本发明涉及病毒载体的用途，特别是黄瓜花叶病毒弱毒力CMV载体在增强植物抗除草剂性能方面的应用。
背景技术：
：现有研究开发的植物病毒载体可分为三种用途：一是主要用于表达药用蛋白、抗体等；二是用于分析或利用外源基因功能；三是用于病毒诱导的基因沉默分析被沉默基因的功能。在病毒载体用于外源蛋白表达的研究方面，早期研究开发病毒载体的目的主要用于外源蛋白表达。利用植物病毒载体表达外源基因的方法主要有两种：一是在体外转录携带目的基因的侵染性cDNA克隆，将病毒基因组cDNA进行基因取代、插入融合等[14]，外源基因被加入后，便置于原核启动子下游，然后以其转录物RNA直接侵染植物或者用基因枪的方法将病毒载体转入植物中完成侵染，接种植物后病毒在寄主细胞内自主增殖进行外源基因的表达[15]；二是将侵染性病毒的基因组cDNA克隆插入到Act2、CaMV35S转录启动子等下游构建携带目的基因的侵染性重组病毒体，采用农杆菌转化法浸润接种植物，从而在寄主细胞内完成一系列转录、合成及装配过程，实现外源基因的表达过程。Marillonnet等在前人的基础上建立了农杆菌浸润接种技术，便使得病毒载体用于外源蛋白表达达到了一个令人满意的水平，使外源蛋白的表达又踏上了一个新台阶[16]。至今用于表达药用蛋白的主要病毒载体及表达的药用蛋白或抗原如下[13,17-18]：豇豆花叶病毒(cowpeamosaicvirus，CPMV)表达的口蹄疫病毒(FMDV)VP1抗原、人免疫缺陷病毒(HIV-1)gp41抗原、人鼻病毒(HRV-14)抗原、犬细小病毒(CPV)抗原、慢性肺炎病菌(Pseudomaeruginosa)外层腊蛋白F抗原、stahylococcusaureusD2domain肽、疟疾抗原、水貂肠炎病毒(MEV)抗原、对传染性肠胃炎病毒(TGEV)具有特异性小分子免疫蛋白(SIP)、乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)。TMV载体表达的有血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、流感病毒血凝素、人免疫缺损病毒(HIV-1)抗原、疟疾抗原、鼠带状疮疹ZP3糖蛋白、口蹄疫病毒(FMDV)VP1抗原、α-天花粉蛋白、38C13鼠B细胞淋巴瘤单链抗体、肠癌病毒单抗、口蹄疫病毒(FMDV)VP1、牛孢疹病毒I型(BHV-1)gDC、猪传染性腹泻病毒(PEDV)中和表位；TBSV表达的人免疫缺损病毒(HIV-1)V3环抗原、犬细小病毒(CPV)抗原；PVX载体表达的有人免疫缺损病毒(HIV-1)gp41抗原、轮状病毒VP6抗原、人类乳突病毒16(HPV-16)E7蛋白抗原、人乳铁蛋白N叶、人粒细胞巨噬细胞集落剌激因子(GM-CSF)、肺结核抗原ESAT-6；ALMV载体表达的有呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白抗原；PPV病毒载体表达的兔出血热病毒(RHDV)VP60抗原；三叶草黄脉病毒Cloveryellowveinvirus(ClYVV)载体表达可溶性甲烷单加氧酶C亚单位(sMMO-C)；CMV载体表达的aFGF蛋白等。在病毒载体用于分析或利用外源基因功能方面，植物病毒载体除了用于表达疫苗抗原、抗体和药用蛋白生产外，还可用于表达外源基因，分析基因功能，分析外源蛋白与植物中蛋白质的相互作用。例如，含番茄叶霉病菌avr9无毒基因的PVX重组表达载体通过农杆菌浸润接种带有抗病(R)基因cf-9的番茄植株叶，番茄植株会发生过敏反应，表明R基因表达的产物可与avr9基因产物发生了直接的相互作用[18]。植物病毒载体也可用于植物利用外源基因的功能。Shen等[19]将抗除草剂草丁膦的基因Bar插入到双生病毒玉米线条病毒(MSV)中，再利用农杆菌介导的方法来侵染玉米，就能在玉米植株表达而出现抗除草剂的性状。但该病毒载体接种后仍保持原病毒的特性，对玉米植株依然产生致病性，因此没有用于生产实际中的前景。在病毒载体用于分析被沉默基因的功能方面，病毒介导的基因沉默(VIGS)是根据植物对RNA病毒独特的防御机制发展而来的一种技术，因其操作简便、效率高、周期短、避免植物转化、克服基因重复等特点，可以在不同的遗传背景下工作，对基因的分析更清楚，渐渐成为了研究植物基因功能的一种有效方法。在正向遗传学及反向遗传学发现和鉴定基因功能的研究方面发挥着重要的作用，越来越多的植物病毒被改造成有效的沉默载体，在植物生长发育、抗逆、信号转导等功能研究方面取得了显著的进展[20]。1997年，VanKammen等[21]最早对VIGS进行了定义，最初的意义是用来描述植物收病毒侵染后产生的症状恢复现象。后来，VIGS专指利用重组病毒载体携带外源基因侵染植物后，随着病毒的复制和移动特异性的诱导植物沉默自身内源基因的一种现象[22,23]。