本发明涉及生物工程，尤其是涉及一种匹马霉素A菌株的基因工程改造方法。
背景技术：
匹马霉素的结构简单，化学性质稳定，是一种常用的多烯类抗生素，被广泛用作食品防腐添加剂、抗真菌兽药以及用于角膜炎治疗。在目前最常用的四种多烯类抗生素(匹马霉素、两性霉素B、制霉菌素和杀念菌素)中，匹马霉素的溶血毒性最低，但其抗真菌活性同样也相对较低。相对偏低的药理性质，严重限制了匹马霉素在临床中的应用价值。在前期的研究中，我们通过基因工程改造的方法，对匹马霉素生物合成基因簇中的P450单加氧酶基因pimG进行了失活，并成功从其发酵产物中鉴定得到了一种高效低毒的匹马霉素衍生物—匹马霉素A(12-脱羧-12甲基-匹马霉素)。经体外活性实验测定，匹马霉素A的活性是匹马霉素的2倍，而其毒性不足匹马霉素的1/4，是一种高效低毒的匹马霉素衍生物，具有良好的应用前景。
但是，P450单加氧酶基因pimG失活菌株QZ01除产生匹马霉素A外，还产生一种低毒的匹马霉素B(4,5-脱环氧-12-脱羧-12甲基-匹马霉素)及无活性的匹马霉素C(2-氢-3-羟基-4,5-脱环氧-12-脱羧-12甲基-匹马霉素)。前期实验中，我们通过替换PKS基因中的DH12KR12结构域构建了突变株QZ12，并成功消除了发酵产物中匹马霉素C的产生。但菌株QZ12发酵产物中匹马霉素B的存在仍限制了后续的分离纯化，而其相对较低的产量也限制了匹马霉素A的工业化生产。因此，通过基因工程改造的方法，进一步消除或降低菌株QZ12中低效低毒匹马霉素B的产生并进一步提高匹马霉素A的产量，将极大地推动匹马霉素A的工业化生产，具有重要的经济价值。体内及体外实验证实，匹马霉素B是匹马霉素A未发生C4-C5位环氧化的前体，因此，我们在QZ12菌株中尝试通过超量表达负责编码环氧化酶的基因pimD及其辅助基因pimF，降低或消除匹马霉素B的产生，并提高匹马霉素A的产量，进而达到优化产生菌株的目的。
技术实现要素：
本发明的目的，就是为了提高匹马霉素A的产量，提供一种匹马霉素A菌株的基因工程改造方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种匹马霉素A菌株的基因工程改造方法，是通过在菌株Streptomyces chattanoogensis QZ12中过表达后修饰基因pimD与pimF，实现了匹马霉素A产量的大幅度提高，并降低了匹马霉素B的产生。
所述pimD为P450单加氧酶基因，pimD基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
所述pimF为铁氧还蛋白基因，所编码的铁氧还蛋白为P450单加氧酶PimD的辅助蛋白，pimF基因序列如SEQ ID NO.2所示。
所述通过在菌株Streptomyces chattanoogensis QZ12中过表达后修饰基因pimD与pimF的构建步骤如下：
一、设计并构建用于基因pimD与pimF过表达的质粒I；
二、将第一步构建得到的质粒I接合转移导入受体菌株QZ12中；
三、通过对突变株的PCR验证及阿泊拉霉素抗性验证筛选得到过表达菌株QZ14。
步骤一中所述质粒I的构建方法是，在质粒pPM927的EcoRI位点依次插入两拷贝1.4kb测序确认的红霉素启动子控制下的基因pimD的PCR片段及0.4kb测序确认的红霉素启动子控制下的基因pimF的PCR片段。
采用本发明的方法，可以使后修饰基因pimD与pimF的转录水平分别提高10及7倍左右，进而提高匹马霉素B到匹马霉素A的转化，最终使匹马霉素A的产量提高了约107％，实验室摇瓶发酵水平达到746mg/L，极大推动了匹马霉素A的工业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，并给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或制造厂商的建议条件。
实施例
步骤一：整合型质粒I的构建
以菌株Streptomyces chattanoogensis QZ12的基因组DNA为模板，使用引物pimD-F/R、pimF-F/R，通过PCR扩增得到后修饰基因pimD与pimF，通过基因测序确认PCR片段的正确性；在质粒pPM927的EcoRI位点依次插入两个拷贝的红霉素启动子控制下的的pimD基因片段及单拷贝的红霉素启动子控制下的pimF基因片段(MunI/EcoRI酶切位点)；通过上述方法得到用于基因pimD与pimF过表达的质粒I。
上述步骤一中所用到的引物序列如表1所示：
表1
步骤二：将整合型质粒I通过接合转移的策略导入菌株QZ12，并筛选得到改造菌株QZ14。
