一种利用ISSR反应体系分析草果遗传多样性的方法与流程

本发明属于分子生物学dna标记技术与应用领域，具体地说，涉及一种利用issr反应体系分析草果遗传多样性的方法。

背景技术：

草果(amomumtsaokocrevostetlemaire)是姜科豆蔻属植物中一种多年生草本植物，不仅是我国食品加工业和轻工业的重要原料，而且是一种传统的中药材，有燥湿、健胃、祛痰、温中、顺气、抗疟等功能，还是大众的调料食品，国际、国内市场需求量大。草果对生长环境条件要求较高，一般生长在海拔800～1500m的北热带和中、南亚热带中低山区，年降雨量在1200～1600mm，年平均气温在16～22℃，冬季多雾、湿度大、透光度在40％～50％的阴湿山坡沟谷森林环境下，主要分布在我国云南、广西和贵州三省局部地区，其中云南是草果主产区，产量约占全国的95％，主要分布在红河、文山、西双版纳、德宏、保山、思茅、临沧7个地(州)的31个县(市)。

分子标记是一种以dna序列差异性为标记的检测遗传多样性的方法，具有不受外界环境及基因表达与否的影响，不影响实验材料的性状、可标记数量大及分辨率高等特点，目前被广泛应用于生物遗传研究。issr(简单序列重复区间扩增多态性，intersimplesequencerepeat)分子标记技术是zietkeiwitcz等(zietkiewicze,rafalskia,labudad(1994)genomefingerprintingbysimplesequencerepeat(issr)-anchoredpolymerasechainreactionamplification.genomics20:176–183)于1994年发展起来的一种基于微卫星序列的分子标记。以其简便迅速、多态性高、重复性好等优点被广泛应用于动植物的品种鉴定、dna指纹图谱构建和种质资源多样性研究等领域，同时在中草药种内和种间鉴定等方面得到广泛运用。目前在姜科植物砂仁中有过利用issr标记分析不同产地砂仁遗传多样性的报道，但在草果中，应用issr分子标记技术进行种质资源鉴定、遗传多样性分析的方法尚未见报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种利用issr反应体系分析草果遗传多样性的方法，该方法是一种简单、易于操作的分子标记技术，可为草果资源鉴定、遗传多样性分析等科学研究提供很好的技术指导和理论支持。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种用于草果遗传多样性分析的issr分子标记引物体系，所述引物序列包括：

ubc807：其核苷酸序列如seqidno.1所示；

ubc809：其核苷酸序列如seqidno.2所示；

ubc835：其核苷酸序列如seqidno.3所示；

ubc836：其核苷酸序列如seqidno.4所示；

ubc841：其核苷酸序列如seqidno.5所示；

ubc842：其核苷酸序列如seqidno.6所示；

ubc847：其核苷酸序列如seqidno.7所示；

ubc862：其核苷酸序列如seqidno.8所示；

ubc873：其核苷酸序列如seqidno.9所示；

ubc885：其核苷酸序列如seqidno.10所示；

ubc888：其核苷酸序列如seqidno.11所示。

本发明还公开了一种用于草果遗传多样性分析的issr-pcr反应体系，每25μl的反应体系中含有不含mg²⁺的10×pcrbuffer3.0μl、taq酶1.5u、mg²⁺1.5mmol/l、dntp0.25mmol/l、引物0.3μmol/l和模板dna50ng；将上述反应混合液按如下程序进行扩增：95℃预变性5min，95℃变性1min，50-58℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

进一步地，所述引物选自上述seqidno.1～11中的任一条。

进一步地，所述退火温度根据所选择的引物来确定，具体如下：

seqidno.150℃

seqidno.252℃

seqidno.353℃

seqidno.453℃

seqidno.554℃

seqidno.654℃

seqidno.753℃

seqidno.858℃

seqidno.954℃

seqidno.1053℃

seqidno.1152℃。

本发明还公开了一种利用issr反应体系分析草果遗传多样性的方法，其步骤包括：

(1)dna的提取：采集嫩叶用于全基因组dna提取；

(2)采用issr-pcr反应体系对步骤(1)中提取的dna样品进行扩增；

(3)将pcr扩增产物在5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳结束后银染检测条带；

(4)利用issr分子标记引物体系将不同来源的草果进行聚类及主坐标分析；

(5)遗传多样性分析：计算草果实验材料遗传多样性参数。

进一步地，步骤(1)中的dna的提取具体为：采用2*ctab法提取dna，并将提取的dna样品溶于te缓冲液后存储于-20℃备用，扩增前用双蒸水将dna样品稀释成20ng/μl的工作液，作为pcr扩增反应的模板。

进一步地，步骤(2)中issr-pcr反应体系具体为：每25μl的反应体系中含有不含mg²⁺的10×pcrbuffer3.0μl、taq酶1.5u、mg²⁺1.5mmol/l、dntp0.25mmol/l、引物0.3μmol/l和模板dna50ng；将上述反应混合液按如下程序进行扩增：95℃预变性5min，95℃变性1min，50-58℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

