构建能表达阳性菌多糖的阴性菌的方法及其所得突变体与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种构建能表达革兰氏阳性菌多糖的革兰氏阴性菌的方法及一株能够产生革兰氏阳性菌多糖的革兰氏阴性菌突变体。

背景技术：

肺炎链球菌是导致婴幼儿和老年人罹患肺炎、脑膜炎、中耳炎等疾病的主要革兰氏阳性病原体之一，而其荚膜多糖由于可以诱导机体产生特异性抗体，该抗体能对肺炎链球菌感染提供血清型特异性保护，所以已被大量用于其疫苗的研发。而单纯的多糖疫苗存在提纯困难以及难以提供足够的免疫保护效力，所以有研究者利用蛋白嵌合多糖的方法来研究多糖疫苗，但效果仍不够显著。现阶段，有大量研究报道利用革兰氏阴性菌来表达多糖抗原取得了很好的效果，但利用革兰氏阴性菌例如大肠杆菌或者沙门氏菌等常用工程菌都是表达革兰氏阴性致病菌的多糖，若能够在革兰氏阴性菌中表达革兰氏阳性菌多糖，则是开创性的研究。

目前，尚未发现利用革兰氏阴性菌沙门氏菌来表达合成革兰氏阳性菌多糖的报道。

因此，本领域亟需寻求一种能使得革兰氏阴性菌表达革兰氏阳性菌多糖的方法，特别亟需可使得沙门氏菌表达肺炎链球菌荚膜多糖的方法及依据该方法所得的突变体。

技术实现要素：

针对现有技术的缺点，本发明要目的之一在于提供一种构建能表达革兰氏阳性菌多糖的革兰氏阴性菌的方法，该方法包括如下步骤：

将合成革兰氏阳性菌多糖的低拷贝表达质粒转化入缺失了asd以及rfbP基因的革兰氏阴性菌中，通过平衡致死系统筛选，得到能够产生革兰氏阳性菌多糖的革兰氏阴性菌；

所述革兰氏阳性细菌包括肺炎链球菌、A型链球菌、B型链球菌中的一种或多种；

所述革兰氏阴性菌包括鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌中的一种或多种。

本发明的发明人发现，通过对上述革兰氏阴性菌中本身的O抗原多糖进行敲除，再进行rfbP基因的缺失处理，可以阻断O抗原多糖的合成，并保留了WaaL多糖合成连接酶。通过该酶的连接作用，可以将革兰氏阳性菌的荚膜多糖连接至核心寡糖上，从而利用基因工程的方法使革兰氏阴性菌能够产生革兰氏阳性菌多糖。同时，本发明敲除了革兰氏阴性菌的asd基因，该基因编码天冬氨酸半醛脱氢酶(DAP)，与载体中DAP表达形成平衡致死系统互补，从而使该产生革兰氏阳性菌多糖的方法不含任何抗性标记。

所述革兰氏阴性菌为鼠伤寒沙门氏菌；所述革兰氏阳性菌多糖低拷贝表达质粒为肺炎链球菌荚膜多糖低拷贝表达质粒。所述肺炎链球菌荚膜多糖低拷贝表达质粒含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列或与SEQ ID No.1所示核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的核苷酸序列的低拷贝表达质粒，所述SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为革兰氏阳性菌肺炎链球菌6A血清型(Streptococcus pneumoniae 6A)荚膜多糖基因簇。

如本发明的实施例所示，利用本发明的方法，鼠伤寒沙门氏菌成功表达了肺炎链球菌荚膜多糖。

通过比较发现，在革兰氏阴性菌以及革兰氏阳性菌多糖合成途径中有类似的合成途径，都需要通过多糖合成酶将多糖连接至糖基座上。这为在革兰氏阴性菌中表达和产生革兰氏阳性菌多糖提供了理论基础。通过低拷贝表达质粒表达肺炎链球菌6A血清型的荚膜多糖全基因簇，再通过鼠伤寒沙门氏菌自身的WaaL连接酶将表达的多糖连接至沙门氏菌的核心寡糖上，通过这样的基因工程改造可以使沙门氏菌产生肺炎链球菌的荚膜多糖，为后续研究新颖的革兰氏阳性菌多糖疫苗提供了理论基础，也为多糖疫苗提供了一种高效的疫苗载体平台。