1995年，Kumagai[24]等人，以烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)为载体进行改造，他在TMV中插入了一段从烟草cDNA反转录出来的(phytoenedesaturase,PDS)序列,利用这个携带PDS序列的病毒载体侵染烟草后，植物出现系统性褪绿的光漂白现象，同时PDS的mRNA水平也出现显著性降低。结果说明植物出现漂白现象是由于PDS表达水平下降导致的，而PDS是类胡萝卜素合成过程中的关键酶，对植物有着光保护作用。1998年，Ruiz等[25]采用PVX马铃薯X病毒(PotatoXvirus)载体携带PDS的序列的方法，也引发植物出现了相同的光漂白现象。后来，人们利用改造的VIGS载体对植物进行目的性的基因沉默，抑制内源基因的表达，从而达到研究植物基因功能的作用。1998年，Kjemtrup等[26]利用双生病毒科的番茄金色花叶病毒(STMV)为VIGS载体插入镁离子螯合酶(magnesiumchelatase)的关键基Su(Sulfur)和转荧光蛋白基因luc(luciferase)，从而引起了植物出现叶片黄化和转luc植物不再发出荧光的表型。2001年，Ratcliff等[27]，报道了以烟草脆裂病毒TRV构建的VIGS载体，相比于PVX、TMV、TGMV有许多优点，其中TRV的VIGS载体相比于PVX对植物的症状影响较轻，并且在沉默效率、侵染范围、持久性方面都比PVX更加完善。2002年，Liu等[28]利用烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)在番茄中进行了VIGS试验，可以对已经公布的番茄EST文库进行功能研究分析。目前，TRV是应用范围最广的VIGS病毒载体，不仅其诱导植物的沉默效率高，而且更容易诱导分生组织的基因沉默，目前在烟草、番茄等茄科植物中均有大量的报道。TRV载体目前有3个版本，最初由Ratcliff等[27]构建的版本，Liu等[29]的pYL156、pYL279修改版本、以及Valentine等[30]构建的TRV-2b版本。其中，Liu等[29]的pYL156和pYL279版本，为了使病毒大量的在植株内扩增，该病毒还加入了2个35S启动子，并且在C端还加入了核酶。而TRV-2b的版本病毒载体中含有TRVRNA2中的2b序列。目前,TRV的病毒载体已在番茄、烟草、棉花(Gossypiumspp.)、牵牛花[31]、拟南芥和罂粟(opiumpoppy)[32]等多种植物上被应用。2002年，Holzberg等[33]利用大麦条纹花叶病毒BSMV携带PDS片段，成功引起了大麦的白化现象，抑制了大麦PDS基因的表达，这是首次利用VIGS载体在单子叶植物上实现了基因沉默。2006年，Ding等[34]用雀麦花叶病毒(Bromemosaicvirus,BMV)进行改造，同样成功的在水稻、玉米等单子叶植物中完成了对基因沉默的研究。但现有病毒载体由于对寄主植物本身具有致病作用，因而不能用于表达抗重金属基因增强植物的抗重金属性能。上文涉及的参考文献具体如下：[14]CholtofHB,ScholtofKB,JacksonAO.Plantvirusgenevectorsfortransientexpressionofforeignproteinsinplants[J].AnnuRevPhytopath,1994,34:299-323(CholtofHB,ScholtofKB,JacksonAO.用于在植物中外源蛋白的瞬时表达的植物病毒载体.植物病理学年评，1994,34:299-323)。[15]李成伟,王来,裴东丽,等.植物病毒载体系统的研究及应用[J].现代农业科技,2008,(15):131-134。[16]MarillonnetS,ThoeringerC,KandziaR.SystemicArgobacteriumtumefaciens-mediatedtransfectionofviralrepliconsforefficienttransientexpressioninplants.[J].NatBiotechnol,2005,23:718-723(MarillonnetS,ThoeringerC,KandziaR.用于在植物中有效瞬时表达的病毒复制的系统性农杆菌转染.自然-生物技术，2005,23:718-723)。[17]MatsuoK,HongJS,TabayashiN,ItoA,MasutaC,MatsumuraT.DevelopmentofCucumbermosaicvirusasavectormodifiablefordifferenthostspeciestoproducetherapeuticproteins.Planta,2007,225:277–286(MatsuoK1,HongJS,TabayashiN,ItoA,MasutaC,MatsumuraT.黄瓜花叶病毒作为一个可用于不同寄主物种的载体生产治疗性蛋白.植物学，2007,225:277–286)。