利用纤维素内切酶和β‑葡糖苷酶构建食品安全级载体及筛选培养基的制作方法

文档序号：11936787阅读：419来源：国知局

导航： X技术> 最新专利>有机化合物处理,合成应用技术

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及利用纤维素内切酶和β-葡糖苷酶构建食品安全级载体及筛选培养基。

背景技术：

现在大多数的载体都是利用抗生素的抗性作为载体的筛选标记，抗生素对人类食品安全的危害是很多的，因此利用抗生素作为筛选标记的载体其应用就有很多局限性。

作为筛选标记必须具有以下特点：能够轻易区分转化子和非转化子；能够让目的基因片段或目的单元整合在基因组中，或稳定在宿主菌中存在。在构建基因工程菌中，对于整合型质粒有更多的偏爱，整合型质粒不会轻易环出，相对而言具有更好的稳定性。

技术实现要素：

本发明的目的在于在于提供一种食品安全级载体及其构建方法与筛选培养基。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种食品安全级载体，以纤维素内切酶、β-葡糖苷酶为筛选标记，含有纤维素内切酶编码基因、β-葡糖苷酶编码基因，能表达纤维素内切酶和β-葡糖苷酶。优选的，所述的纤维素内切酶编码基因、β-葡糖苷酶编码基因来源于黑曲霉。

所述的纤维素内切酶编码基因的序列优选如SEQ ID NO.1所示。

所述的β-葡糖苷酶编码基因的序列优选如SEQ ID NO.2所示。

所述的食品安全级载体的构建方法，包括如下步骤：将纤维素内切酶编码基因、β-葡糖苷酶编码基因克隆到载体上，使载体能够表达纤维素内切酶和β-葡糖苷酶。

优选的，所述的食品安全级载体的构建方法包括如下步骤：将SEQ ID NO.3所示序列、SEQ ID NO.4所示序列通过限制性内切酶及DNA连接酶构建到pPIC9K载体上；其中限制性内切酶为SnaBI、EcoR I和AvrII、NotI，SnaBI、EcoR I对应酶切SEQ ID NO.3所示序列，AvrII、NotI对应酶切SEQ ID NO.4所示序列。

所述的食品安全级载体的筛选培养基，包含羟甲基纤维素钠和栀子蓝。该培养基没有微生物可直接利用的碳源，只有载体上的纤维素内切酶和β-葡糖苷酶同时表达后，才能把羟甲基纤维素钠转化成葡萄糖，使微生物生长增值。同时β-葡糖苷酶把栀子蓝转化成栀子红，从而使菌落周围呈现淡淡红色。基于此，纤维素内切酶编码基因和β-葡糖苷酶编码基因组合可用于构建食品安全级载体。

优选的，所述的筛选培养基的配方为：羟甲基纤维素钠10g/L，栀子蓝1.5g/L，NH₄NO₃1.0g/L，NaCl 2g/L，YGM003A酵母细胞全合成培养基YGM003A-1 1.5g/L，琼脂20g/L。

本发明利用纤维素内切酶和β-葡糖苷酶作为筛选标记酶，同时利用特殊设计的筛选培养基平板，能够快速准确的筛选出转化子。由于筛选标记不为抗生素，因而为食品安全级的载体。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

1、材料

限制性内切酶购自Takara；质粒提取试剂盒（B518188）、DNA连接酶、卡那霉素购自上海生物工程股份有限公司；含有质粒pPIC9K的大肠杆菌DH5α保藏于实验室。人工合成的分别如SEQ ID NO.3、4所示的合成序列1、合成序列2。

2、质粒pPIC9K的提取

含有表达质粒pPIC9K的大肠杆菌DH5α，在LB培养基中（添加10μg/mL卡那霉素）培养12h，培养温度为30℃，用质粒提取试剂盒（B518188）提取质粒。提取步骤如下：

（1）取0.5mL菌液，10000rpm离心3min收集菌体，倒尽或吸干培养基。

（2）在菌体沉淀中加入700μL Lysis Buffer UF，吸打或振荡至彻底悬浮菌体，室温放置3min。

（3）将裂解液全部小心移入吸附柱，室温放置1min，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

（4）向吸附柱中加入500μL Prewash Solution，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

（5）向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

（6）重复向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm 离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