利用革兰氏阴性菌沙门氏菌来产生革兰氏阳性菌肺炎链球菌荚膜多糖具有以下特征：1、由于沙门氏菌遗传背景清晰并且遗传操作简便，可以在此基础上进行后续改造，从而构建更加精准高效的多糖递呈疫苗；2、由于沙门氏菌具有胞内寄生特性，是一种成熟的抗原递呈平台，能够刺激机体引起强烈的黏膜和体液免疫反应，可以成为高效的荚膜多糖递呈疫苗；3、此种由沙门氏菌产生的荚膜多糖疫苗易于培养，可以大大降低荚膜多糖疫苗生产成本；4、此种在革兰氏阴性菌中产生革兰氏阳性菌多糖的构建策略也可以用于其他肺炎链球菌血清型荚膜多糖的构建中，具有非常广泛的应用前景。

值得指出的是，本领域人员容易知晓，本发明方法并不局限于鼠伤寒沙门氏菌。本发明方法提到的大肠杆菌和志贺氏菌也为常见的革兰氏阴性致病菌，并且具有相似的脂多糖结构，均由内脂A、核心寡糖和O抗原叠加形成，通过类似的合成酶进行合成组装，所以本发明方法可以适用于大肠杆菌以及志贺氏菌，乃至其他多种革兰氏阴性细菌，尤其是具有药用、疫苗制备或其它有价值的物质生产的阴性细菌。

本发明所述的革兰氏阳性细菌可以为胞外多糖为致病因子或具有药用价值或食品价值的革兰氏阳性细菌，但不局限于此，只要其多糖具有实际用途的阳性菌均适用于本发明。

优选的，所述转化为电转化。

优选的，所述低拷贝表达质粒以pYA3337为质粒载体进行构建。

优选的，所述肺炎链球菌荚膜多糖低拷贝表达质粒的构建方法为：

1)引物设计

Vector-F：5’-AAGAAAATATTTGAATAACGCTCATGAGACAATAACCCT-3’

Vector-R：5’-ACTATTTTTCCATTCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTG-3’

6A-1F：5’-TCACACAGGAAACAGACCATGAATGGAAAAATAGTAAAG-3’

6A-1R：5’-TGTTTGAGACCTAATACTATC-3’

6A-2F：5’-TATAATGGTGAGCGATATTTG-3’

6A-2R：5’-GTTATTGTCTCATGAGCGTTATTCAAATATTTTCTTTCT-3’

2)提取处于对数生长期的肺炎链球菌DNA作为模板，分别利用6A-1F、6A-1R和6A-2F、6A-2R对其荚膜多糖的全长基因簇进行扩增，得到其扩增产物，同时利用引物Vector-F和Vector-R以模板质粒pYA3337进行扩增，得到其载体片段；

3)利用Gibson组装试剂盒对目的片段以及载体片段进行组装，并转入基因工程菌中，获得肺炎链球菌荚膜多糖的低拷贝表达质粒。

优选的，所述基因工程菌为TOP10大肠杆菌。

本发明的另一个目的在于提供由上述方法制备得到的能够产生革兰氏阳性菌多糖的革兰氏阴性菌突变体。

本发明的另一个目的在于提供一株能够产生革兰氏阳性菌肺炎链球菌6A血清型的荚膜多糖的鼠伤寒沙门氏菌Salmonella enterica serovar Typhimurium P0005突变体，所述突变体染色体DNA中缺失了asd以及rfbP基因，同时该突变体中存在含有含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列或与SEQ ID No.1所示核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的核苷酸序列的低拷贝表达质粒，所述SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为革兰氏阳性菌肺炎链球菌6A血清型(Streptococcus pneumoniae 6A)荚膜多糖基因簇；所述突变体的分类命名为Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium P0005，保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉市武昌珞珈山，武汉大学，邮编：430072)，保藏号为CCTCC NO：M 2016344，保藏时间为2016年6月23日。