[18]Ammond-KosackKE,StaskawiczBJ,JonesJD,etal.FunctionalexpressionofafungalavirulencegenefromamodifiedpotatovirusXgenome[J].MolPlantMicrobeInteract,1995,8:181-185(Ammond-KosackKE,StaskawiczBJ,JonesJD,etal.采用一个改造的马铃薯X病毒基因组对真菌一个毒力基因的功能表达.分子植物与分子微生物互作，1995,8:181-185)。[19]ShenWH,HohnB.Vectorsbasedonmaizestreakviruscanreplicatetohighcopynumbersinmaizeplants[J].J.Gen.Virol.,1995,76(4):965-978(ShenWH,HohnB.玉米线条病毒载体在玉米植物中能高含量复制.普通病毒学杂志，1995,76(4):965-978)。[20]昌军,钱亚娟,李正和,等.病毒诱导的基因沉默及其在植物功能基因组研究中的应用[J].中国科学:生命科学,2012,42(1):3-15。[21]VanKammenA.Virus-inducedgenesilencingininfectedandtransgenicplants[J].TrendsinPlantScience,1997,2(11):409-411(VanKammenA.在侵染和转基因植物中病毒诱导的基因沉默.植物科学趋势，1997,2(11):409-411)。[22]BaulcombeDC.Fastforwardgeneticsbasedonvirus-inducedgenesilencing[J].Currentopinioninplantbiology,1999,2(2):109-113(BaulcombeDC.以病毒诱导的基因沉默为基础的快速正向遗传学.植物生物学最新观点，1999,2(2):109-113)。[23]Senthil-KumarM,MysoreKS.NewdimensionsforVIGSinplantfunctionalgenomics[J].Trendsinplantscience,2011,16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pCB-CMVF209no2b-PvSR2导入植株后，能显著增强植物对目标重金属的抗性。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。本发明的总体方案为：1、改造病毒CMV成缺失2b基因序列的弱病毒表达载体；即，将已构建好的病毒CMV侵染性克隆质粒之一pCB-CMVF209采用酶切的方法改造，使2b基因缺失，并加入酶切位点，构建成为弱毒力的病毒表达载体；具体包括如下步骤：(1)以CMV序列为模板，设计加正、反向引物。加酶切位点NcoI的NcoIF2:CATGCcatggctgagtttgcctg；加酶切位点StuI的2aORF1R:gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttgg。以质粒pCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，以NcoI、StuI酶切PCR产物，纯化，备用。所述PCR扩增体系为：所述PCR扩增程序为：注：质粒pCB-CMVF209，是CMVF209序列的侵染性克隆，具体构建方法见中国农业科学2011,44(14):3060-3068。(2)选择StuI以及MluI、SpeI、ApaI、BamHI中至少1个酶切位点加入正向引物的5’，形如2bORF333F:TAGAAGGCCTGACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcggAACctccccttccgcatct；设计在5’加入AvrII酶切位点的反向引物2bAvrIIR:Cttccgaagaaacctaggag。以质粒pCB-CMVF209为模板，PCR扩增，纯化PCR产物，以StuI、AvrII酶切PCR产物，纯化，备用。所述PCR扩增体系为：所述PCR扩增程序为：(3)以NcoI、AvrII酶切质粒pCB-CMVF209，备用。(4)采用T4-DNA连接酶试剂盒将步骤(1)、步骤(2)的酶切的PCR产物同时与步骤(3)所得的酶切的质粒产物连接，转化大肠杆菌感受态DH5a。(5)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用NcoI、AvrII酶切鉴定和(或)PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，得到构建正确的质粒pCB-CMVF209-no2b，保存备用。2、将抗重金属基因编码区(ORF，应小于700bp)序列插入弱病毒载体构建重组病毒表达载体。