与水稻粒长相关的蛋白SbGL及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及与水稻粒长相关的蛋白SbGL及其编码基因与应用。

背景技术：

水稻是人类赖以生存的主要粮食作物之一，全球约有一半的人口以稻米为主食。世界稻米的供求矛盾越来越突出，提高产量是当今水稻育种的首要目标。粒重、每穗粒数和每株穗数是决定水稻产量的三个组成部分，其中粒重又由粒长、粒宽和粒厚度决定。粒长不仅作为重要的产量性状成为育种目标，它还影响稻谷整精米率、烹煮特性和适口性等品质和外观，成为品质育种中的主要选择指标之一。相对于水稻其它产量性状而言，目前关于粒长基因的研究稍显滞后，真正分离到的粒长基因还很少。在禾本科材料中克隆与粒长相关的优良基因，对培育高产、优质水稻新品种具有重要的理论与实际意义。

技术实现要素：

SbGL基因(GenBank登陆号XM_002453222.1)是高粱中功能未知基因，定位于高粱第4号染色体上，mRNA大小为846bp，不存在内含子，编码包含281个氨基酸残基的蛋白(GenBank登陆号XP_002453267.1)，蛋白质分子量为29.09KD，等电点为8.02。在该蛋白质序列中，带电荷氨基酸70个，酸性氨基酸26个，碱性氨基酸27个，极性氨基酸67个，疏水氨基酸98个。Gnebank数据库比对分析发现，SbGL蛋白质序列具有推定的DUF1645保守结构域，与小米(XP_004951972.1)、玉米(NP_001145342.1)和玉米(XP_008680000.1)蛋白序列的同源性分别达到58％、60％和59％。SbGL蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示，SbGL蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.3所示。本发明构建出蛋白SbGL的表达载体，其序列如SEQ ID NO.1所示，命名为载体pCAMBIA1300+163+SbGL，将其转化到水稻中表达，发现过量表达高粱SbGL基因可引起水稻种子极显著增长增重。与野生型相比，转基因水稻粒长增长10.22％，千粒重增重14.48％。因此，蛋白SbGL编码基因可用于制备与水稻粒长相关的表达载体。蛋白SbGL可用于制备水稻粒长调控制剂。

附图说明

图1高粱SbGL基因的PCR扩增产物；M，Marker；1，PCR产物；

图2 SbGL的pMD18-T质粒酶切分析；M，Marker；1、2分别代表不同质粒酶切产物；

图3表达载体pCAMBIA1300+163的结构示意图；

图4表达载体pCAMBIA1300+163+SbGL酶切鉴定；M，Marker；1、2分别代表不同质粒酶切产物；

图5农杆菌介导水稻遗传转化；A，水稻幼胚愈伤组织的诱导；B，成熟胚愈伤组织的诱导；C，继代；D，抗性愈伤筛选；E，愈伤分化；F，生根培养；

图6跨终止子引物鉴定转SbGL基因株系；M，DNA分子量标准；1，无模板对照；2、3，野生型对照；4、5，阳性对照；6-24，转基因植株；

图7实时定量PCR分析SbGL基因在转基因株系及野生型水稻中的表达水平；WT，野生型水稻；L-2，L-4，L-5，L-6，L-7，L-11，L-17，L-19，L-59，L-62和L-63分别代表不同的转基因株系；

图8野生型与转SbGL基因植株表型特征比较；WT，水稻野生型；L-2、L-7和L-63，转基因株系；

图9野生型与转SbGL基因植株种子表型特征比较；WT，水稻野生型；L-2、L-7和L-63，转基因株系；Student’s t test。

具体实施方式

基因克隆

PCR克隆引物，PCR等反应实验条件，克隆载体，来源及可能用到的內切酶，cDNA阳性克隆分析

人工合成一对引物，并在其5’端分别加上NcoI和BamHI酶切位点。引物如下：

SbGLF：5'CCATGG CCATGTCCGCAATGGCAAC 3'(25)(NcoI)(SEQ ID NO.4)；

SbGLR：5'GGATCC TTGGAATGCACGGCGAAAA3'(25)(BamHI)(SEQ ID NO.5)。

利用此对引物，以高粱的总DNA为模板进行PCR。PCR条件为：热盖温度105℃，预变性95℃5min，95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸2min，进行34个循环，72℃延伸10min。PCR体系见表1：