该突变体开创性的通过革兰氏阴性菌产生革兰氏阳性菌多糖，可以作为一种高效的革兰氏阳性菌多糖疫苗载体以及新型多糖疫苗提供前提条件。

本发明的有益效果是：

1、本发明能使革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门氏菌中产生革兰氏阳性菌多糖；

2、由于鼠伤寒沙门氏菌已被成功用于疫苗载体，并且易于基因工程改造，本发明可以促进新颖的革兰氏阳性菌多糖疫苗的研发以及基于革兰氏阴性菌递呈的革兰氏阳性菌多糖疫苗应用研究；

3、本发明提供的产生革兰氏阳性菌多糖的方法，不含有任何抗性标记，符合后续疫苗研究的生物安全要求。

附图说明

图1：本发明方法示意图；

图2：表达天冬氨酸半醛脱氢酶(DAP)以及肺炎链球菌6A血清型荚膜多糖的低拷贝质粒pYA337-6A图谱；

图3：本发明构建的低拷贝表达质粒的鉴定结果，图中M：DNAmarkerⅢ1：肺炎链球菌6A血清型荚膜多糖全长基因簇扩增鉴定结果；2：肺炎链球菌6A血清型荚膜多糖基因簇半长扩增结果。

图4：产生肺炎链球菌6A血清型荚膜多糖的鼠伤寒沙门氏菌银染鉴定，图中1：含有肺炎链球菌6A血清型荚膜多糖表达质粒的鼠伤寒沙门氏菌突变体；2：含有空质粒的鼠伤寒沙门氏菌突变体；

图5：产生肺炎链球菌6A血清型荚膜多糖的鼠伤寒沙门氏菌免疫印迹验证，图中1：含有肺炎链球菌6A血清型荚膜多糖表达质粒的鼠伤寒沙门氏菌突变体；2：含有空质粒的鼠伤寒沙门氏菌突变体；

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

根据已报到的肺炎链球菌6A血清型荚膜多糖全基因簇株序列(参照GenBank序列号为GCA_001088685.1)设计两对具有重叠片段的PCR引物分别将全长为7267bp片段的全长基因簇分两段进行扩增，扩增片段大小分别为3420bp和3847bp，上述引物均由北京华大基因公司合成，引物序列如下：

6A-1F：5’-TCACACAGGAAACAGACCATGAATGGAAAAATAGTAAAG-3’

6A-1R：5’-TGTTTGAGACCTAATACTATC-3’

6A-2F：5’-TATAATGGTGAGCGATATTTG-3’

6A-2R：5’-GTTATTGTCTCATGAGCGTTATTCAAATATTTTCTTTCT-3’

同时需要以载体pYA3337为模板，设计一对具有重叠片段的PCR引物扩增载体片段，引物由北京华大基因公司合成，引物序列如下：

Vector-F：5’-AAGAAAATATTTGAATAACGCTCATGAGACAATAACCCT-3’

Vector-R：5’-ACTATTTTTCCATTCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTG-3’

质粒构建需要用到Gibson组装试剂盒(Gibson Assembly Master Mix,NEB)，通过在设计引物时在片段中加入overlap片段，从而片段能够通过重叠片段，并通过gibson组装酶连接成一个完整的质粒。具体步骤如下：将片段按照相同摩尔数比控制总体积在10微升加好反应体系，体系如下所示：

加好体系后在50摄氏度作用1小时，取2微升用电转化的方法将连接物转化入TOP10感受态细胞内，涂布于Kan平板上，放置与37℃待菌落长出后挑菌用全基因簇鉴定引物进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的菌落提取质粒转入鼠伤寒沙门氏菌后再次进行对其表达肺炎链球菌荚膜多糖的后续鉴定。鉴定结果证实构建的表达质粒是正确的，如说明书附图3所示，多糖表达质粒的质粒图谱如说明书附图图2所示。

煮沸裂解法制备肺炎链球菌的基因组DNA模板，挑取单菌落37℃过夜培养。取0.5ml菌液12000r/min离心3min，弃上清，收集菌体用超纯水洗一次，并重悬。放于沸水中煮10min，冷却过后12000r/min离心3min，以上清作为模板备用。以其基因组为模板，用LAtaq聚合酶进行扩增，

