通过过量表达PtGlim1a基因培育高木质素含量717杨树的方法与流程

本发明属于分子生物学和生物技术领域，更加具体的说，涉及一种通过过量表达PtGlim1a基因培育高木质素含量717杨树的方法。

背景技术：

木质素是地球上数量仅次于纤维素的有机物，林木中木质素占木材干重的15～36％，但是能为化工产业提供木质素原材料的植物并不多，而且随着化石能源的日益枯竭，木质素的需求量大大增加，木质素科学开始飞速发展。木质素的经济效益具有可持续发展性，而且成本较低，木质素及其衍生物具有多种功能，可作为分散剂、吸附剂/解吸剂、石油回收助剂、沥青乳化剂，木质素对人类可持续发展最为重大贡献就在于提供稳定、持续的有机物质来源，其应用前景十分广阔。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种通过过量表达PtGlim1a基因培育高木质素含量717杨树的方法。

本发明的技术方案概述如下：

通过过量表达PtGlim1a基因培育高木质素含量717杨树的方法，包括如下步骤：

(1)克隆杨树木质素合成基因PtGlim1a；所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；

(2)构建含有杨树木质素合成基因PtGlim1a的重组载体pK2GW7(I)_PtGlim1a；

(3)构建含表达载体pK2GW7(I)_PtGlim1a的农杆菌菌株；

(4)将步骤(3)的农杆菌菌株转化717杨树。

本发明的优点：

本发明将PtGlim1a序列插入至pK2GW7(I)载体，构建了pK2GW7(I)_PtGlim1a高效表达载体，通过农杆菌菌株(C58)导入到717杨树中，使717杨树自身PtGlim1a基因过量表达，从而得到了高木质素含量717杨树。高木质素含量的717杨树可应用到化工领域，用来制作混凝土减水剂、选矿浮选剂、冶炼矿粉粘结剂、耐火材料等，用木质素或木质素衍生物制作的材料污染小，回收效率高，安全系数大。717杨树对环境的适应性好，易种植成本低，可以为生产大规模的化工产品提供性质优良的原材料。

附图说明

图1是杨树木质素合成基因PtGlim1a克隆电泳示意图。

图2是包含本发明的杨树木质素合成基因PtGlim1a的表达载体pK2GW7(I)_PtGlim1a示意图。

图3是pK2GW7(I)_PtGlim1a转化农杆菌C58PCR筛选结果。

图4是PtGlim1a转基因717杨树半定量PCR结果。

图5是PtGlim1a转基因717杨树茎段切片结果。

图6是PtGlim1a转基因717杨树木质素含量测定结果。

具体实施方式

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

717杨树为欧洲山杨×银白杨(Populus tremula×P.alba INRA clone N717 1-B4，简称717杨树)。

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

杨树木质素合成基因PtGlim1a的克隆、超表达载体的构建及含超表达载体农杆菌的转化。

首先，以采一年生的毛果杨(Populus trichocarpa)为原料，利用基因克隆技术，获取杨树木质素合成基因PtGlim1a。

取一年生毛果杨(Populus trichocarpa)的形成层，使用植物RNeasy Plant Mini Kit(Trans gene Code#EP101-01 50rxns)提取total RNA，并且利用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(Trans gene Code#AE301-03 100rxns)去除基因组DNA干扰，反转录出cDNA。根据NCBI数据库中LIM基因的保守区设计引物SEQ ID No.3：5'-CATGGATCCTCTTCAAGGGAGAACAAGGA-3'和SEQ ID No.4：5'-CGGGAGCTCGCCATGTATGGTAGGAAGGA-3'然后利用RACE-PCR技术(Introgen,RLM-RACE Kit with Manual)获得杨树PtGlim1a基因全长cDNA序列，其具体步骤如下：

1)cDNA第一链的合成

用反转录试剂盒TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0，以毛果杨形成层总RNA为模板，Oligo(dT)为引物，在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA第一链，反转录体系如下：

反应条件：42℃60min，99℃5min。

2).杨树木质素合成基因PtGlim1a反转录质量PCR扩增检测

用杨树Actin基因特异引物SEQ ID No.5:5'–TGGTGACGCTGGTATGGTTA-3',SEQ ID No.6：5'-TCCTTCTTGTCCACGCTCTT-3'，PCR扩增，以验证反转录反应及RNA质量。PCR反应体系如下：