将已构建完成用于基因过表达的质粒I转化进入大肠杆菌宿主E.coli ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取该转化子于含有氯霉素、卡那霉素和阿泊拉霉素三种抗生素的LB中于37℃过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按10％的比例转接一次并培养4h，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。于此同时制备菌株QZ12的新鲜孢子约109个，用TES溶液漂洗2～3次之后再用2mLTES溶液悬浮孢子，于50℃热激10min后，冷却至室温，等体积加入2×孢子预萌发培养液后于37℃培养2.5h，并用新鲜的LB溶液漂洗孢子2～3次。将预萌发的孢子与之前制备的大肠杆菌宿主菌E.coli ET12567混合(孢子和宿主菌的比例约为10:1)均匀后涂布于YMG平板，待平板吹干后转移至30℃培养箱正置培养17h后取出平板，分别取阿泊拉霉素和萘啶酮酸两种抗生素混匀于1mL无菌水中，覆盖于YMG平板上，将平板晾干后转移至30℃培养箱中培养。一般3～5天后可见平板上有单菌落接合子长出，通过菌丝体PCR验证和抗性验证的方法验证接合子正确，即得到改造菌株QZ14。
步骤三：改造菌株QZ14中基因pimD与pimF转录水平的测定
用于RNA提取的样品为发酵培养48h的菌丝体，其一般保存在Redzol溶液中。RNA提取过程要求低温，离心过程除特殊说明，均在4℃、12000rpm的条件下进行。取已经破碎处理的样品500μL加入100μL氯仿，涡旋振荡混匀，离心15min后吸取上清液，加入100μL无水乙醇并混匀后将样品吸入离心柱(赛百盛)中，静置2min，离心1min，弃液体，用漂洗液(Washing buffer，赛百盛)漂洗两次，弃液体，将离心柱置于收集管中继续离心2min。换用新的收集管，往离心柱中加入60μL DEPC处理过的水，离心2min，将RNA样品从离心柱上洗脱下来。用Nanodrop 2000型核酸蛋白分析仪测定RNA的浓度和OD260/280，提取后的RNA样品-80℃保存。RNA样品经DNase消化处理4h后，每个反应体系加入5μL 50mM EDTA后65℃加热10min即可终止消化，消化好的RNA样品-80℃保存。RNA经过逆转录后就得到cDNA，可用于后续的基因转录分析。
取cDNA样品用DEPC处理水稀释至合适的浓度，配制qRT-PCR体系(2×SYBR Green缓冲液10μL，引物20pmol，cDNA5μL，加DEPC水至体积20μL)，离心去掉溶液中的气泡之后使用ABI公司7500型快速RT-PCR仪测定样品Ct值。采用hrdB作为看家基因测定pimD与pimF的转录水平。收集的数据使用2-ΔΔCT法进行处理。一般对照组样品的基因转录水平设参比为1，实验组样品基因转录与之比较即得到实验组基因转录改变的倍数。
测定基因转录水平使用的引物如表2所示：
表2
改造菌株QZ14的后修饰基因pimD与pimF转录变化结果表明，在基因pimD与pimF过表达后，其转录水平较对照菌株分别有大约10倍与7倍的提高，基因pimD与pimF的转录量明显提高。
步骤四：改造菌株QZ14的发酵培养及其产量测定
种子培养基各组分质量体积比为葡萄糖1.75％、胰蛋白胨1.5％、氯化钠1.0％；发酵培养基各组分质量体积比为葡萄糖6.0％、酵母提取物0.7％、黄豆饼粉2.8％。按种子培养基及发酵培养配方，分别配制种子培养基及发酵培养基，并分装于250mL三棱瓶中，每瓶装50mL，115℃灭菌30min，将过表达菌株及对照菌株菌丝体接入上述种子培养基中，在220rpm转速、30℃，摇床培养24h得种子培养液。将种子培养液按10％接种量接入发酵培养基中，在220rpm转速、30℃，摇床培养5d。
使用Agilent公司的Agilent 1200系列HPLC进行色谱分析，采用DAD二极管阵列检测器测定303nm下的色谱吸收峰。色谱柱的参数为：Agilent TC-C18，5μm，4.6×250mm；流动相流速为1mL/min；流动相组成及其体积比为：67％的含0.1％甲酸(v/v)的水溶液和33％的HPLC级乙腈。柱温：35℃。
表3为出发菌株QZ12与改造菌株QZ14的发酵产量数据，结果表明，改造菌株QZ14中低效低毒匹马霉素B的产量降低了86％左右，而高效低毒匹马霉素A的产量提高了约107％，达到746mg/L，为匹马霉素A的工业化生产奠定了基础。
表3：出发菌株QZ12与改造菌株QZ14的发酵产量数据
—表示该菌株不产生这一类抗生素。