一株具有镍耐受性的酿酒酵母组蛋白定点突变菌株及其应用的制作方法

本发明属于环境治理领域，涉及一株酿酒酵母组蛋白定点突变菌株及其应用，具体是指酿酒酵母组蛋白定点突变菌株及其在治理环境中镍离子超标方面的应用。

背景技术：

镍是机体必需的微量元素，在生活中和工业上都有广泛应用，长期过量接触镍化合物会对机体造成功能损伤以及器质性损伤。工业上常见的镍化合物有氯化镍、硫酸镍、羰基镍等，研究表明镍离子及其化合物具有强烈的致癌效应。镍化合物被细胞溶解酸化后，主要通过简单扩散、与ca²⁺协同转运、二价阳离子载体(dmt-1)运输等三种途径穿过细胞膜，在细胞中积累，对细胞造成氧化损伤。

酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)作为模式生物，广泛用于重金属污染方面的研究。为了充分阐明真核生物响应镍离子胁迫的机制，我们利用酿酒酵母组蛋白定点突变菌体库，筛选出了一株镍耐受性组蛋白乙酰化定点突变菌株，为防治环境镍离子超标问题提供有效的解决方案。

技术实现要素：

为了有效治理环境中镍离子超标问题，本发明提供了一株镍耐受性酿酒酵母组蛋白定点突变菌株h4k5r及其在治理环境中镍离子超标方面的应用。

本发明提供了一株酿酒酵母菌株，其中所述菌株分类命名为saccharomycescerevisiae，所述酿酒酵母菌株为组蛋白定点突变菌株h4k5r，所述菌株的野生型菌株为by4741，所述菌株中组蛋白h4第五位赖氨酸突变为精氨酸(k→r)，对应突变的基因序列如seqidno.1所示。

本发明提供的酿酒酵母菌株是通过对从fisherthermoscientific(catalogno.ysc5106)公司购买的酿酒酵母h3/h4组蛋白定点突变菌体库进行筛选获得的，所述筛选方法为：确定镍胁迫条件下野生型菌株by4741的ec50值；采用倍比稀释表型分析法在添加5mm氯化镍的ypd固体培养基上筛选镍耐受性组蛋白突变菌株，发现h4k5r具有镍耐受性。火焰原子吸收分光光度计测定所述菌株细胞内镍含量，发现h4k5r显著提高镍吸收量。

本发明的酿酒酵母菌株h4k5r显著提高镍吸收量，能够用于治理环境中镍离子超标方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供了一株具有镍耐受性的酿酒酵母菌株h4k5r，可有效去除环境中超标镍离子，还可利用基因工程技术将所述菌株改造成具有更高清除力的菌株，为治理环境中镍污染奠定基础。

附图说明

图1为酿酒酵母组蛋白定点突变菌株h4k5r和野生型菌株by4741在ypd培养基和添加了5mm镍离子的ypd培养基上的生长表型分析图。横向为两种菌株在同一个培养皿上通过倍比稀释后所形成的菌落情况，wt为by4741。

图2为不同浓度镍胁迫下，野生型酿酒酵母菌株by4741(a)与镍耐受性酿酒酵母组蛋白定点突变菌株h4k5r(b)的生长曲线图。图中的x坐标为镍离子的浓度，y坐标为od600吸光度值。

图3为5mm镍离子胁迫下,野生型酿酒酵母菌株by4741与酿酒酵母h4组蛋白定点突变菌株h4k5r胞内镍离子相对含量的检测图。图中x坐标为菌种名，y坐标为菌株胞内镍离子的相对含量。

具体实施方式

下面结合具体图例和方法对本发明作进一步阐明。

本发明提供的酿酒酵母菌株是通过对从fisherthermoscientific(catalogno.ysc5106)公司购买的酿酒酵母h3/h4组蛋白定点突变菌体库进行氯化镍的筛选获得的。