反应条件：94℃3min；94℃30s，40℃30s，72℃50s，35cycles；72℃5min。

3)杨树木质素合成基因PtGlim1a片段的PCR扩增

以cDNA为模板，以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示核苷酸为上下游引物，进行PCR反应。

反应体系如下：

PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，40℃30s，72℃60s，35cycles；72℃5min。PCR结束后，取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

对通过RACE技术扩增得到的杨树木质素合成基因PtGlim1a进行测序分析，得到完整的杨树木质素合成基因PtGlim1a全长为588bp(SEQ ID No.1)，见图1。

由杨树木质素合成基因PtGlim1a编码的蛋白质，是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

4)根据杨树木质素合成基因PtGlim1a核苷酸序列设计上下游引物用于PtGlim1a基因的半定量鉴定

SEQ ID No.7:5'-ATCCAGTCGTCAGCATCACT-3'

SEQ ID No.8:5'-GGTAGGAAGGACATGAAAAG-3'

构建超表达载体时，则分别在特异性引物的5’端添加Gateway系统重组位点，

SEQ ID No.9:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’,

SEQ ID No.10:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’

得到：

SEQ ID No.11:

5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATCCAGTCGTCAGCATCACT-3'

SEQ ID No.12:

5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGGTAGGAAGGACATGAAAAG-3'

5)attB-PCR产物的合成及纯化回收

PCR离心管中加入以下反应体系

PCR反应条件为:95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，90s；72℃，10min；4℃，∞。

PCR反应结束后，取1μL PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物的质量，其余用作产物的纯化回收。

6)构建含有杨树木质素合成基因PtGlim1a的重组载体

构建含有杨树木质素合成基因PtGlim1a的载体pJET1.2_PtGlim1a、pDONR201_PtGlim1a和表达载体pK2GW7(I)_PtGlim1a

pJET1.2:Thermo,Clone JET PCR Cloning Kit#K1231；pDONR201、pK2GW7(I)载体购于invitrogen；所用大肠杆菌为DH5a感受态细胞，TIANGEN,CB101-2。

胶回收纯化后的杨树木质素合成基因PtGlim1a目的片段利用CloneJET PCR Cloning Kit(pJET1.2:Thermo,Clone JET PCR Cloning Kit#K1231)重组到载体pJET1.2上，得到载体pJET1.2_PtGlim1a。

分别利用载体和目的片段的上下游引物(SEQ ID No.7和SEQ ID No.8)对同一个菌落进行菌落PCR双重验证，筛选阳性菌落测序。

提取测序正确菌液的质粒进行BP反应，得到载体pDONR201_PtGlim1a，筛选出阳性克隆进行测序。同样，提取测序正确菌的质粒进行LR反应，得到表达载体pK2GW7(I)-PtGlim1a(见图2)，筛选出阳性克隆。

在BP反应中，5’端、3’端分别含有attB1和attB2位点的PCR产物，与两端分别含有attP1和attP2位点的载体在BP克隆酶的催化下，通过同源重组生成含有目的基因的入门克隆；LR反应中，在LR克隆酶作用下，含有入门PCR产物的入门克隆与含有attR1和attR2序列的目的载体发生定向重组反应，生成带有目的PCR产物的表达载体。

注：本步骤使用的所有材料均购于invitrogen，包括Gateway BP onase II Enzyme Mix Lor:11789-020；Qty:20rxn)),Gateway LR Clonase II Enzyme Mix Lor:1356811；Qty:20rxn),

7)含有杨树木质素合成基因PtGlim1a的重组载体(pK2GW7(I)_PtGlim1a)转化农杆菌感受态细胞

实验所用的农杆菌菌株为C58(购于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，http://biovector.blog.163.com/)，C58具有利福平抗性(Rif)，辅助质粒具有庆大霉素抗性(Gen)。

利用电击农杆菌转化法，将含有杨树木质素合成基因PtGlim1a表达载体pK2GW7(I)_PtGlim1a转化到农杆菌株C58(pMP90)感受态细胞中，28℃，培养36h，菌落PCR挑选阳性克隆菌落(见图3：其中1为1号转基因阳性菌、2为2号转基因阳性菌、3为3号转基因阳性菌、4为4号转基因阳性菌、对照为pK2GW7(I)_PtGlim1a质粒对照)。

