-f：

gcggccgcgccaccatggcgtgggacatgtgcaaccaggactctgtatggagtgac(含notⅰ酶切位点)

pgc-1α-r：

atgcatttacctgcgcaggctccgctgtgcctctttaagta(含nsiⅰ酶切位点)

(3)以人工合成的鸡pgc-1α基因的cds序列为模板，使用高保真pfudna聚合酶，通过上下游引物pgc-1α-f、pgc-1α-r进行pcr扩增，其反应体系和反应程序如下：

反应体系(50μl)：

反应程序：

(4)将上述pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察结果并回收pgc-1α基因片段；

(5)用notⅰ和nsiⅰ限制性内切酶分别对回收的pgc-1α基因片段和慢病毒载体lv5进行双酶切，37℃酶切2h，反应体系如下：

反应体系(50μl)：

(6)对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察结果并回收pgc-1α基因片段和线性化的慢病毒载体lv5；

(7)用t4dna连接酶将pgc-1α基因片段和线性化慢病毒载体lv5，22℃水浴连接2h，连接体系如下：

连接体系(20μl)：

(8)将重组连接产物转化感受态大肠杆菌dh5α：从-70℃中取出感受态大肠杆菌dh5α，冰上放置，待感受态大肠杆菌dh5α解冻后，加入10μl重组连接产物，轻柔混匀内容物，在冰上放置30min，42℃水浴热激90sec，快速将离心管转移到冰浴中，冷却3min，加入800μl不含抗生素的lb培养基，37℃震荡培养(150rpm)1h，取200μl涂布于含50μg/mlampicillinlb平板上，37℃培养16h。

(9)挑取数个菌落，抽提质粒并酶切鉴定挑出阳性克隆：从步骤(8)培养的平板上挑取4个单独、饱满的菌落，置于含有5ml(含50μg/mlampicillin)lb培养基的试管中，37℃震荡培养(200rpm)16h，用质粒小提试剂盒(天根生化，dp104-02)抽提质粒，将抽提的质粒用notⅰ和nsiⅰ限制性内切酶进行双酶切鉴定，酶切反应体系如下：

反应体系(10μl)：

37℃酶切1h，1％琼脂糖凝胶电泳，观察酶切条带，如附图3所示，鉴定正确的克隆即为阳性克隆。

(10)将阳性克隆对应的菌液，送生物公司测序，将测序结果与鸡pgc-1α基因的cds序列进行比对，比对正确的克隆即为构建成功的pgc-1α基因过表达慢病毒载体lv5-pgc-1α，pgc-1α基因过表达慢病毒载体lv5-pgc-1α的图谱如附图2所示。未整合的慢病毒载体的图谱如附图1所示。

实施例2

pgc-1α基因过表达慢病毒lv5-pgc-1α包装，按照上海吉玛制药技术有限公司提供的病毒包装说明书进行，具体包括以下步骤：

(1)用胰蛋白酶消化处于对数生长期的239t细胞，将5×10⁶个细胞悬液接种15cm培养皿，加入18ml含10％fbs的dmem培养液，混匀后置于37℃、5％co2培养箱过夜培养；

(2)转染混合物的制备：在5ml无菌离心管中加入1.5ml无血清dmem，将pgc-1α基因过表达慢病毒载体lv5-pgc-1α与包装质粒pgag/pol、prev和pvsv-g，总量为25μg，按7:5:5:3比例混匀加入，取另一支无菌的5ml离心管，加入1.5ml无血清dmem，再加入300μlrna-mate混匀，室温放置5min后将两管混合，室温放置20～25min；

(3)将15cm培养皿中的培养液换成8ml无血清的dmem，将转染混合物逐滴加入，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物，置于37℃、5％co2培养箱中温育4～6h；

(4)吸弃转染液，加入18ml含10％fbs的dmem培养液，37℃、5％co2培养箱继续培养72h；

(5)病毒收集：收集培养72h的转染293t细胞上清，4℃，4000rpm离心4min后，将离心管上清液用0.45μm过滤器过滤，4℃，20000rpm离心2h，将浓缩液收集分装至指形管中，-80℃保存；

(6)病毒滴度检测：用胰蛋白酶消化处于对数生长期的239t细胞，按3×10⁴个细胞/孔的浓度接种96孔板，37℃、5％co2培养箱24h，将上述步骤的病毒原液10μl，用10％fbs的dmem培养液10倍稀释3-5个梯度，吸去96孔板中的培养液，加入不同稀释度的病毒液，每孔100μl，每个梯度设3个重复，37℃、5％co2培养箱继续培养72h，荧光显微镜计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度。确保得到的病毒滴度不低于1×10⁸tu/ml。