PCR的扩增反应在50μL的体系中进行，反应体系如下：模板DNA 1μL，2×高保真DNA酶预混液，购自宝生物(大连)有限公司25μL，上游引物1μL，下游引物1μL，ddH₂O 22μL。

扩增条件为：94℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃10sec，55℃15sec，72℃10sec。35个循环后，72℃延伸10min。扩增的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增两个片段大小分别为3420bp和3847bp，与预期大小相当。

TOP10电转化感受态细胞制作流程如下：

挑取单菌落大肠杆菌TOP10接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。取400μL母液加入到100ml装有LB培养基的三角瓶中，37℃、180r/min振荡培养至OD600＝0.8-1，冰浴30min，4℃，4500r/min离心10min收集菌体，沉淀用冰浴预冷的超纯水洗两遍，最后一步用预冷的10％甘油洗一遍，最终用60μL预冷的10％甘油重悬备用。

产生肺炎链球菌荚膜多糖的鼠伤寒沙门氏菌突变体的构建

将构建好的表达质粒转化至鼠伤寒沙门氏菌突变体菌株中(该突变体缺失了asd基因，需要DAP才能够生长，表达质粒中能够互补表达DAP，从而利于突变体的筛选)，利用电转化的方法将表达质粒转化入突变体内，在普通LB平板上长出的即为阳性菌落，并挑取单菌落进行PCR鉴定。本实施例突变株鉴定构建成功，如说明书附图图3所示。

实施例2

LPS图谱鉴定：对于实施例1的突变株，过夜培养5ml PCR鉴定为阳性的包含有表达质粒的鼠伤寒沙门氏菌菌株，离心收集菌体，取200μl缓冲液A(组份为：0.5M Tris-Cl pH 6.8,10％glycerol,10％SDS以及5％Beta-mercaptoethanol)重悬菌体，样品充分混匀后在沸水中煮10分钟，待样品冷却后离心15分钟以除去未溶解的杂质，离心完成后，将上清按照1:10(10μl加至90μl)的比例加入缓冲液B(组份为：0.5M Tris-Cl pH 6.8,10％glycerol,0.05％Bromophenol blue)中，并加入1μl浓度为20mg/ml的蛋白酶K。充分混匀后将样品放置于37℃。一小时过后，将样品取15μl在15％浓度的SDS-PAGE胶进行电泳，待胶跑完后，将胶进行银氨染色，若表达肺炎链球菌荚膜多糖，则能够看到有条带，如说明书附图图4所示。若不表达，由于鼠伤寒沙门氏菌本身缺失了O抗原，则表现为rough型。

染色步骤简要如下：

1)固定：将胶放入固定液中固定过夜，之后用超纯水漂洗三次，每次10min；

2)敏化：向染色盘中加入敏化液，轻摇10min，之后用超纯水洗三次，每次10min；

3)上银：向染色盘中加入银染液，轻摇10min，之后用超纯水洗三次，每次10min；

4)显色：向染色盘中加入显色液，轻轻振荡，待显出条带后，立即换超纯水，将胶漂洗至不变色为止，进行照相保存分析。

实施例3

免疫印迹(Western blot)鉴定：将处理好的脂多糖样品通过SDS-PAGE胶分离，待电泳完成后，将LPS条带通过转印仪转印至硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)上。待转膜完成，用含有5％脱脂牛奶的Tris缓冲液封闭2小时，随即加入特异性针对肺炎链球菌6A血清型荚膜多糖的兔抗血清(1：100稀释)放置于室温孵育2小时。孵育完成后，用碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG二抗以1：10000倍稀释进行孵育，两小时后用TBS缓冲液洗三遍。免疫印记条带通过加入BCIP显色液进行显色。反应终止则通过将膜放入超纯水中清洗，则终止反应。其中未转入质粒的鼠伤寒沙门氏菌为阴性对照。若有条带，则说明产生的多糖则是特异性针对肺炎链球菌荚膜多糖的多糖，如说明书附图图5所示。