（7）将吸附柱和收集管放入离心机，8000rpm离心2min。

（8）将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入50μL Elution Buffer，室温静置2min，8000 rpm离心2min。将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存。

3、质粒pPIC9K和SEQ ID NO.3所示合成序列1的酶切

往25µL提取的质粒pPIC9K中加入SnaBI和EcoR I酶各0.2µL，加入酶切缓冲液及双蒸水24.6µL，在30℃保温60min，加入5µL Loading Buffer，60℃保温10min，得到质粒pPIC9K酶切液。

合成序列1用双蒸水稀释10倍，取25µL，加入SnaBI和EcoR I酶各0.2µL，加入酶切缓冲液及双蒸水24.6µL，在30℃保温60min，加入5µL Loading Buffer，60℃保温10min，得到序列1酶切液。

4、酶切液电泳

（1）电泳试剂配制

1）5×TBE（tris-硼酸及EDTA）缓冲液的配制（1000mL）：Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA 20mL，将pH调到8.0，定容至1000mL。4℃冰箱保存，用时稀释5倍。

2）加样缓冲液的配制：0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。

3）溴化乙锭的配制：称取0.1g溴化乙锭，溶于10mL水，配成终浓度为10mg/mL的母液，4℃冰箱保存。染色时，吸取12.5μL的母液，加入250mL的水中，使其终浓度为0.5μg/mL，混合均匀。

4）100×TE缓冲液的配制：1mol/L Tris-HCl（pH8.0），100mmol/L EDTA。称取Tris 121.1g，EDTA-Na 237.23g，先用800mL双蒸水，加热搅拌溶解后，再用盐酸调pH至8.0（大约加入盐酸20mL），然后定容至1000mL。

5）100×电泳缓冲液的配制：4mol/L Tris-HCl（pH8.0），2mol/L醋酸钠，200mmol/L EDTA。称取Tris 242.2g，无水乙酸钠82.03g，EDTA-Na 237.23g，先用400mL双蒸水加热搅拌溶解后，再用冰乙酸调pH至8.0（大约加入冰乙酸50mL），然后定容至500mL。用时稀释100倍。

（2）电泳方法

1）安装电泳槽：将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。

2）1%琼脂糖凝胶的制备：称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化，取出摇匀。

3）灌胶：将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。

4）待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。

5）加样：将DNA样品与加样缓冲液按体积比4:1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加20μL，记录样品的点样次序和加样量。

6）电泳：安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。

7）染色和观察：取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带。

5、酶切片段的回收和纯化

使用Takara的胶回收试剂盒回收纯化酶切的DNA片段。在紫外灯下切出含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。

称量胶块重量，计算胶块体积。向胶块中加入胶块溶解液Buffer GM，Buffer GM的加量3凝胶体积。均匀混合后室温25℃溶解胶块10min。当凝胶完全溶解后，加入3M醋酸钠溶液（pH5.2）10μL，均匀混合至溶液恢复黄色。将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。0.2mL胶溶解液转移至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液。将700μL的Buffer WB加入Spin Column中，室温12000rpm离心30秒钟，弃滤液。再次将700μL的Buffer WB加入Spin Column中，室温12000rpm离心30秒钟，弃滤液。将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12000rpm离心1min。将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μL灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。室温12000rpm离心1min洗脱DNA。

6、酶切的pPIC9K质粒与合成序列1的连接与转化

连接体系为：酶切回收的合成序列1 7µL，酶切回收的pPIC9K质粒1µL，T4 DNA ligase 1µL，Buffer 1µL。4℃连接24小时。

取一管-80℃保存的大肠杆菌DH5α（不含质粒）感受态细胞50μL，置冰上融化，加入5μL上述连接产物，轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min；将离心管置于42℃热击60-90秒，然后迅速置冰浴3分钟。向离心管中加入500μL液体LB培养基，混匀后置于37℃摇床振荡培养45分钟（150转/分钟）；目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。吸取100μL培养液加到含卡那霉素5mg/L的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16小时。挑选单菌落，保藏得到转化子，得到含pPIC9K-1载体的大肠杆菌DH5α。

7、质粒提取和酶切

按照上述步骤将重组质粒pPIC9K-1、合成序列2进行酶切、连接、转化、鉴定，其中重组质粒pPIC9K-1、合成序列2的酶切所用内切酶为AvrII和NotI，最后得到重组质粒pPIC9K-1-2。