实施例3

鸡成肌细胞的分离提取，具体包括以下步骤：

(1)用70％乙醇消毒11胚龄的鸡胚，在其钝端用镊柄敲开蛋壳，用无菌的镊子移去蛋壳帽，暴露出气室；

(2)换用干净的镊子，移去蛋壳膜，再次换用干净的镊子，轻夹鸡胚颈部，将鸡胚移入盛有无菌pbs缓冲液培养皿中；

(3)用干净的镊子去除鸡胚腿部皮肤，用剪刀将鸡胚腿部剪至另一个盛有5ml20％fbs的dmem培养皿中；

(4)仔细分离肌肉，去除骨骼等非肌肉组织；

(5)用剪刀尽量剪碎肌肉组织，将含有剪碎肌肉组织的培养液移入50ml离心管中，加至约20ml；

(6)在涡旋振荡器上高速震荡1min，静置，待较大的组织块沉淀后，吸取上清液，用200目尼龙膜过滤；

(7)用培养液重悬离心管内组织，重复步骤(6)；

(8)将过滤的培养液移入细胞培养皿中，置于37℃、5％co2培养箱中进行差速贴壁2次：培养40min后，将细胞上清液移入新的细胞培养皿中，继续置于37℃、5％co2培养箱培养40min；

(9)将细胞上清液移入新的细胞培养皿中，置于37℃、5％co2培养箱培养过夜；

(10)用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，计数后接种于细胞板中。

实施例4

pgc-1α基因过表达慢病毒lv5-pgc-1α转染鸡成肌细胞的方法，具体包括：

(1)感染预实验：待接种至96孔板的鸡成肌细胞达到50％汇合时，吸弃细胞上清，加入含不同梯度pgc-1α基因过表达慢病毒lv5-pgc-1α的培养基100μl，同时将空载体慢病毒lv5-nc感染的鸡成肌细胞以及未感染病毒的鸡成肌细胞c设为对照，每个病毒梯度重复3个孔，置于37℃、5％co2培养箱培养24h，更换新鲜培养基，继续培养培养48h后，观察荧光表达情况。确定pgc-1α基因过表达慢病毒lv5-pgc-1α和慢病毒空载体lv5-nc对照感染鸡成肌细胞的合适moi值；

(2)正式实验：待接种至六孔板的鸡成肌细胞达到50％汇合时，吸弃细胞上清，加入含有最适moi值的moi值培养基，同时设慢病毒空载体lv5-nc感染鸡成肌细胞以及未感染病毒的成肌细胞c为对照，每组设3个重复孔。分别收集感染后1、4、9天的细胞，用于测定pgc-1α基因、pax7基因、myod基因、myog基因、sm基因、fwm基因的mrna表达水平以及pgc-1α蛋白表达水平。如附图4-10所示，鸡成肌细胞过表达pgc-1α基因第1-9天时，过表达感染组(lv5-pgc-1α组)pgc-1αmrna表达显著高于空载体感染组(lv5-nc组)和未感染组(c组)；感染第9天时，过表达组pgc-1α蛋白表达量显著高于空载体组和未感染组；慢肌肌球蛋白重链sm基因、生肌调节因子myod、myog基因以及骨骼肌特异性转录因子pax7基因的mrna表达显著提高，快白肌肌球蛋白重链fwm基因mrna表达显著下调。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>江苏省家禽科学研究所

<120>pgc-1α基因过表达慢病毒载体、pgc-1α慢病毒及构建方法和应用

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2388

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atggcgtgggacatgtgcaaccaggactctgtatggagtgacatcgagtgtgctgctctg60

gttggtgaagaccagcctctttgcccagatctcccagaacttgacctctccgaactagac120

gtgaacgacctggatgcagacagcttcctgggggggctcaagtggtacagcgaccagtct180

gaggtcatctccagccagtacagcaatgagcctgccaacatctttgagaaaatagatgaa240

gagaatgaggcaaacttgctagcagttctcactgagacactggacagcatccctgtggat300

gaggatggattgccttcatttgatgcactgacagatggagatgtgaccaatgaacatgac360

gccagcccttccccgatgcccgacggcacccctccgccccaggaggcagaagagccgtct420

ctactcaagaagctcttgctggctccagccaacactcagctaaattacaatgaatgcagt480

ggtctcagcacacaaaaccatgcgaacacaaatcacaggatcagaacaagccctgtggtt540

gttaagactgagaattcgtggagcaataaagcgaagagcatttgtcaacaacaaaagcca600

caaagacgtccctgctctgaacttctcaaatatctgactacgaacgatgaccctcctcag660

accaaaccagcagagaacaggaacagcagcaaagagaaatgcacctccaaaaggaagccc720

catctgcagtctcagacaaaccacctgcaagccaaaccaacaagtttatcacttccattg780

acacctgagtctccaaatgatcccaagggttccccatttgagaacaagactattgaacaa840

accttaagtgtggaactctctggaactgcaggcctaactccacctacgacccctcctcat900

aaagccaaccaagataatcctttcaggacttcacctaagccgaagtcatcatgcaagact960

gttgcaccaccttcaaaaaagccccgttatagtgagtcttccggttctcaaggaaacaac1020

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tcccgatcgagatcaaggtcaccctgtagtagatcctcttcaagatcttgtcactgttat1800

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ctagattcaaactcagatgattttgatcctgcttccactaaaagcaagtatgactccatg2340

gattttgatagtttacttaaagaggcacagcggagcctgcgcaggtaa2388

<210>2

<211>56

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gcggccgcgccaccatggcgtgggacatgtgcaaccaggactctgtatggagtgac56

<210>3

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

atgcatttacctgcgcaggctccgctgtgcctctttaagta41