具体地：(1)、以抗重金属基因编码区(ORF)序列为基础，设计加酶切位点StuI或MluI或SpeI或ApaI或BamHI的正向引物，加酶切位点MluI或SpeI或ApaI或BamHI或SacII的反向引物(但反向引物所加酶切位点必须是在正向引物所加的酶切位点的后一个酶切位点)；以含目的基因的质粒(例如pMD18-gene，质粒pMD18-gene构建：由NCBI库中可查得目的基因序列，由基因合成公司合成，构建成质粒pMD18-gene；或者由目的该基因的来源植物或微生物通过Trizol法提取总RNA，按RT-PCR试剂盒说明书，以目的基因的正向引物和反向引物做RT-PCR获得，然后按pMD18载体使用说明书操作构建成质粒pMD18-gene)或总RNA的反转录产物为模板，PCR扩增目的基因，酶切PCR产物，纯化，备用。所述PCR扩增体系和程序为：所述PCR扩增程序同一述1.(2)的程序。(2)以与2.(1)相同的酶酶切质粒pCB-CMVF209-no2b，备用。(3)采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠杆菌感受态DH5a。(4)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用与2.(1)相同的酶酶切鉴定，并进行PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，得到构建正确的质粒pCB-CMVF209no2b-gene，保存备用。3、采用公知方法，将含抗重金属基因ORF的重组弱病毒表达载体pCB-CMVF209no2b-gene转化农杆菌GV3101。4、质粒农杆菌浸润法将pCB-CMVF209no2b-gene、pCB-CMVF109、pCB-CMV309(pCB-CMVF109、pCB-CMV309具体构建方法见中国农业科学2011,44(14):3060-3068)质粒农杆菌混合浸润接种(公知方法)4-6叶龄烟草植物苗叶。5、接种苗室温培养5-8天后，即可按常规苗管理。6、对接种后10天左右的烟草植株钵土均匀浇施重金属镉(Cd)。用CdCl2配置成Cd2+浓度为10mg/L的水溶液，将50ml镉离子水溶液均匀浇于烟草种植的钵土(均匀浇施于土壤，使其慢慢渗透，折算成土为2.5mg/kg土)。施镉15天后进行采集烟草叶子(全量)于烘干箱中进行烘干，65℃烘干至恒重后进行重金属镉离子含量检测。实施例1、1、改造病毒CMV成缺失2b基因序列的弱病毒表达载体；具体包括如下步骤：(1)以CMV序列为模板设计正、反向引物。加酶切位点NcoI的NcoIF2:CATGCcatggctgagtttgcctg；加酶切位点StuI的2aORF1R:gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttgg。以质粒pCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，以NcoI、StuI酶切PCR产物，纯化，备用。所述PCR扩增体系为：所述PCR扩增程序为：注：质粒pCB-CMVF209，是CMVF209序列的侵染性克隆，具体构建方法见中国农业科学2011,44(14):3060-3068。(2)设计加酶切位点StuI、MluI、BamHI的正向引物2bORF333F:TAGAAGGCCTGACGCGTGACTAGTGGATCCAACctccccttccgcatct；反向引物2bAvrIIR:Cttccgaagaaacctaggag。以质粒pCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，以StuI、AvrII酶切PCR产物，纯化，备用。所述PCR扩增体系为：所述PCR扩增程序为：(3)以NcoI、AvrII酶切质粒pCB-CMVF209，备用。(4)采用T4-DNA连接酶试剂盒将步骤(1)、步骤(2)的酶切PCR产物同时与步骤(3)所得的酶切质粒的产物连接，转化大肠杆菌感受态DH5a。(5)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用NcoI、AvrII酶切鉴定和PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，将构建正确的质粒pCB-CMVF209-no2b保存备用。2、将抗重金属基因PvSR2(NCBIaccessnumber：U54704)编码区(ORF)序列插入弱病毒载体构建重组病毒表达载体；具体如下：(1)、设计加酶切位点MluI的正向引物MluPvSR2F:CGACGCGTATGCGTTGCGCCATCCTCT；加酶切位点BamHI的反向引物BamPvSR2R:CGGGATCCTCAATTTCCACTGAAGACTTTG。以含PvSR2基因的质粒pMD18-PvSR2(PvSR2基因序列从NCBI核酸库中accessnumber：U54704查得，经基因合成公司合成，构建成pMD18-PvSR2)为模板，PCR扩增合成目的基因序列，纯化，以MluI、BamHI酶切PCR产物，纯化，备用。