实施例1.采用倍比稀释表型分析法筛选镍耐受性菌株

ec50指半最大效应浓度(concentrationfor50％ofmaximaleffect,ec50)，是指能引起50％最大效应的浓度。

1、确定镍胁迫的ec50值：从-80℃冰箱中取出酿酒酵母野生型菌株by4741，采用平板划线法接种至ypd固体培养基上，置于30℃恒温培养箱中过夜培养。然后挑取平板上的单菌落，接种至ypd液体培养基中，置于摇床中30℃、200rpm/min过夜培养。将活化好的酿酒酵母野生型菌株by4741按照1:50的比例等量接入含有不同浓度镍离子的ypd液体培养基中，30℃、200rpm/min培养10h至对数生长期，每两小时测定一次od600吸光度值，通过寇氏法计算镍离子的ec50值。其中，所述ypd固体培养基成分为：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂；所述ypd液体培养基成分为：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。

2、倍比稀释表型分析法确定镍耐受性菌株：采用上述方法活化酿酒酵母h3/h4组蛋白定点突变菌株，并挑取酿酒酵母组蛋白定点突变菌株单菌落接种于ypd液体培养基中，培养至对数生长期。3500rpm/min离心3min收集细胞，用pbs(ph7.4)清洗两次并重悬细胞至终浓度为3×10⁶细胞/ml。采用倍比稀释即将细胞稀释成5个浓度梯度，分别为10⁴、10²、10⁰、10^-2、10^-4细胞/ml，分别从各浓度细胞中取3μl，点样至含有5mm镍离子的ypd固体培养基，在恒温培养箱中30℃倒置培养48h。记录观察菌株形态(图1)。

最终，确定了镍胁迫酿酒酵母野生型菌株by4741的ec50值为5mm，并发现一株镍耐受性酿酒酵母组蛋白突变菌株h4k5r。与野生型菌株by4741相比，突变菌株h4k5r的形态无改变。

实施例2.测定镍胁迫下菌株的生长曲线

1、活化菌株：挑取by4741与h4k5r单菌落接种于新鲜ypd液体培养基中，30℃、200rpm/min培养至对数生长期。

2、生长曲线测定：按照1:50的比例，将by4741与h4k5r等量接入含有终浓度为0、2.5、3.5、4.5、5.5、6.0、7.0、7.5mm镍离子的ypd固体培养基中，30℃、200rpm/min培养，用原子吸收分光光度计每2h测定一次od600吸光度值，采用origin6.0绘制生长曲线图。

由图2a可知，在自然生长状态下，酿酒酵母野生型菌株by4741长势更好，在2.5mm镍离子处理下，by4741生长没有受到影响，然而随着镍离子胁迫浓度的提高，by4741的生长受到显著抑制。从图2b可知，在镍离子浓度为2.5～5.5mm时，h4k5r生长显著升高，且明显优于野生型菌株by4741的生长状况；在6.0～7.5mm镍离子胁迫下，h4k5r生长也受到一定程度的抑制，但仍然优于野生型菌株by4741的生长状况。

实施例3.火焰原子吸收分光光度计法测定酿酒酵母组蛋白定点突变菌株胞内的镍离子含量

1、活化菌株：挑取by4741与h4k5r单菌落接种于新鲜ypd液体培养基中，30℃、200rpm/min培养至对数生长期。

2、测定胞内镍含量：将预活化的菌株接种于新鲜的ypd液体培养基，加入终浓度为5mm镍离子培养至对数生长期。3500rpm/min离心收集细胞，加入0.1％hno3处理30min，ddh2o洗涤两次，再加入0.02medta处理30min，ddh2o洗涤两次，将菌体置于烘箱中烘干至恒重。加入25％(w/v)hno3，100℃消解1h，定容至50ml。采用spectoraa220火焰原子吸收分光光度计测定酵母胞内ni²⁺的含量。

图3为火焰原子吸收分光光度计法测定结果，以野生型酿酒酵母菌株by4741为对照，并将其胞内镍离子含量定义为1，菌株h4k5r胞内镍离子含量约为by4741菌株的1.6倍，由此可知镍耐受性酿酒酵母组蛋白定点突变菌株h4k5r吸收镍的能力显著高于野生型酿酒酵母by4741。

序列表

<110>内蒙古科技大学

<120>一株具有镍耐受性的酿酒酵母组蛋白定点突变菌株及其应用

<130>lf170660i

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>312

<212>dna

<213>酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）

<400>1

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