进一步地，步骤(3)中将pcr扩增产物在5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳进行分离，电泳结束后银染检测条带。具体为：电泳结束后，将胶体从玻璃板上取下，蒸馏水漂洗，转入含有0.2％硝酸银的染色液中，振荡10min，蒸馏水漂洗1次约1min，转入含2％氢氧化钠和0.4％甲醛的显色液中，轻轻振荡待条带显色完全，将胶体转入蒸馏水中；在凝胶成像系统下对胶体进行拍照保存。

进一步地，步骤(4)中聚类分析和主坐标分析具体为：读取步骤(3)获得的谱带信息，将电泳图谱上100～2000bp范围内清晰且重复出现的条带记为1，同一位置没有条带记为0，由此生成0和1原始矩阵；统计每条引物扩增出的总条带数和多态性条带数；用ntsys-pc(2.10e)软件中simqual程序计算相似系数矩阵，以clustering程序中shan进行upgma聚类；用treeplot模块生成聚类图，构建分子进化树；根据计算的相似系数矩阵进行decenter数据转换，进而进行主坐标分析。

进一步地，步骤(5)中遗传多样性分析具体为：根据01二元数据矩阵，统计issr扩增产物的条带总数和多态性条带数(npb)，计算多态性条带所占的比率(ppb)和引物多态性信息含量(pic)，pici＝2fi(1－fi)，公式中pici表示第i个位点的多态性信息含量，fi表示有带所占的频率，(1－fi)表示无带所占的频率；对每条引物来说，pic＝∑pici/n，式中n表示每条引物的多态性条带数；对每条引物而言，标记指数(mi)按下述公式计算：mi＝npb*pic；釆用popgene32软件对所有试验材料进行遗传多样性参数计算：等位基因数、有效等位基因数、shannon's信息指数、基因多样性指数、多态位点比率。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明优化了草果基因组dna的issr反应条件；

2)采用5％的非变性聚丙烯酰胺凝胶对issr-pcr扩增产物进行分离，分辨率较琼脂糖凝胶更高；

3)利用优化的pcr反应体系，筛选出的11条issr引物在草果中pcr扩增反应稳定，扩增片段清晰，多态性高；

4)本发明可加快草果资源的鉴定速度，缩短实验时间，结果稳定可靠，弥补了传统形态学鉴定方法的不足；

5)本发明成本低，在短时间内可完成大批试验材料鉴定。

6)利用该技术能很好的揭示草果居群间的遗传多样性，分辨草果种质资源间的亲缘关系，对草果资源的保护及利用具有重要意义。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明ubc835引物扩增效果图，其中，m，2000bpmarker；1-25所对应原始编号及采样点见表1；其中1-25分别代表采自金平的j8、j48、j55、j59、j64、j84、j91、j103、j108、j109、j118、j119、j128和采自元阳的y3、y5、y9、y14、y18、y22、y32、y36、y44、y45、y47、y48；

图2是本发明基于issr标记的91份草果样品聚类图。

图3是本发明基于issr标记的91份草果样品主坐标分析。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1dna的提取

(1)实验材料

本试验所用的91份草果采自云南省8个草果居群，其中金平县13份、元阳县12份、绿春县11份、屏边县9份、澜沧县13份、保山市11份、梁河县12份、云县10份，具体见表1。

表1试验材料编号及采样点

(2)dna的提取

在种质资源调查同时采集嫩叶用于全基因组dna提取。采用2*ctab法提取dna，并将提取的dna样品溶于te缓冲液后存储于-20℃备用。扩增前用双蒸水将dna样品稀释成20ng/μl的工作液，作为pcr扩增反应的模板。

实施例2本发明issr-pcr反应体系及引物的筛选

(1)采用正交设计方法，对mg²⁺、dntps和引物浓度、taqdna聚合酶及模板dna用量等5个因素进行筛选，得到适于草果的issr标记pcr反应体系。issr-pcr的正交设计如表2。所选issr-pcr引物为ubc888，试验重复3次。经评分比较后，25μl反应体系中10×pcrbuffer(不含mg²⁺)3.0μl、taq酶1.5u、mg²⁺1.5mmol/l、dntp0.25mmol/l、引物0.3μmol/l(每条)和模板dna50ng综合扩增效果最好。

表2issr-pcr反应l16(4⁵)正交试验设计表

(2)上述反应体系的pcr扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

在试验确定最佳反应体系基础上，在梯度pcr仪上进行引物筛选及最佳退火温度确定，issr引物序列及最佳退火温度信息见表3。利用上述反应体系和反应程序共筛选出11条带型稳定、清晰且重复性好的多态性引物：ubc807、ubc809、ubc835、ubc836、ubc841、ubc842、ubc847、ubc862、ubc873、ubc885、ubc888。图1为ubc835对1-25号样品扩增效果图，表明本发明所建立的草果issr-pcr反应体系扩增出的条带更具有多态性高、特异性强、背景清楚及稳定性强的优点，适合草果遗传多样性分析。