所述PCR扩增体系为：所述PCR扩增程序为：(2)以MluI、BamHI酶切质粒pCB-CMVF209-no2b，备用。(3)采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠杆菌感受态DH5a。(4)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用MluI、BamHI酶切鉴定和PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，得到构建正确的质粒pCB-CMVF209no2b-PvSR2保存备用。3、将含PvSR2基因的重组弱病毒表达载体pCB-CMVF209no2b-PvSR2转化农杆菌GV3101，具体方法是公知方法。4、质粒农杆菌浸润法将pCB-CMVF209no2b-PvSR2、pCB-CMVF109、pCB-CMV309(pCB-CMVF109、pCB-CMV309具体构建方法见中国农业科学2011,44(14):3060-3068)质粒农杆菌混合浸润接种4-6叶龄烟草植物苗叶，具体方法是公知方法。5、接种苗室温培养5-8天后，即可按常规苗管理。6、对接种后10天左右的烟草植株钵土均匀浇施重金属镉(Cd)。用CdCl2配置成Cd2+浓度为10mg/L的水溶液，将50ml镉离子水溶液均匀浇于烟草种植的钵土(均匀浇施于土壤，使其慢慢渗透，折算成土为2.5mg/kg土)。施镉15天后进行采集烟草叶子(全量)于烘干箱中进行烘干，65℃烘干至恒重后进行重金属镉离子含量检测。检测结果如表1所述。实施例2、1、改造病毒CMV成缺失2b基因序列的弱病毒表达载体。(1)以CMV序列为模板设计正、反向引物。加酶切位点NcoI的NcoIF2:CATGCcatggctgagtttgcctg；加酶切位点StuI的2aORF1R:gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttg。以质粒pCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，以NcoI、StuI酶切PCR产物，纯化，备用。(2)设计加酶切位点StuI、SpeI、ApaI、BamHI的正向引物2bORF333F:GAAGGCCTGGACTAGTgggcccGGGATCCAACctccccttccgcatct；反向引物2bAvrIIR:Cttccgaagaaacctaggag。以质粒pCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，以StuI、AvrII酶切PCR产物，纯化，备用。(3)以NcoI、AvrII酶切质粒pCB-CMVF209，备用。(4)采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠杆菌感受态DH5a。(5)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用NcoI、AvrII酶切鉴定和PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，得到构建正确的质粒pCB-CMVF209-no2b，保存备用。2、将抗重金属基因PvSR2编码区(ORF)序列插入弱病毒载体构建重组病毒表达载体。具体地：(1)、设计加酶切位点SpeI的正向引物SpePvSR2F:gactagtATGCGTTGCGCCATCCTCT；加酶切位点BamHI的反向引物BamPvSR2R:CGGGATCCTCAATTTCCACTGAAGACTTTG。以质粒pMD18-PvSR2为模板，PCR扩增合成PCR产物，以SpeI、BamHI酶切PCR产物，纯化，备用。所述PCR扩增体系为：备注说明：该PCR扩增程序同实施例1步骤2的(1)。(2)以SpeI、BamHI酶切质粒pCB-CMVF209-no2b，备用。(3)采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠杆菌感受态DH5a。(4)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用SpeI、BamHI酶切鉴定和PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，得到构建正确的质粒pCB-CMVF209no2b-PvSR2，保存备用。3、采用常规方法，将含PvSR2基因的重组弱病毒表达载体pCB-CMVF209no2b-PvSR2转化农杆菌GV3101。4、质粒农杆菌浸润法将pCB-CMVF209no2b-PvSR2、pCB-CMVF109、pCB-CMV309质粒农杆菌混合浸润接种4-6叶龄植物苗叶。