表1

使用TAE电泳缓冲液进行琼脂糖凝胶电泳，得到了大约1000bp的片段(图1)，命名为SbGL。

将上述SbGL扩增产物用TIANGEN的试剂盒进行胶回收，然后将回收片段连入PMD18-T载体(TAKARA)。连接体系如表2：

表2

连接2个小时，转化E.coli DH5α的感受态细胞，涂板，用氨苄霉素筛选。挑选单克隆，提取质粒后用NcoI和BamHI双酶切鉴定，结果如图所示，均有约1000bp的目的条带(图2)。送1、2号对应的菌液测序，测序结果均与GenBank上基因序列完全一致。

基因功能验证详细过程

表达原载体及来源，表达原载体构建可能用到的內切酶

克隆得到SbGL基因，将其构建到表达载体，具体步骤如下：将连接有SbGL基因的克隆载体pMD18-T和表达载体pCAMBIA1300+163(图3)都用BamHI和NcoI进行双酶切并分别回收纯化，然后用T4连接酶连接后转化E.coli DH5α，挑取单菌落扩大培养后抽提质粒，BamHI和NcoI双酶切鉴定，最终获得连接有目的基因的过量表达载体pCAMBIA1300+163+SbGL(图4)。利用热激法将构建的表达载体转化到农杆菌EHA105菌株中。

基因转化方法，基因转化物种

采用农杆菌介导法将构建的表达载体转化到水稻SR59中，获得过量表达SbGL基因的水稻转基因株系。该实验过程如下：以SR59成熟种子诱导而来的愈伤组织为受体，经过农杆菌浸染、共培养、2次抗性愈伤组织潮霉素连续筛选(每次2周)、抗性愈伤组织分化、生根、炼苗等步骤获得潮霉素抗性植株(图5)。

转基因植物分子分析

通过跨目的基因与终止子的特异引物，对潮霉素抗性再生植株进行PCR检测(图6)。检测出转SbGL基因的阳性株系20株。引物如下：

SbtermF：5'GCATACCCGCTCTTTGAC 3'(SEQ ID NO.6)；

SbtermR：5'AACCCTGCCTTAGCATCTT 3'(SEQ ID NO.7)。

从20个转基因株系中随机选取11个株系及野生型对照(WT)，利用qRT-PCR技术检测SbGL在各转基因株系中的表达水平(图7)。SbGL在野生型中没有表达，在转基因株系中都有过量表达，不同转基因株系中表达量不同。qRT-PCR引物如下：

SbGLRTF：5'ACAGGCTCTTCTACGGCAAG 3'(SEQ ID NO.8)；

SbGLRTR：5'GCGGTAGGGTAGGTACGACT 3'(SEQ ID NO.9)；

OsActinF：5'ACCCAAGAATGCTAAGCCAAGAG 3'(SEQ ID NO.10)；

OsActinR：5'ACTTTGTCCACGCTAATGAAGAAAC 3'(SEQ ID NO.11)。

转基因植物功能表型(图8、图9)

对野生型和T1代转SbGL基因水稻的农艺性状进行统计分析，其中转基因水稻选择L-2、L-7和L-63三个株系作为统计对象。与野生型的株高相比，L-2株系低于野生型，差异极显著；L-7株系与野生型无显著性差异；L-63株系高于野生型，差异显著。与野生型的分蘖数相比，三个株系无显著性差异。与野生型的每穗粒数相比，三个株系无显著性差异。与野生型的穗长相比，L-2株系较长，差异极显著，L-7株系无显著性差异，L-63株系较长，差异极显著。

与野生型的粒长相比，三个株系均极显著增长。L-2株系增长10.35％，L-7株系增长10.35％，L-63株系增长10.22％。与野生型的粒宽相比，L-2和L-7株系极显著变窄，L-63株系无差异。与野生型的长宽比相比，三个株系均极显著变大。与野生型的千粒重相比，三个株系均极显著增重。L-2株系增重4.68％，L-7株系增重5.68％，L-63株系增重14.48％。