8、质粒pPIC9K-1-2转化酵母菌

（1）酵母菌感受态制备

1）从平板上或保种管中，挑少许酵母SMD1168，在YPDA平板（YPDA培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母浸膏10g/L，琼脂20g/L（固体），腺嘌呤15mL/L 0.2%腺嘌呤，调节pH=7.5，121℃灭菌15min）上划单克隆，30℃培养3天左右。

2）从平板上分别挑取单克隆（直径2-3mm）到含有3mL YPDA的玻璃试管中（平行做3管）。

3）30℃、50rpm培养8-12h。取200µL菌液，测OD₆₀₀。选取OD₆₀₀值最大的一个试管（即活力最高的一个），吸取5µL转移至50mL新鲜的YPDA培养基中（培养基装在250mL三角瓶中）。

4）30℃、230rpm培养16-20h，直至OD₆₀₀=0.15-0.3。

5）将培养好的菌液转入2个50mL离心管，室温3000g离心3min，弃上清，用100mL新鲜的YPDA悬起管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。30℃、230rpm培养直到OD₆₀₀=0.4-0.5（3-5小时）。

6）将菌液倒入2个50mL离心管，室温3000g离心3min，弃上清，每个离心管用30mL milipore水重悬。

7）再次3000g离心3min，弃上清，每管用1.4mL 1.1×TE/LiAc重悬。

8）将重悬的菌液转移到2个EP管中，12000rpm离心15s。

9）弃上清，每管用600µL 1.1×TE/LiAc重悬，将两管重悬菌液并入一管，得到酵母感受态细胞。

（2）转化

质粒用SacI线性化，往25µL pPIC9K-1-2中加入限制性内切酶SacI酶0.2µL，加入酶切缓冲液及双蒸水24.8µL，在30℃保温60min，加入5µL Loading Buffer，60℃保温10min，得到酶切液。pPIC9K-1-2酶切液通过电泳回收纯化得到线性化的pPIC9K-1-2质粒。

往离心管中加入线性化的pPIC9K-1-2质粒10µL，鲑鱼精DNA（变性的，10mg/mL）5µL，加入酵母感受态细胞50µL，轻弹混匀；加入500µL PEG/LiAc轻弹混匀。30℃水浴30min，每10-15min轻弹混匀；加入20µL DMSO，轻弹混匀；42℃水浴15min，每5-10min轻弹混匀；12000rpm离心0.5min，弃上清；用1mL液体PDA培养基重悬；30℃、200rpm培养90min；12000r/m离心0.5min，弃上清；加入双蒸水1mL，重悬后12000r/m离心10min，弃上清，加入双蒸水1mL，得到最终重悬液。

9、筛选培养基设计和筛选

筛选培养基：羟甲基纤维素钠10g/L，栀子蓝1.5g/L，NH₄NO₃1.0g/L，NaCl 2g/L，YGM003A 酵母细胞全合成培养基YGM003A-1（北京泛基诺科技有限公司）1.5g/L，琼脂20g/L，115℃灭菌20 min，倒平板。最终重悬液涂布于筛选平板，28℃培养48h，菌落周围有淡淡红色的为转化子。

因为在筛选培养基中，没有酵母菌可直接利用的碳源，只有质粒上的纤维素内切酶和β-葡糖苷酶同时表达后，才能把羟甲基纤维素钠转化成葡萄糖，使酵母菌生长增值。同时β-葡糖苷酶把栀子蓝转化成栀子红，从而使菌落周围呈现淡淡红色。

对照实验：将含有质粒pPIC9K或不含质粒的酵母菌稀释涂布筛选培养基平板进行培养，没有菌落生长。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北工业大学