实施例2转化杨树

供阳性克隆菌转化的组培苗是717杨树。

(1)将717杨树腋芽或顶芽置于基本培养基上继代繁殖，培养6周获得组培苗；切取所述组培苗1cm不带腋芽的茎段，划伤口后于24℃黑暗条件下预培养3天；

(2)将选取的实施例1获得的阳性克隆菌菌液(OD₆₀₀＝0.8)在室温、4000rpm离心10min，弃去上清液，将沉淀用等体积的M液(M液：MS盐4.4g，蔗糖30g，生长素NAA 1.86mg，细胞分裂素2ip 1.02mg，乙酰丁香酮As 19.86mg，定容至1L，pH＝5.7)重悬，24℃，100rpm活化1h得到侵染液；按40个：25mL的比例将步骤(1)预培养的茎段放入所述侵染液中，24℃条件下100rpm侵染1h。经过共培养(M1固体培养基：MS盐4.4g，蔗糖30g，琼脂7.2g,生长素NAA 1.86mg，细胞分裂素2ip 1.02mg，乙酰丁香酮As 19.86mg，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：26℃，暗条件下共培养36小时)、延迟选择(CIM延迟选择培养基：MS盐4.4g，蔗糖30g，生长素NAA 1.86mg，细胞分裂素2ip 1.02mg，头孢霉素500mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：800Lux弱光下培养8天，光照/黑暗为16h/8h)、诱导不定芽(SIMa筛选培养基中：MS盐4.4g，蔗糖30g，细胞分裂素TDZ 0.05mg，头孢霉素500mg，卡那霉素500mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：26℃，2000Lux，光照/黑暗为16h/8h)、伸长培养(SEM筛选培养基：MS盐4.4g，蔗糖30g，细胞分裂素2ip 1.02mg，头孢霉素500mg，卡那霉素500mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：26℃，2000Lux光照，光照/黑暗为16h/8h，培养4周)、诱导生根(RM培养基的组成为：MS盐2.2g，蔗糖30g，头孢霉素500mg，，卡那霉素500mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：26℃，2000Lux光照，光照/黑暗为16h/8h)多步后，待再生杨树生长正常后，对每一棵独立转化子进行阳性鉴定。

鉴定结果(见图4：其中1为1号转基因阳性苗、2为2号转基因阳性苗、3为3号转基因阳性苗、4为4号转基因阳性苗、5为5号转基因阳性苗；对照1、对照2、对照3为三个平行的WT野生型对照。)

在PCR结果的电泳图中可以看出，转基因的效果很好，1‐5号转基因杨树苗的PtGlim1a基因条带比野生型对照条带亮且内源参照基因表达正常，说明1‐5号转基因杨树苗的内源PtGlim1a基因的表达量明显提高。3号条带相对较亮一些，选择3号转基因植物做后续实验。

(3)将生长2个月的长势均匀的转基因3号杨树移栽至土盆中，待土盆苗生长60d后，分别取植物的6,9,12节间做组织切片观察。待植物生长6个月后，对植物进行木质素含量的测定。

实施例3杨树茎段组织切片

(1)植物材料的固定

用锋利的刀片分别把需要固定的植物茎段切开，茎段长度约5mm，将茎段分别放入2mlEP管中，并加入适量的组织软化剂(组织软化剂：丙酮400μL，磷酸缓冲液5mL，加入去离子水定容至10mL)。将装有材料的EP管放入真空泵中，打开盖子，对其进行抽气直到材料沉入EP管的底部且很少有气泡冒出。然后更换成FAA固定液，在摇床上室温、100rmp过夜约12个小时。

(2)植物材料的包埋

准备若干1.5mL的EP管，用记号笔标好号，配制浓度为6％的琼脂糖凝胶，倒入之前准备好的1.5mL的EP管中，等胶不太烫但又不凝结时，将样品垂直的放入有琼脂糖凝胶的EP管中，调整角度，保证样品垂直与胶面，直至胶凝结。