5、接种苗室温培养5-8天后，即可按常规苗管理。6、对接种后10天左右的烟草植株钵土均匀浇施重金属镉(Cd)。用CdCl2配置成Cd2+浓度为10mg/L的水溶液，将50ml镉离子水溶液均匀浇于烟草种植的钵土(均匀浇施于土壤，使其慢慢渗透，折算成土为2.5mg/kg土)。施镉15天后进行采集烟草叶子(全量)于烘干箱中进行烘干，65℃烘干至恒重后进行重金属镉离子含量检测。检测结果如表1所示。实施例3、1、改造病毒CMV成缺失2b基因序列的弱病毒表达载体。(1)以CMV序列为模板设计正、反向引物。加酶切位点NcoI的NcoIF2:CATGCcatggctgagtttgcctg；加酶切位点StuI的2aORF1R:gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttg。以质粒pCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成目的基因序列，纯化PCR产物，以NcoI、StuI酶切PCR产物，纯化，备用。(2)设计加酶切位点StuI、MluI、SpeI、ApaI、BamHI、SacII的正向引物2bORF333F:GAAGGCCTGACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcggAACctccccttccgcatct；反向引物2bAvrIIR:Cttccgaagaaacctaggag。以质粒pCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，以StuI、AvrII酶切PCR产物，纯化，备用。(3)以NcoI、AvrII酶切质粒pCB-CMVF209，备用。(4)采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠杆菌感受态DH5a。(5)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用NcoI、AvrII酶切鉴定和PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，将构建正确的质粒pCB-CMVF209-no2b保存备用。2、将抗重金属基因PvSR2编码区(ORF)序列插入弱病毒载体构建重组病毒表达载体。具体地：(1)、设计加酶切位点StuI的正向引物StuPvSR2F:aaggcctATGCGTTGCGCCATCCTCT；加酶切位点MluI的反向引物MluPvSR2R:cgAcgcgtTCAATTTCCACTGAAGACTTTG。以质粒pMD18-PvSR2为模板，PCR扩增合成PCR产物，以StuI、MluI酶切PCR产物，纯化，备用。所述PCR扩增体系为：备注说明：该PCR扩增程序同实施例1步骤2的(1)。(2)以StuI、MluI酶切质粒pCB-CMVF209-no2b，备用。(3)采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠杆菌感受态DH5a。(4)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用StuI、MluI酶切鉴定和PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，将构建正确的质粒pCB-CMVF209no2b-PvSR2保存备用。3、将含bar基因的重组弱病毒表达载体pCB-CMVF209no2b-PvSR2转化农杆菌GV3101，具体方法是公知方法。4、质粒农杆菌浸润法将pCB-CMVF209no2b-bar、pCB-CMVF109、pCB-CMV309质粒农杆菌混合浸润接种4-6叶龄植物苗叶，具体方法是公知方法。5、接种苗室温培养5-8天后，即可按常规苗管理。6、对接种后10天左右的烟草植株钵土均匀浇施重金属镉(Cd)。用CdCl2配置成Cd2+浓度为10mg/L的水溶液，将50ml镉离子水溶液均匀浇于烟草种植的钵土(均匀浇施于土壤，使其慢慢渗透，折算成土为2.5mg/kg土)。施镉15天后进行采集烟草叶子(全量)于烘干箱中进行烘干，65℃烘干至恒重后进行重金属镉离子含量检测。检测结果如表1所述。对照例1：1、4-6叶龄烟草植株，不接种任何液体，同样培养5-8天。2、用CdCl2配置成Cd2+浓度为10mg/L的水溶液，将50ml镉离子水溶液均匀浇于烟草种植的钵土(均匀浇施于土壤，使其慢慢渗透，折算成土为2.5mg/kg土)。施镉15天后进行采集烟草叶子(全量)于烘干箱中进行烘干，65℃烘干至恒重后进行重金属镉离子含量检测。检测结果如表1所述。对照例2:1、改造病毒CMV成缺失2b基因序列的弱病毒表达载体(同实施例1)。