<120> 利用纤维素内切酶和β-葡糖苷酶构建食品安全级载体及筛选培养基

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 720

<212> DNA

<213> Aspergillus niger

<400> 1

atgaagttgc cagtttcttt ggctatgttg gctgctaccg ctatgggtca aaccatgtgt 60

tctcaatacg actctgcttc ttctccacca tactctgtta accaaaactt gtggggtgaa 120

taccaaggta ccggttctca atgtgtttac gttgacaagt tgtcttcttc tggtgcttct 180

tggcacaccg aatggacctg gtctggtggt gaaggtaccg ttaagtctta ctctaactct 240

ggtgttacct tcaacaagaa gttggtttct gacgtttctt ctatcccaac ctctgttgaa 300

tggaagcaag acaacaccaa cgttaacgct gacgttgctt acgacttgtt caccgctgct 360

aacgttgacc acgctacctc ttctggtgac tacgaattga tgatctggtt ggctagatac 420

ggtaacatcc aaccaatcgg taagcaaatc gctaccgcta ccgttggtgg taagtcttgg 480

gaagtttggt acggttctac cacccaagct ggtgctgaac aaagaaccta ctctttcgtt 540

tctgaatctc caatcaactc ttactctggt gacatcaacg ctttcttctc ttacttgacc 600

caaaaccaag gtttcccagc ttcttctcaa tacttgatca acttgcaatt cggtaccgaa 660

gctttcaccg gtggtccagc taccttcacc gttgacaact ggaccgcttc tgttaactag 720

<210> 2

<211> 2583

<212> DNA

<213> Aspergillus niger

<400> 2

atgagattca ccttgatcga agctgttgct ttgaccgctg tttctttggc ttctgctgac 60

gaattggctt actctccacc atactaccca tctccatggg ctaacggtca aggtgactgg 120

gctgaagctt accaaagagc tgttgacatc gtttctcaaa tgaccttggc tgaaaaggtt 180

aacttgacca ccggtaccgg ttgggaattg gaattgtgtg ttggtcaaac cggtggtgtt 240

ccaagattgg gtgttccagg tatgtgtgct caagactctc cattgggtgt tagagactct 300

gactacaact ctgctttccc agctggtgtt aacgttgctg ctacctggga caagaacttg 360

gcttacttga gaggtcaagc tatgggtcaa gacttctctg acaagggtgc tgacatccaa 420

ttgggtccag ctgctggtcc attgggtaga tctccagacg gtggtagaaa ctgggaaggt 480

ttctctccag acccagcttt gtctggtgtt ttgttcgctg aaaccatcaa gggtatccaa 540

gacgctggtg ttgttgctac cgctaagcac tacatcgctt acgaacaaga acacttcaga 600

caagctccag aagctcaagg ttacggtttc aacatcaccg aatctggttc tgctaacttg 660

gacgacaaga ccatgcacga attgtacttg tggccattcg ctgacgctat cagagctggt 720

gctggtgctg ttatgtgttc ttacaaccaa atcaacaact cttacggttg tcaaaactct 780

tacaccttga acaagttgtt gaaggctgaa ttgggtttcc aaggtttcgt tatgtctgac 840

tgggctgctc accacgctgg tgtttctggt gctttggctg gtttggacat gtctatgcca 900

ggtgacgttg actacgactc tggtacctct tactggggta ccaacttgac catctctgtt 960

ttgaacggta ccgttccaca atggagagtt gacgacatgg ctgttagaat catggctgct 1020

tactacaagg ttggtagaga cagattgtgg accccaccaa acttctcttc ttggaccaga 1080

gacgaatacg gtttcaagta ctactacgtt tctggtggtc catacgaaaa ggttaaccaa 1140

ttcgttaacg ttcaaagaaa ccactctgaa ttgatcagaa gaatcggtgc tgactctacc 1200

gttttgttga agaacgacgg tgctttgcca ttgaccggta aggaaagatt ggttgctttg 1260

atcggtgaag acgctggttc taacccatac ggtgctaacg gttgttctga cagaggttgt 1320

gacaacggta ccttggctat gggttggggt tctggtaccg ctaacttccc atacttggtt 1380

accccagaac aagctatctc taacgaagtt ttgaagaaca agaacggtgt tttcaccgct 1440

accgacaact gggctatcga ccaaatcgaa gctttggcta agaccgcttc tgtttctttg 1500

gttttcgtta acgctgactc tggtgaaggt tacatcaacg ttgacggtaa cttgggtgac 1560

agaagaaact tgaccttgtg gagaaacggt gacaacgtta tcaaggctgc tgcttctaac 1620