表3筛选的issr引物序列

(3)电泳和银染体系

pcr扩增产物在5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。电泳结束后银染检测条带，具体操作如下：电泳结束后，将胶体从玻璃板上取下，蒸馏水漂洗，转入含有0.2％(质量百分浓度)硝酸银的染色液中，振荡10min，蒸馏水漂洗1次约1min，转入含2％氢氧化钠和0.4％甲醛(10gnaoh定容至500ml，使用前加入2ml甲醛)的显色液中，轻轻振荡待条带显色完全，将胶体转入蒸馏水中。在凝胶成像系统下对胶体进行拍照保存。

实施例3issr-pcr反应体系在91份草果品种遗传多样性分析中的应用

(1)聚类分析和主坐标分析

将电泳图谱上100～2000bp范围内清晰且可重复出现的条带记为1，同一位置没有条带记为0，由此生成0和1原始矩阵。统计每条引物扩增出的总条带数和多态性条带数。用ntsys-pc(2.10e)软件中simqual程序计算相似系数矩阵，以clustering程序中shan进行upgma(unweightedpair-groupmethodwitharithmeticmeans)聚类；用treeplot模块生成聚类图，构建分子进化树。根据计算的相似系数矩阵进行decenter数据转换，进而进行主坐标分析。

基于issr标记，利用ntsyspc2.10e软件对8个居群的91份草果进行聚类分析和主坐标分析。聚类分析中除j119和l49没能被成功聚类外，其余样本根据亲缘关系远近均被分到不同类群中，在阈值0.738处可将样本分为7类，yx1、y14、l44、l34、b4各为1类，l12、l50、ye和yx4聚在一起，剩余的80份样本聚在一起，d23和d25亲缘关系最近(图2)。

对91份草果样本的issr标记的原始矩阵进行主坐标分析，issr标记提取的前2个主坐标所能解释的遗传变异分别为7.12％和3.98％，二维排序图能够直观的表示91份样本之间的亲缘关系远近，保山和德宏在亲缘关系上最近，主坐标分析结果与聚类结果基本一致(图3)。

(2)遗传多样性分析

根据01二元数据矩阵，统计issr扩增产物的条带总数和多态性条带数(npb)，计算多态性条带所占的比率(ppb)和引物多态性信息含量(pic)，pici＝2fi(1－fi)，公式中pici表示第i个位点的多态性信息含量，fi表示有带所占的频率，(1－fi)表示无带所占的频率；对每条引物来说，pic＝∑pici/n，式中n表示每条引物的多态性条带数；对每条引物而言，标记指数(mi)可以按下述公式计算：mi＝npb*pic。假定所研究的草果居群都处于hardy-weinberg平衡，釆用popgene32软件对所有试验材料进行遗传多样性参数计算：等位基因数、有效等位基因数、shannon's信息指数、基因多样性指数、多态位点比率等。11条issr引物共扩增402个条带，其中多态性条带402条，占总条带的100％，平均每条引物扩增36.545条带；不同引物所揭示的pic(多态性信息含量)在0.232～0.301之间，平均为0.258；mi(标记指数)最高的是引物ubc842，为13.56，表明该引物在11条引物中的扩增效率最高；有效等位位点数ne、nei基因多样度及shannon's信息指数i最高的引物为ubc842，分别为1.302、0.208和0.347，最低的为ubc841，分别为1.186、0.145和0.264(表4)。issr引物扩增多态性表明云南草果遗传多样性较低。居群间比较分析表明遗传多样性由高到低依次为金平居群、澜沧居群、绿春居群、云县居群、元阳居群、屏边居群、德宏居群、保山居群。在物种水平上，多态性位点百分率p、观测等位基因数na、有效等位位点数ne、nei基因多样度h和shannon's信息指数i分别为100％、2.00、1.215、0.159、0.279(表5)。表明草果无论在居群水平还是物种水平遗传多样性都较低，亟需我们加大保护力度。

表411条issr引物扩增结果

注：tnp：扩增总条带数；npb：多态性条带数；ppb：多态性比率；na：观测等位基因数；ne：有效等位基因数；h：nei基因多样度；i：shannon's信息指数；pic：多态性信息含量；mi：标记指数。

表5草果居群issr遗传多样性分析

注：p：多态性位点百分率；na：观测等位基因数。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110>红河学院

<120>一种利用issr反应体系分析草果遗传多样性的方法

<130>2017

<160>11

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

agagagagagagagagt17

<210>2

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

agagagagagagagagg17

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

agagagagagagagagyc18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

agagagagagagagagya18

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gagagagagagagagayc18

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gagagagagagagagayg18

<210>7

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cacacacacacacacarc18

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

agcagcagcagcagcagc18

<210>9

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

gacagacagacagaca16

<210>10

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

bhbgagagagagagaga17

<210>11

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

bdbcacacacacacaca17