2、将抗除草剂基因bar(NCBIID：X05822)编码区(ORF)序列插入弱病毒载体构建重组病毒表达载体；具体如下：(1)、设计加酶切位点MluI的正向引物BarMluF:cgAcgcgtatgagcccagaacgacgcc；加酶切位点BamHI的反向引物BarBamR:CGggatcctcagatctcggtgacgggca。以含bar基因的质粒pMD18-bar(bar基因序列从NCBI核酸库中查得，经基因合成公司合成，构建成pMD18-bar)为模板，PCR扩增合成目的基因序列，纯化，以MluI、BamHI酶切PCR产物，纯化，备用。所述PCR扩增程序与上述步骤1(1)相同。(2)以MluI、BamHI酶切质粒pCB-CMVF209-no2b，备用。(3)采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠杆菌感受态DH5a。(4)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用MluI、BamHI酶切鉴定和PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，得到构建正确的质粒pCB-CMVF209no2b-bar保存备用。3、将含bar基因的重组弱病毒表达载体pCB-CMVF209no2b-bar转化农杆菌GV3101，具体方法是公知方法。4、质粒农杆菌浸润法将pCB-CMVF209no2b-bar、pCB-CMVF109、pCB-CMV309(pCB-CMVF109、pCB-CMV309具体构建方法见中国农业科学2011,44(14):3060-3068)质粒农杆菌混合，浸润接种(公知方法)4-6叶龄植物苗叶。5、接种苗室温培养5-8天后，即可按常规苗管理。6、对接种后10天左右的烟草植株钵土均匀浇施重金属镉(Cd)。用CdCl2配置成Cd2+浓度为10mg/L的水溶液，将50ml镉离子水溶液均匀浇于烟草种植的钵土(均匀浇施于土壤，使其慢慢渗透，折算成土为2.5mg/kg土)。施镉15天后进行采集烟草叶子(全量)于烘干箱中进行烘干，65℃烘干至恒重后进行重金属镉离子含量检测。检测结果如表1所述。对照例3：1、改造病毒CMV成缺失2b基因序列的弱病毒表达载体。(1)以CMV序列为模板设计正、反向引物。NcoIF2:CATGCcatggctgagtttgcctg；2aORF1R:gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttg。以质粒pCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，以NcoI、StuI酶切PCR产物，纯化，备用。(2)设计加酶切位点StuI、MluI、SpeI、ApaI、BamHI的正向引物2bORF333F:GAAGGCCTGACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcggAACctccccttccgcatct；反向引物2bAvrIIR:Cttccgaagaaacctaggag。以质粒pCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，以StuI、AvrII酶切PCR产物，纯化，备用。(3)以NcoI、AvrII酶切质粒pCB-CMVF209，备用。(4)采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠杆菌感受态DH5a。(5)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用NcoI、AvrII酶切鉴定和PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，将构建正确的质粒pCB-CMVF209-no2b保存备用。2、将弱病毒表达载体pCB-CMVF209no2b转化农杆菌GV3101，具体方法是公知方法。3、质粒农杆菌浸润法将pCB-CMVF209no2b、pCB-CMVF109、pCB-CMV309质粒农杆菌混合浸润接种4-6叶龄植物苗叶，具体方法是公知方法。4、接种苗室温培养5-8天后，即可按常规苗管理。5、对接种后10天左右的烟草植株钵土均匀浇施重金属镉(Cd)。用CdCl2配置成Cd2+浓度为10mg/L的水溶液，将50ml镉离子水溶液均匀浇于烟草种植的钵土(均匀浇施于土壤，使其慢慢渗透，折算成土为2.5mg/kg土)。施镉15天后进行采集烟草叶子(全量)于烘干箱中进行烘干，65℃烘干至恒重后进行重金属镉离子含量检测。检测结果如表1所述。表1、各处理的烟草植物镉含量检测结果处理Cd(mg/kg)实施例10.56实施例20.55实施例30.82对照例115.7对照例214.9对照例312.5最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。当前第1页1 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