tgtaacaaca ccatcgttat catccactct gttggtccag ttttggttaa cgaatggtac 1680

gacaacccaa acgttaccgc tatcttgtgg ggtggtttgc caggtcaaga atctggtaac 1740

tctttggctg acgttttgta cggtagagtt aacccaggtg ctaagtctcc attcacctgg 1800

ggtaagacca gagaagctta ccaagactac ttgtacaccg aaccaaacaa cggtaacggt 1860

gctccacaag aagacttcgt tgaaggtgtt ttcatcgact acagaggttt cgacaagaga 1920

aacgaaaccc caatctacga cttcggttac ggtttgtctt acaccacctt caactactct 1980

aacttgcaag ttgaagtttt gtctgctcca gcttacgaac cagcttctgg tgaaaccgaa 2040

gctgctccaa ccttcggtga agttggtaac gcttctgact acttgtaccc agacggtttg 2100

caaagaatca ccaagttcat ctacccatgg ttgaactcta ccgacttgga agcttcttct 2160

ggtgacgctt cttacggtca agacgcttct gactacttgc cagaaggtgc taccgacggt 2220

tctgctcaac caatcttgcc agctggtggt ggtgctggtg gtaacccaag attgtacgac 2280

gaattgatca gagttaccgt taccatcaag aacaccggta aggttgctgg tgacaaggtt 2340

ccacaattgt acgtttcttt gggtggtcca aacgaaccaa agatcgtttt gagacaattc 2400

gaaagaatca ccttgcaacc atctgaagaa acccaatggt ctaccacctt gaccagaaga 2460

gacttggcta actggaacgt tgaaacccaa gactgggaaa tcacctctta cccaaagatg 2520

gttttcgttg gttcttcttc tagaaagttg ccattgagag cttctttgcc aaccgttcac 2580

taa 2583

<210> 3

<211> 1292

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成序列1

<400> 3

cctacgtagt tcgatcaaca acccgaatcc tatcgtaatg atgttttgcc cgatcagcct 60

caatcgacaa ttttacgcgt ttcgatcgaa gcagggatga caattggctg ggaacggtat 120

actggaataa atggtcttcg ttatggtatt gatgtttttg gtgcatcggc cccggcgaat 180

gatctatatg ctcatttcgg cttgaccgca gtcggcatca cgaacaaggt gttggccgcg 240

atcgccggta agtcggcacg ttaaaaaata gctatggaat atagtagcta ctaataagtt 300

aggagaataa actggatcca aacgatgaga tttccttcaa tttttactgc agttttattc 360

gcagcatcct ccgcattagc tgctccagtc aacactacaa cagaagatga aacggcacaa 420

attccggctg aagctgtcat cggttactca gatttagaag gggatttcga tgttgctgtt 480

ttgccatttt ccaacagcac aaataacggg ttattgttta taaatactac tattgccagc 540

attgctgcta aagaagaagg ggtaatgaag ttgccagttt ctttggctat gttggctgct 600

accgctatgg gtcaaaccat gtgttctcaa tacgactctg cttcttctcc accatactct 660

gttaaccaaa acttgtgggg tgaataccaa ggtaccggtt ctcaatgtgt ttacgttgac 720

aagttgtctt cttctggtgc ttcttggcac accgaatgga cctggtctgg tggtgaaggt 780

accgttaagt cttactctaa ctctggtgtt accttcaaca agaagttggt ttctgacgtt 840

tcttctatcc caacctctgt tgaatggaag caagacaaca ccaacgttaa cgctgacgtt 900

gcttacgact tgttcaccgc tgctaacgtt gaccacgcta cctcttctgg tgactacgaa 960

ttgatgatct ggttggctag atacggtaac atccaaccaa tcggtaagca aatcgctacc 1020

gctaccgttg gtggtaagtc ttgggaagtt tggtacggtt ctaccaccca agctggtgct 1080

gaacaaagaa cctactcttt cgtttctgaa tctccaatca actcttactc tggtgacatc 1140

aacgctttct tctcttactt gacccaaaac caaggtttcc cagcttcttc tcaatacttg 1200

atcaacttgc aattcggtac cgaagctttc accggtggtc cagctacctt caccgttgac 1260

aactggaccg cttctgttaa ctaggaattc gg 1292

<210> 4

<211> 3624

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成序列2

<400> 4

ggcctagggt tcgatcaaca acccgaatcc tatcgtaatg atgttttgcc cgatcagcct 60