(3)植物材料的切片

用刀片将包裹有植物材料的琼脂糖凝胶块进行适当的修整，使凝胶的低端尽量为一个平面，即尽可能的保持植物材料的垂直后进行切片。

(4).植物材料切片的染色

将切好的片子分别用事先配置的0.025％的甲苯胺蓝(0.025％的甲苯胺蓝染液0.0025g甲苯胺蓝粉末+10mL的蒸馏水)和盐酸-2％间苯三酚(2％间苯三酚染液2g间苯三酚+95％乙醇100mL)分别染色。

(5)显微镜拍照

将制作好的片子放在电子显微镜下观察拍照，并添加标尺。

通过半定量PCR选取表达水平高的独立转化株系3号(转基因3号杨树)进行植物组织切片观察(见图5：其中图5a为阳性苗茎段切片间苯三酚染色结果，图5b为野生型对照茎段切片间苯三酚染色结果；图5c阳性苗茎段切片自发荧光结果，图5d为野生型对照茎段切片自发荧光结果；)

对比图5a(转基因阳性苗)和图5b(野生型对照苗)、图5c(转基因阳性苗)和图5d(野生型对照苗)，从两组图中都可以看出转基因阳性苗木质部比野生型对照苗宽，说明通过转基因技术使PtGlim1a基因过量表达可以培育高木质素含量717杨树。(见图5)

注：本步骤所使用的切片机是振动切片机(leicaVT1000S)；显微镜是正置显微镜(ECLIPSE-50i)。

实施例4:木质素含量的分析

本实验所用的提取木质素的方法是：Klason木质素测定法，即硫酸法测定木质素含量。具体步骤如下：

(1)准备实验材料

将选出的转基因阳性苗选9株移栽到土盆里，6个月后挑选出长势较均一的3植株，去皮后将其放在30℃的烘箱中，直至彻底的将其烘干。

将烘干的样品在天平上称重后取约500g，全部放在不锈钢的粉碎机中，充分打磨直到所得的粉末能够大部分通过2mm的筛子。

精确的称取分别为1g(准确称量至0.0001g)的粉末三份，再称取三片定性滤纸的重量，标记。

(2)具体实验步骤操作

用滤纸将三分样品包好，并用细线扎紧，放入索式抽提器中，其高度不能超过索式抽提器内液体回流时管口的高度。

将苯醇混合液加入索式抽提器下面的烧瓶中，打开索氏提取器最下面加热套的开关，调节压力和温度：同时打开水龙头，使冷凝管中充满水，加热抽提8个小时(抽提液在管内循环的次数最好控制在每小时不低于4次)。

将样品取出在通风橱内风干，打开滤纸包，用洁净的毛刷将其转入螺口的20mL的大试管中，标号。

分别吸取3mL浓硫酸加入到3个试管中，用玻璃棒搅匀样品，拧紧试管的盖子，然后摇荡1min，保证样品能够全部的被浓硫酸所浸没。

将这三个大试管放入摇床中，30℃、150rmp，60分钟。

在摇床上摇60分钟后，取出，将试管内的混合物分别倒入三个200mL的锥形瓶中，将蒸馏水加入试管中，多润洗几遍，直到冲干净试管中的物质，最终加入的蒸馏水量为84mL，使浓硫酸的浓度稀释为3％。

然后将锥形瓶包好放入121℃的灭菌锅内，高压灭菌1个小时。

取出灭菌后的溶液，分别将其在真空过滤器中过滤，将所有的锥形瓶中的内容物全部的倒入真空过滤器上的漏斗中，漏斗内要垫入称好重量的定量滤纸，用蒸馏水充分的清洗锥形瓶，多润洗几次，直到锥形瓶内的所有残渣均被洗出。用蒸馏水洗涤后的洗液不能够呈现酸性为止，可以用10％氯化钡溶液检查洗液是否不再为酸性，即加入10％氯化钡溶液洗液却不出现浑浊，同时再用pH试纸检查，试纸边缘不呈酸性即可。

将带有过滤物的滤纸放在事先称好重量的坩埚内，放在105℃的烘箱内，烘干至恒重，约2个小时左右。

待坩埚冷却后称重，所得的重量即为木质素的重量。

(3)数据处理

木质素的提取实验做三次平行实验，每次实验中做三组平行测定，最后得到9组测定数据，对9组实验数据进行方差分析，排除系统误差和随机误差，得到转基因杨树苗的木质素含量。木质素含量测定结果(见图6)。